Name: İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Öğrenin, dilate kardiyomiyopatili hastalarda kardiyotropik otoantikorları izole sıçan kardiyomiyositlerinde hücre kısalması ve kalsiyum transiyentleri ölçerek tespit etme yöntemini. Bu teknik antijen bağımsız çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Kardiyovasküler Hastalıklarda Humoral Bağışıklık Yanıtları (- Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ve Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2), Ekonomi ve Teknoloji proje ZIM-KF 2727801MD0 Federal Bakanlığı ve İnovasyon Yetkinlik Merkezi tarafından desteklenen ZIK-Yürüyüş, Eğitim ve Araştırma, Almanya Federal Bakanlığı BMBF FKZ 03Z2CN12). Hayvanlarla Konut ve deneyler Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği (FELASA) Laboratuvarı Zootekni (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) ve Federasyon için Derneği&#39;nin önerilerine göre yapıldı.

1. Hasta Örneklerden IgG İzolasyonu <ol><li> Boş Econo Pac sütuna 2 ml hastanın EDTA plazma başına 3 ml anti-IgG Sepharose doldurarak mini immunoadsorbsiyon sütunlar hazırlayın. IgG izolasyon hastanın plazma, en az 2 ml gerektirir. </li><li> Anti-IgG Sepharose üstünde filtre yerleştirin, sütunun alt ucu açık kesilmiş ve yaklaşık olarak 1 damla / sn &#39;lik bir akış hızına ulaşmak için filtre düğmesine basın. Sütunun tükendi korunması çözümü olsun. </li><li> 3 cilt plazma hacmi başına% 0.9 NaCl ile sütun yıkayın. </li><li> Sütun üzerinde plazma pipet. Plazma tamamen anti-IgG Sepharose batırılır sonra, aynı hacimde% 0.9 NaCl ile yıkanır. </li><li> Pipet bir plazma sütun üzerinde 0.2 M glisin HCl, pH 2.8 hacim ve Sepharose içine batırmayın edelim. Sütun üzerine glisin HCI hacmi başka ekleyin. Bir 15 ml tüp içinde ortaya çıkan akış toplayın ve 0.5 M Tris-HCI, pH 8.0 ile pH 7.3 &#39;e ayarlayın. </li><li> Sütun yenilemek için, 3 plazma hacimleri glisin HCl ile yıkayın. 2 hacim% 0.9 NaCl ile bir son yıkamadan sonra, sütun sonraki plazma örneği için kullanılabilir. ° C ila 4 hafta için 8 - Alternatif olarak, kolon koruma çözeltisi ile doldurulmuş ve 4 de muhafaza edilebilir. </li><li> Kardiyomiyositlerde üzerinde kullanım için, toplanan IgG fraksiyonu deneme tamponu (EB) karşı diyaliz gerekmektedir. EB hazırlanması için, 117 mM NaCI, 2.8 mM KCI, 0.6 mM MgCl2, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde, 20 mM glikoz 1 L damıtılmış suya eklenir ve pH ayarlamak 7.3. </li><li> 100 kDa kesilmiş olan bir molekül ağırlığına sahip olan bir selüloz ester diyaliz zarı tüp için IgG fraksiyonu doldurun. 1 L EB tüp koyun ve 4&#39;e bir manyetik karıştırıcı ile yavaş yavaş karıştırılır ° C. 8 saat sonra, taze EB 3 L diyaliz tüpü içine aktarmak ve 4&#39;de diğer bir 20 saat boyunca dialyze ° C. </li><li> Inactivat için bir su banyosu içinde 30 dakika 57 ° C&#39;de diyaliz için, ısı örnek takibene kompleman faktörleri. Total IgG konsantrasyonunu belirleyin ve 330 mikrogram IgG içeren her alikotları hazırlamak. Ölçümü (adım 4.3) için kardiyomiyositlerde için örnek eklerken, EB ile 1 ml alikotları kadar doldurun. Seyreltilmemiş alikotları daha fazla kullanıma kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonu <ol><li> Ca2 +-serbest izolasyon tampon (IB) hazırlanması için, 110 mM NaCI, 2.6 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES ve bir manyetik kullanılarak 1 L damıtılmış su ile 11 mM glükoz eklemek karıştırıcı. Sterilizasyon için 0.2 mikron şişe üst filtre ile oda sıcaklığında ve filtre, 7.4 pH ayarlayın. </li><li> Termostatlı bir Langendorff perfüzyon sisteminin üst rezervuar içinde IB 80 ml doldurun. 37 ° C arasında bir sıcaklık muhafaza tampon ve% 95 O2 /% 5 30 dakika için CO2 ile tampon havalandırmak için termostat ayar ayarlayın. </li><li> Yaklaşık 10.000 tartılır - collag 12.000 Uenase tip II, 175 mg yağ asidi serbest BSA ve 100 mM CaCl2 stok solüsyonu 22.5 ul içeren 20 ml&#39;lik IB içinde çözülür. Üst rezervuar içinde tecrit tampon pH kontrolü ve gerekirse ayarlanır. </li><li> 375 mg / kg vücut ağırlığı tiyopental ile 200 gr - 175 bir Wistar sıçan Anesteziyoloji. Tiyopental çözümü 2500 IU Heparin ekleyin. Sağlam bir aort arkı ile dikkatlice torakotomi, tüketim kalp sonra ve buz gibi soğuk% 0.9 NaCl içine aktarın. Kan kalp ve çevresindeki doku ve taze% 0.9 NaCl transfer temizleyin. Aorta Açığa, 2-3/sec bir damla hızını elde etmek ve kanül için kalp eklemek Langendorff sistemin akışını düşürücü açın. </li><li> Kadar kalan kan dışarı yıkamak 1 damla / sn debi ile 3 dakikaya kadar kalp serpmek. Langendorff sisteminde IB dolaşmaya başlayın. Üst rezervuar 20 ml tampon kaldır gibi 80 ml ulaşmak için gerekli çok tampon kollajenaz çözüm ve dolum doldurun. C sirküle<html> Başka bir 27 dakika için çözelti ollagenase. Akış hızı Akış redüktör kullanarak 1 damla / sn aralıklarla kontrol ve muhafaza edilmelidir. </li><li> Kulakçıklar ve aortadan temiz kanül gelen kalp, ayırın ve küçük parçalar halinde doğrayın. Kollajenaz çözüm alt rezervuar içine çalıştırmak için izin ver, 40 ml, maksimum hacmi azaltmak ve daha 10 için kıyılmış ventriküller sindirmek -% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli havalandırma altında 15 dk. Daha sonra, bir 50 ml tüp içinde bir 200 mikron elek gazlı bez ile hücre süspansiyonu filtre. </li><li> 200 uM CaCl2 içeren 10 ml IB içinde oda sıcaklığı ve tekrar süspansiyon hücreler 2 dakika için 43 x g&#39;da hücre süspansiyonu santrifüj: 3 adım hücrelerin Ca 2 + içerik yükler. Tekrar santrifüjlenir ve 500 uM CaCl2, 10 ml IB hücreleri tekrar süspansiyon. Son bir santrifüj 50.000 hücre / ml &#39;lik bir yoğunluğa steril filtre edilmiş EB kardiyomiyositlerde (1.8 bakınız) tekrar süspansiyon sonra. </li></ol>kardiyomiyositlerin &quot;&gt; 3 E_TITLE. Fura-2 Boyama <ol><li> Coat 10 mikrogram başına iyi laminin ve tamamen kurutulur beklemek bir 4 iyi odacıklıdır coverglass. </li><li> Her iyi bir kesim uçlu bir mikropipet kullanarak içine kardiyomiyosit süspansiyonu 1 ml doldurun. Hücreler, oda sıcaklığında 1 saat boyunca uymak için izin verin. </li><li> 10, 1 mg / ml &#39;lik ul Fura-2 5 ml EB stok çözelti AM. Seyreltilir Karanlıkta boyama çözüm tutun. </li><li> Coverglass ve her kuyuya boyama çözeltisi pipetle 0.5 ml tampon ve bekâr hücreleri çıkarınız. Sarsıntı orta altında 10 dakika için hücreler inkübe edin. Daha sonra, boyama çözüm take off 1 ml EB ile bir kez hücreleri yıkayın ve nihayet her oyuğuna 0.5 ml EB doldurun. Boyama işlemi sırasında doğrudan ışıktan sakının ve her zaman karanlıkta boyanan hücreleri tutun. </li></ol> 4. Hücre kısaltılması ve Ca 2 + Geçişlerine kaydedilmesi <ol><li> Ters floresan m odacıklı coverglass yerleştirinicroscope bir miyosit kalsiyum ve kontraktilite kayıt sistemine bağlı. De ilk akını ve akış tüpü ile özel yapılmış elektrot yerleştirin. 1 ml / dak EB ve (20 V, 1 Hz, 5 ms süre), elektrik uyarımı ile başlamak Superfuse kardiyomiyositlerde. Hücrelerin yaklaşık 2 dakika stimülasyon uyum sağlayın. </li><li> Net çizgili ve sürekli kasılma ile sağlam bir çubuk şekilli kardiyomiyosit seçin. Görüş alanının merkezinde hücre yerleştirin ve kamera kanal açılır. Hücre çerçeveleme adaptörü dönen ve mikroskop sahne hareket ettirerek videoyu alanı içinde yatay hücre yönlendirilmesi. </li><li> Başlangıç ​​hücre kısalma ve Ca 2 + geçici elde etmek için 15 kasılmalar - kenarı video alanı kontrol elemanları (Şekil 2) tespit ayarlayın, floresan kanal ve kayıt 10 açın. </li><li> Floresans leke ağartma önlemek için mikroskop ışık kanalı kapatın. Örnek EB aracılığıyla akışını değiştirmeHastanın IgG 1 ml ile 3-yollu vana ve superfuse kardiyomiyositlerde ile bypass. Hava iyi ulaşmadan hemen önce pompayı durdur. </li><li> Işık kanalı açın ve başka bir 10 kayıt - Akut hücre yanıtını elde etmek için 15 kasılmalar. Kayıt dondurularak ve tekrar ışık kanalı kapatın. 2&#39;den sonra kayıt ve 5 dk tekrarlayın. </li><li> Kuyunun elektrot çıkarın. EB ile iyice temizleyin ve tüpler odacıklı coverglass bir sonraki sıra ile devam edin. </li><li> Sırasıyla Hücre kısalma ve Ca 2 + &quot;Edge-Length/Length&quot; kullanarak IonWizard yazılımı ile geçici ve &quot;fura 2-Sayısal / Oranı çıkarılır&quot; penceresinde, analiz edin. Başlangıç ​​hücre kısalma ve Ca 2 + Akut için temel (bl% pik h) atıfta pik yüksekliği geçici, 2 dakika ve 5 dk yanıtı yüzde değişim hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18(2011).</li>
<li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462(2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+J%22%5BJournal%5D)">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602(2009).</li>
<li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy%3A+Three-month+results+from+a+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590(2000).</li>
<li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy%3A+results+from+protein+A+immunoadsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729(2005).</li>
<li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423(2007).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649(1999).</li>
<li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis%3A+further+evidence+for+a+multigene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296(1987).</li>
<li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194(1990).</li>
<li>Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiper%2C+HM+%22Cell+Culture+Techniques+in+Heart+and+Vessel+Research%22">Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).</li>
<li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179(1999).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440(1985).</li>
<li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760(1994).</li>
<li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209(2002).</li>
<li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses%3A+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854(2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sunulan yöntem belirsiz kökenli DCM hastalarda fonksiyonel olarak etkili kardiyak otoantikor saptamak için uygun bir yol sunar. Diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, cAMP seviyelerini 6 üzerindeki etkileri ile β1-adrenoseptör karşı işlevsel aktif antikorların saptanması, örneğin, bizim yöntem, belirli bir epitopa bağımsızdır. Tabii ki literatürde açıklanan diğer epitop bağımsız analizi yani yama klemp tekniği veya izole Purkinje lifleri 14 kontraktilite tarafından yetişkin kar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Immunosorba koruma çözümü </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz tip 2 </td><td> Hücre Sistemi </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, serbest yağ asidi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> DMSO içinde 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Econo Pac Kromatografi Sütunları </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Selüloz Ester Diyaliz MembranE </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 sıra Chambered coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Miyosit Kalsiyum ve Kasılabilme Kayıt Sistemi </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6.0 analiz yazılımı </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İzole kardiyomiyositlerin hücresel fonksiyon üzerine antikor etkilerinin Ölçümü

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilate kardiyomiyopati (DKMP) genç yetişkinler 1 kalp yetmezliği için ana nedenlerinden biridir. Toksik maddelere genetik eğilim ve fuar hastaların yaklaşık üçte birinde bu hastalığın nedenleri bilinmesine rağmen, DCM kökeni büyük ölçüde belirsizdir. Bu hastaların önemli bir kısmında, kardiyak epitoplara otoantikorların tespit edilmiş ve hastalığın 2,3 başlangıcı ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından şüphe edilir. Kardiyak otoantikorların önemi immunoadsorbsiyon 3-5 ile otoantikorların ortadan kaldırıldıktan sonra DCM hastada hemodinamik iyileşme altı çizilir. Spesifik antijenlerin çeşitli zaten 2,3 tespit edilmiştir ve bu hedeflere karşı antikorlar immunoassay ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu ölçümlerin uyarıcı (ve bu nedenle de fonksiyonel olarak etkin) ile bloke edici antikorlar arasında ayırt edemez. Eviden vardır artmaktadırBu ayrım önemlidir 6,7 olduğunu ce. Aynı zamanda, cardiotropic antikorların bir dizi hedeflerin yine tanımlanamayan ve bu nedenle bağışıklık deneyleri ile tespit edilemez olduğu kabul edilebilir. Bu nedenle, kendi antijeninin bağımsız işlevsel olarak aktif cardiotropic antikor tespiti için bir metod kurulmamıştır. Yöntem için arka plan genellikle memeli 8,9 arasında kardiyak proteinlerin işlevsel bölgeleri için gözlenen yüksek bir homoloji olduğu. Bu insan antijenlerine karşı, kardiyak antikorlar erişkin sıçan kardiyomiyositler üzerine DCM hastaların IgG test veriyor insan olmayan hedef hücreleri, ile çapraz reaksiyona girer göstermektedir. Önerilen yöntem, 3 adımlardan oluşur: ilk olarak, IgG immunoadsorbsiyon sütunlar (PlasmaSelect, Teterow, Almanya) dan elde edilen Sepharose birleştirilmiş anti-IgG antikorları kullanılarak hasta plazmadan izole edilir. İkinci olarak, erişkin kardiyomiyositlerde ap kullanılarak bir Langendorff perfüzyon cihaz içinde kolajenaz perfüzyon yoluyla izole edilirotokol önceki eserlerinden 10,11 güncellenmiştir. Elde edilen kardiyomiyositlerde laminin kaplanmış odacıklı coverglasses eklenmiş ve Fura-2, kolaylıkla (Ca 2 +) içindekiler 12 hücre içi kalsiyum gözlemlemek için hücre içine getirilebilir bir kalsiyum-seçici floresan boya ile boyanır. Son aşamada, hücre katı ve Ca 2 hasta IgG etki + alan uyarılan kardiyomiyositlerde geçici bir standart ters floresan bağlı olan bir ticari miyosit kalsiyum ve kasılmasını kontrol sisteminin (IonOptix, Milton, MA, ABD) kullanılarak online olarak izlenir mikroskop.

Alanda hücresel inotropiyi ölçümü için iki örnek aşağıda verilmektedir, bir miyosit Ca 2 + ve kasılma kayıt sistemi kullanılarak erişkin kardiyomiyositlerde (Şekil 2) ile alınabilir. Şekil 3, bir kontrol ölçümü arasında bir izlenimini vermektedir, Şekil 4 içinde iken cardiodepressive antikorların etkisi bir hastanın DCM gösterilmiştir. Her iki örnek, başlangıç ​​hücre kısalma ve Ca 2 + EB superfusion sırasında geçici an...

Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Dilate kardiyomiyopati (DKM), genç erişkinlerde kalp yetmezliğinin temel nedenlerinden biridir1. Genetik yatkınlık ve toksik maddelere maruziyet ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dilate kardiyomiyopati veya otoimmün temelli diğer kalp hastalıkları olan hastaların plazmasındaki kardiyotropik antikorları tespit etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak immünoglobulin G'yi saflaştırmak amacıyla, hasta plazmasının anti IgG spheros kolonlarında başlangıçta mini immün absorpsiyon işlemine tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bu biyolojik analiz için hücresel temel sağlamak amacıyla yetişkin Wistar sıçanlarından ventriküler kardiyomiyositler izole edilir.Ardından, kasılmalar sırasında hücre içi kalsiyum geçişlerinin gözlemlenebilmesi için kardiyomiyositlerin oda lamlarına tutunmasına izin verilir ve URA 2:00 AM ile boyanır; daha sonra, hastanın IgG'sinin kardiyomiyosit kontraktilitesi üzerindeki etkisini gözlemlemek için testi yapılır. Sonuçlar, izole edilmiş kardiyomiyositlerdeki kontraktilite ve kalsiyum geçişindeki değişikliklere dayanarak, hastanın IgG'sinin tropik antikorlar içerip içermediğini gösterir. Bu tekniğin, antikorların tespiti için kullanılan standart immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, spesifik bir antijenden bağımsız olması ve stimüle eden ile bloklayan antikorlar arasında ayrım yapmaya olanak

measurement-antibody-effects-on-cellular-function-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Antegrad perfüzyon tekniği ile yüksek kaliteli bireysel fare kalp hücrelerini izole etmek için basit bire yöntemi geliştirdik. Bu yöntem Langendorff içermez ve kardiyak fibroblastlar veya progenitörler gibi ventrikül ve atriyal miyositleri veya interstisyel hücreleri izole etmek için yararlıdır.

Farelerden Kardiyomiyosit İzolasyonu için Antegrad Perfüzyon Yöntemi

Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

Bu protokol, klinik öncesi gelişim sırasında ilaca bağlı kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için güvenilir bir platform olan MyoBLAZER sistemi ile donör kalplerinden alınan yetişkin insan primer kardiyomiyositlerinde kontraktilitenin nasıl ölçüleceğini açıklar.

İzole Yetişkin İnsan Primer Kardiyomiyositlerinde Kalp Kontraktilitesinin Ölçülmesi

Biz sitozolik Ca değerlendirmek için bir yaklaşım...

Sitosolik Ca ölçümü 2 + İzole Kontraktil Lenfatikler

Öğrenin, dilate kardiyomiyopatili hastalarda kardiyotropik otoantikorları izole sıçan kardiyomiyositlerinde hücre kısalması ve kalsiyum transiyentleri ölçerek tespit etme yöntemini. Bu teknik antijen bağımsız çalışır.

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Daha fazla video keşfet