Name: Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin, fonksiyonel immünolojik analizler için insan doku ekstrelerinin BAW karışımı ile homojenizasyon ve liyofilizasyon yöntemiyle hazırlanmasını. Bu güvenli teknik, T hücre proliferasyonu ve sitokin salınımı yanıtlarını ölçmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC # 559007) ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF 4-2006-1025) ve Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapı Programı hibeleri ile desteklenmektedir. Biz insan dokuları sağlamak için Tom Mandel Islet Nakli Programı Islet İzolasyon Takımı üyelerine teşekkür ediyorum. İnsan dokularında yerel etik kurul onayı ile toplandı ve kullanıldı (St Vincent Hastanesi HREC-A 011/04 ve St Vincent Sağlık HREC-A 135/08).

1. Dalak Doku hazırlanması <ol><li> Not-tüm insan malzemesi potansiyel bulaşıcı ve bütün prosedürler Sınıf II Laminer Flow Kabin yapılmalıdır olarak tedavi edilmelidir. Steril makas ve forseps kullanarak, dalak bölümler (boyut olarak ~ 1-2 cm) yağ ve fibröz doku kaldırmak ve mümkün olduğunca dış kapsül malzemesinin kadar keserek. </li><li> Dalak dokusunun küçük bir parça (1-2 cm 3) kesin ve steril 50 ml Falcon tüp içine her parça yerleştirin. </li><li> Sıvı N 2 batırılarak doku parçaları Snap-dondur. </li><li> -80 ° C de saklayınız Benzer bir protokol diğer doku (lar) için uygundur. </li></ol> 2. Depolama için İnsan Islet hazırlanması <ol><li> CMRL medya Kültür adacık. 10 ml lik konik alt tüp içinde adacıklar toplayın ve 5 dakika için 1500 rpm&#39;de santrifüjleme ile PBS içinde iki kere yıkayın. PBS kapalı dökün ve bir kağıt havlu üzerinde kısaca ters tüp yerleştirerek kalan tampon boşaltın. Dikkatli olunadacıklar çıkarmak için. </li><li> -80 Sıvı azot ve mağaza kez süzülmüş, re-cap tüp ve ek dondurma ° C. </li></ol> 3. Özü Hazırlama <ol><li> 4 de BAW karışımı (10:30:60% v / v) ile depo ° C hazırlanması </li><li> -80 ° C&#39;den tüpü çıkarın Oda sıcaklığında çözülme. </li><li> Doku parçasını örtmek için yeterli bir buz-soğuk BAW ekleyin. Adacıklar 3-5 ml kullanın. Dalak dokusu için doku parçasının büyüklüğüne bağlı olarak 10-20 ml kullanılır. </li><li> Doku homojenizatörü birleştirin. % 70 etanol / su 10-20 ml &#39;homojenleştirici&#39; ile temizleyin. </li><li> Doku ve BAW çözeltisi ile tüp içine homojenleştirici sonda yerleştirdikten sonra, birden fazla patlamaları doku homojenize edilir. Sonra bir buz kovası içinde tüp tutun. </li><li> İyice 10-20% 70 etanol / ml su ve sonra BAW homojenizasyon tampon ile, örnekler arasında homojenleştirici temizleyin. Bu bizden sonra% 70 etanol / su ile samples.Dismantleand temiz arasında doku çapraz kirlenmesini önlere. </li><li> Sadece çözünür malzeme içeren bir ekstrakt gerekli ise, 10 dakika için oda sıcaklığında 4,000 rpm&#39;de homojen doku ekstraktı santrifüjlenir. Daha ham ekstrakt gerekli ise, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1,000 rpm&#39;de döndürün. BAW çözünmeyen proteinler ayıklanması için en uygun teknik, proteinlerin aşağı analiz bağlıdır. Fonksiyonel immünolojik testlerin kullanılması için biz daha önce bu iyi 6 tolere edilmesi bulduk 8 M üre erimeyen fraksiyon çözmek için çalışırken öneririm. </li><li> Temiz bir tüpe supernatant aktarın ve buz üzerine koydu. </li><li> Bir BCA tahlil ya da benzeri kullanılarak ekstre protein konsantrasyonu belirlenir. </li></ol> 4. Kurutma ayıklar dondur <ol><li> Protein gerekli kütlesi (yani, tüp başına 100 mikrogram) bağlı olarak, buna göre homojenat sulandırmak ve etiketli 5.0 ml steril, Falcon (12x75 mm) tüpler içine alikotları dağıtmak. Biz sık sık 100 mikrogram / tüp kullanın. </li><li> Bir 1 kullanınHer tüp kapağında 3 delik yapmak için 8-20 ölçer steril şırınga iğnesi. </li><li> ~ 10 dakika süreyle kuru buz veya&gt; 1 saat için -80 ° C derin dondurucuda yerleştirerek ya tüpleri dondurun. -80 ° C&#39;de saklayın liyofilizerde koymak için hazır olana kadar. </li><li> Dondurarak kurutma makinesini açın ve (-100 ° C) gelmesini sağlayınız. Bu yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> Hacmi bağlı olarak, dondurarak kurutma 3 saat içinde tamamlanır fakat rutin gecede bizim örnekleri terk edilebilir. </li><li> Kurutma döngüsünün tamamlanmasından sonra, vakum pompası devre dışı geçer ve yavaş yavaş oda içine basınç sağlar. Raf çıkarın. </li><li> Steril bir başlık olarak, tüplerinden perfore kapaklarını çıkarın ve yenilerini (Falcon 352.032) ile değiştirin. </li><li> -20 ° C&#39;de saklayın tüpler Örnekler kültür ortamı, ya da başka tampon içinde yeniden, ve fonksiyon ya da biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, bir proteinin boyanmalarıjel dalak ve adacık tükenmiş pankreatik doku (asiner etiketli) özü ve insan adacıklar (etiketli adacıkları) saflaştırılmış ile yüklenir. Sonuçlar, her bir doku için farklı moleküler ağırlıkları protein iyi bir temsilini göstermektedir. Insan T hücre proliferasyonunu stimüle etmek için doku özleri kapasitesi CFSE proliferasyon tabanlı tahlil 7 (Şekil 2) kullanılarak test edilmiştir. Bu tahlilde kullanılan PBMC tip 1 diyabet ile tek bir izole edilmiştir. Tepki büyüklüğü antijen olmaksızın 5.000 CD4 +, CFSE parlak hücre başına CFSE sönük hücrelerin sayısının oranı olarak ifade edilir: 5000 CD4 başına CFSE sönük hücre +, üç kopya numuneler 7 antijen ile CFSE parlak hücreleri. Sonuçları zayıf gösteriyor, ancak asiner yanıt (CD1 = 3.5) ve adacık özütü (6.8) için güçlü bir yanıt olarak saptanabilir, yayılması. İnaktive Grip virüsü (CDI = 142.6) olarak dahildirpozitif kontrol. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> Şekil 1. Protein jel. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> Asiner ve adacık özü karşı KAKE tabanlı çoğalması tahlil Şekil 2&#39;de. Sonuçlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz deterjan gibi toksik kimyasallar ücretsiz insan dokusunda bir özü oluşturmak istedim, çünkü bu protokol geliştirilmiştir. Özellikle in vitro insan bağışıklık işlevi metodlarda kullanılan insan doku özleri hazırlamak için kullanılmıştır. Bu protokol kullanılarak hazırlandı özler eşit herhangi bir tampon içinde yeniden oluşturulmuş ve bu gibi western blot ya da sıvı kromatografi gibi pek çok biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu birçok downstream uygulamalar için geçerli bu tekniği yapar. <p c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm polistiren tüpler steril </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Tüpler polistren tüpler için kapaklar (yukarıda) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml steril tüpler </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Asetonitril </td><td> Mallinckradt Kimyasallar </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Anlaşılacak-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homojenizatör: PRO200 </td><td> Bio-strateji </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm testere dişi jeneratör </td></tr><tr><td> Liyofilizerde </td><td></td><td></td><td> Virtis, Tezgahüstü 4K </td></tr><tr><td> Steril İğne 18-20 göstergesi </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Orta </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özgül reaktifler ve ekipman.

fonksiyonel tahliller için doku antijenleri çıkarımı

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

B ve T hücreleri tarafından tanınan adaptif immün yanıtı antijen hedefleri, çoğu 1 tanımlanmamıştır. Bu otoimmün hastalıklar ve kanser 2 özellikle doğrudur. Amacımız, otoimmün hastalığı tip 1 diyabet 1,3,4,5 olarak insan T-hücreleri tarafından tanınan antijenler araştırmaktır. T hücreleri tarafından tanınan antijen tespit edilmemiş doku karşı insan T-hücre yanıtlarını analiz etmek için fonksiyonel testler 6 ile uyumlu bir biçimde insan dokusunda protein antijenleri ayıklamak için bir yöntem geliştirdi. Ekstraksiyon yöntemleri, insan periferik kan mononükleer hücreleri için toksik olan deterjanlar içerdiği bir lizat verim nedeniyle arıtılmadan doku özleri önce, T-hücre yanıtlarını ölçülür edilemedi. Burada insan T hücreleri için toksik olmayan bir biçimde insan dokularından protein ayıklamak için bir protokol açıklar. Doku butan-1-ol, asetonitril ve wat bir karışımı içinde homojenize edilirer (BAW). Doku ekstraktı olarak protein konsantrasyonu ölçülür ve protein, bilinen bir kütle tüpler içine bölünüp edilir. Ekstraksiyon uygulandıktan sonra, organik çözücüler liyofilizasyon ile çıkarılır. Kullanılıncaya kadar liyofilize doku ekstreleri saklanabilir. Bağışıklık fonksiyonu, bağışıklık hücrelerinin bir süspansiyonu tahlillerde kullanım için, uygun bir kültür ortamı içinde, liyofilize özü doğrudan ilave edilebilir. Bu yöntemi kullanarak hazırlanan ekstreler cevaben PBMC tarafından sitokin üretimi ve proliferasyonu, kolayca ölçülmüştür. Dolayısıyla, yöntem, T-hücresi yanıtlarının analizi antijen kaynağı olarak kullanılabilecek insan doku lizatları hızlı hazırlanmasını sağlar. Bu yöntem nakli, kanser ve otoimmünitede dokulara adaptif immün yanıtların analizi kolaylaştıracaktır öneririz.

Fonksiyonel T-hücre deneylerinde antijen kaynağı olarak kullanılacak insan doku özleri hazırlamak için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku-türetilmiş antijenleri ile T-hücresi yanıtı ölçülmesine imkan verir<em&gt; In vitro</em&gt;.

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

B ve T hücreleri tarafından tanınan adaptif bağışıklık yanıtının birçok antijen hedefi henüz tanımlanmamıştır 1. Bu durum, özellikle otoimmün hastalıklarda geçerlidir...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel immünolojik analizlerle uyumlu bir doku ekstraktı hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili dokudan bir örnek toplanarak gerçekleştirilir. Ardından, doku örneği bütanol, aseton, nitril ve su karışımında veya BAW içinde homojenize edilir.Protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, ekstrakt porsiyonlara ayrılır ve çözücüleri uzaklaştırmak için liyofilize edilir. Nihayetinde, yeniden konstitüe edilen ekstrakt, insan T-hücresi proliferasyonu veya sitokin sekresyon analizlerinde antijen kaynağı olarak kullanılır. Bu tekniğin deterjan lizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, liyofilize ekstraktın toksik çözücülerden ve deterjanlardan arınmış olmasıdır.Bu protokolde, tüm insan materyalleri potansiyel olarak enfeksiyöz kabul edilmeli ve tüm işlemler sınıf iki laminer akış kabininde gerçekleştirilmelidir. Steril makas ve pens kullanarak, yaklaşık bir ila iki santimetre boyutundaki dalak kesitlerinden yağ ve fibröz dokuları temizleyin. Dış kapsül materyalinin mümkün olduğunca fazlasını kesin.Dalak dokusundan küçük parçalar kesin ve her bir parçayı steril 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne yerleştirin. Doku parçalarını sıvı azot içine daldırarak dondurun ve -80 °C'de saklayın. Saklama kültürü için insan adaletlerinin hazırlanma prosedürüne başlayın.Göz kapaklarını 37 °C'de CMRL besiyerinde bekletin. Göz kapaklarını 10 ml'lik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne toplayıp 1.500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Besiyerini dökün ve PBS ile iki kez yıkayın; ikinci yıkamanın ardından işlemi tamamlayın.PBS'yi dökün ve tüpü kısa bir süre ters çevirip kağıt havlu üzerine yerleştirerek kalıntı tamponu süzün. Gözeleri yerinden oynatmamaya dikkat edin. Süzme işlemi tamamlandıktan sonra tüpü tekrar kapatın, sıvı azot içerisinde şok dondurun ve -80 °C'de saklayın.Bir doku özütü hazırlamak için öncelikle, dokunun bulunduğu tüpü -80 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. Doku, önceden hazırlanmış ve 4 °C'de saklanmış butanol, asetonitril ve su (BAW) karışımı içerisinde homojenize edilecektir. Doku parçasını kaplayacak miktarda buz gibi soğuk BAW ekleyin; bu demonstrasyonda kullanılan dalak dokusu için 10 ila 20 mL BAW kullanılmıştır.Doku homojenizatörünü kurun. 20 mililitre %70 etanol çözeltisini homojenize ederek homojenizatörü temizleyin. Ardından homojenizatör probunu doku ve BAW çözeltisinin bulunduğu tüpe yerleştirin ve dokuyu birden fazla kısa döngü şeklinde homojenize edin.Örnekler arasında dokuların çapraz kontaminasyonunu önlemek için tüpü daha sonra uygun bir kapta tutun. 10 ila 20 mililitre %70 etanolü suyla homojenize ederek, ardından BAW tamponu santrifüjü yaparak homojenizatörü örnekler arasında iyice temizleyin. Homojenize edilmiş doku ekstraktını oda sıcaklığında bekletin.Yalnızca çözünür materyal içeren bir ekstrakt gerekiyorsa, 4.000 RPM hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha kaba bir ekstrakt gerekiyorsa, santrifüjleme sonrası 1000 RPM hızda beş dakika boyunca döndürün, süpernatantı temiz bir tüpe aktarın ve buza yerleştirin. Ekstraktaki protein konsantrasyonu daha sonra BCA veya benzeri bir analiz kullanılarak belirlenir.Bu protokoldeki en önemli adım, ekstraktın uygun bir hacminin liyofilize edilebilmesi için protein konsantrasyonunun doğru şekilde ölçülmesidir. İstenen protein miktarını dondurarak kurutmak için, öncelikle homojenatı gereken protein miktarına göre seyreltin ve alikotları etiketlenmiş beş mililitrelik steril tüplere dağıtın. Bu örnekte, tüp başına 100 µg protein ayrılmıştır.Her bir tüpün kapağına 18 ila 20 gauge steril bir iğne kullanarak üç delik açın; tüpleri yaklaşık 10 dakika boyunca kuru buz üzerine yerleştirerek dondurun, dondurarak kurutucuyu (freeze dryer) çalıştırın ve cihazın -100 °C'ye dengelenmesini sağlayın. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürecektir. Dondurarak kurutucu hazır olduğunda, tüpleri cihaza yerleştirin ve vakum pompasını çalıştırın.Ekstrakt hacmine bağlı olarak, dondurarak kurutma işlemi üç saat içinde tamamlanabilir; ancak örnekler rutin olarak gece boyunca bırakılır. Kurutma döngüsü tamamlandıktan sonra vakum pompasını kapatın ve hazneye yavaşça hava girmesini sağlayın.Tüp rafını steril bir kabin içerisinde çıkarın. Tüplerin üzerindeki delikli kapakları çıkarın ve yenileriyle değiştirin. Tüpleri -20 °C'de saklayın.Numuneler daha sonra kültür ortamında, medyalarda veya diğer tamponlarda yeniden konstitüe edilebilir ve biyokimyasal analizlerin fonksiyonlarına göre kullanılabilir. Bu şekil, dalak gözleği boşaltılmış pankreatik doku ekstraktları ve saflaştırılmış insan gözlekleri ile yüklenmiş bir protein jelinin boyanmasını göstermektedir. Bu sonuçlar, her doku için farklı moleküler ağırlıklardaki proteinlerin iyi bir temsilini sunmaktadır; asana ve adaşık ekstraktlarının insan T-hücre proliferasyonunu stimüle etme kapasitesi, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) floresan boya CFSE ile işaretlendiği bir proliferasyon analizi kullanılarak test edilmiştir; antijene yanıt olarak prolifere olan ve sonuçta CFSE yoğunluğunda azalma meydana gelen hücreler, akış sitometrisi ile doğrudan ölçülmüştür.Bu örnekte kullanılan PBMC'ler, tip 1 diyabetli bir bireyden izole edilmiştir. C hücresi yanıtının büyüklüğü, üç tekrarlı örneklerde, antijensiz 5.000 CD4 pozitif CFSE bright hücre başına düşen CFSE dim hücre sayısının, antijenli 5.000 CD4 pozitif CFSE bright hücre başına düşen CFSE dim hücre sayısına oranına göre ifade edilmiştir. Sonuçlar, 3,5'lik bir hücre bölünme indeksi veya CDI ile Asana'ya yanıt olarak zayıf ancak saptanabilir bir proliferasyon göstermektedir.Gözleyle özütüne karşı, 6,8 CDI değeri ile daha güçlü bir yanıt gözlemlenmiş olup, bu prosedürün ardından inaktive edilmiş influenza virüsü pozitif kontrol olarak dahil edilmiştir. Doku kaynaklı antigenlere yanıt olarak hangi sitokinlerin salgılandığı gibi ek soruları yanıtlamak için Ali Spot veya eLISA gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Bu video, antikor salgılayan B hücrelerinin, ASC'lerin işlevini değerlendirmek için ELISpot testinin kullanımını göstermektedir. ASC'ler tarafından salgılanan antikorlar, enzim konjuge IgG veya IgM antikorları tarafından tespit edilen zara bağlı poliklonal antikor fragmanları ile etkileşime girer. Her bir oyukta üretilen renkli nokta, B hücrelerinin salgı aktivitesi ile ilişkili olan spesifik antikorun izotipinin varlığını gösterir.

Antikor Salgılayan B Hücrelerinin ELISpot Testi Kullanılarak Fonksiyonel Değerlendirmesi

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Translasyonel kanser araştırmaları insan dokularının çıkarılmasına bağlıdır. Ex vivo analiz için ekstraksiyon yöntemlerini optimize etmek için çok fazla çalışma yapılmıştır. Burada, sınırlı numunelerden maksimum veri çıktısına izin veren doku işleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

İnsan lökosit antijeni (HLA) serileri organ donörü ve alıcı çiftleri arasındaki uyuşmazlıklar antikor aracılıklı ret organ nakli yapılan en önemli nedeni vardır. Burada Anti-donör HLA alloantibodies organ alıcıları içinde soruşturma için bireysel bağış HLA dizileri üzerinde temel alan özel antijen diziler kullanımı mevcut.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Tam kan bazlı immünolojik testler, tanı ve araştırma amaçları için antijene özgü bağışıklığı analiz etmek için kolay ve kaynak açısından verimli bir araç sağlar. Bu makale, pediatrik hastalar ve küçük hayvanlar için düşük hacimli bir versiyon da dahil olmak üzere, mantar ve viral patojenlere karşı konak bağışıklığının kapsamlı analizi için ikili ko-stimülasyonlu optimize edilmiş bir tam kan bazlı protokol sağlar.

Fungal ve Viral Patojenlere Karşı Konak Bağışıklığının Antijene Özgü Analizi için İkili Ko-stimülasyonlu Tam Kan Testi

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Öğrenin, fonksiyonel immünolojik analizler için insan doku ekstrelerinin BAW karışımı ile homojenizasyon ve liyofilizasyon yöntemiyle hazırlanmasını. Bu güvenli teknik, T hücre proliferasyonu ve sitokin salınımı yanıtlarını ölçmeyi sağlar.

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Daha fazla video keşfet