İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dilatasyon kardiyomiyopatisi olan veya otoimmün arka plana sahip diğer kalp hastalıkları bulunan hastaların plazmasındaki kardiyotropik antikorları tespit etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak immünoglobulin G'yi saflaştırmak amacıyla hasta plazmasının anti IgG spheros kolonlarında başlangıçta mini immünosorpsiyonu ile gerçekleştirilir. Bu biyolojik analiz için hücresel temel sağlamak üzere yetişkin wistar sıçanlarından ventriküler kardiyomiyositler izole edilir.

Ardından, kasılmalar sırasında hücre içi kalsiyum geçişlerinin gözlemlenebilmesi için kardiyomiyositlerin oda lamlarına tutunmalarına izin verilir ve URA 2:00 AM ile boyanırlar; daha sonra hastanın IgG'si, kardiyomiyosit kontraktilitesi üzerindeki etkisini gözlemlemek amacıyla test edilir. Sonuçlar, izole kardiyomiyositlerdeki kontraktilite ve kalsiyum geçişindeki değişimlere dayanarak, hastanın IgG'sinin tropik antikorlar içerip içermediğini ortaya koyar. Bu tekniğin, antikorların tespiti için kullanılan standart immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, belirli bir antijenden bağımsız olması ve stimüle eden ile bloke eden antikorlar arasında ayrım yapmaya olanak tanımasıdır.

Prosedürün gösterimi Google tarafından gerçekleştirilecek ve laboratuvarımızdan teknik destek sağlanacaktır. Bu prosedüre başlamak için, boş bir econopak kolonuna her 2 mL hasta EDTA plazması için üç mililitre anti IgG spheros doldurarak mini immuno absorbsiyon kolonlarını hazırlayın. Ardından, anti IgG spherosların üzerine bir filtre yerleştirin.

Kolonun alt ucunu kesin ve yaklaşık saniyede bir damla akış hızına ulaşmak için filtreye bastırın. Ardından kolonu, bir plazma hacmi 0.9% Sodyum klorür ile üç kez yıkayın; plazma anti-IgG Spheros'lara tamamen nüfuz ettiğinde plazmayı kolona pipetleyin ve aynı hacimde 0.9% sodyum klorür ile yıkayın. Sonrasında, pH 2.8'de 0.2 molar glisin hidroklorürden bir plazma hacmini kolona pipetleyin ve fazların içine nüfuz etmesini bekleyin.

Ardından kolona bir hacim daha glisin hidroklorür ekleyin. Akışı 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve kolonu rejenerasyon için pH 8.0'da 0.5 molar tris hidroklorür ile pH'ı 7.3'e ayarlayın. İki hacim %0.9 sodyum klorür ile yapılan son yıkamanın ardından, kolonu üç plazma hacmi glisin hidroklorür ile yıkayın.

Kolon, kardiyomiyositlerde kullanılmak üzere bir sonraki plazma örneği için tekrar kullanılabilir. Toplanan IgG fraksiyonu, öncelikle 100 kilodalton moleküler ağırlık kesim noktasına sahip bir selüloz ester diyaliz membranı tüpüne doldürülerek deneysel tamponlale diyalize edilmelidir. Ardından tüp bir litre EB içerisine yerleştirilmeli ve dört degrees Celsius'ta manyetik karıştırıcı ile yavaşça karıştırılmalıdır. Sekiz saat sonra, diyaliz tüpü üç litre taze EB içerisine aktarılmalı ve diyaliz sonrası dört degrees Celsius'ta 20 saat daha diyalize edilmelidir.

Numuneyi bir su banyosunda 57 °C'de 30 dakika boyunca kaynatın. Kompleman faktörlerini inaktive etmek için toplam IgG konsantrasyonunu belirleyin ve her biri 330 µg IgG içeren alikotlar hazırlayın. Bu prosedürde, kalsiyumsuz izolasyon tamponunu beraberindeki makaleye uygun olarak hazırlayın.

Ardından, bir termostatik lanor perfüzyon sisteminin üst rezervuarına 80 mililitre IB doldurun, tamponu 37 °C'de tutun ve 30 dakika boyunca %95 oksijen, %5 karbondioksit ile havalandırın. Yaklaşık 7.000 ila 10.000 ünite tip iki kollajenaz ve 174 miligram yağ asidi içermeyen BSA'yı, 112,5 µM kalsiyum klorür içeren 20 mililitre IB içinde çözün ve gerekirse üst rezervuardaki izolasyon tamponunun pH değerini ayarlayın.

Ardından, tiopental çözeltisine 2.500 IU heparin ekleyerek, 175 ila 200 gram ağırlığındaki bir Wistar sıçanı kilogram başına 375 µg tiopental ile anestezi edin. Torakotomi sonrası, kalbi aort arkı sağlam kalacak şekilde dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk, %0 sodyum klorür içeren buz gibi soğuk sodyum klorür çözeltisine aktarın. Kalpteki kanı ve çevredeki dokuları temizleyin.

Ardından örneği taze %0.9 sodyum klorüre aktarın ve aortu açığa çıkarın. Saniyede iki ila üç damla hız elde etmek için langor sisteminin akış azaltıcısını çalıştırın. Daha sonra kalbi kanüle bağlayın.

Kalan kanı temizlemek için saniyede bir damla akış hızıyla üç dakikaya kadar perfüzyon uygulayın. Ardından, IB'yi LOR sisteminde sirküle edin. Şimdi üst rezervuardan 20 mililitre tampon çözelti çıkarın.

Rezervuarı kollajenaz çözeltisiyle doldurun ve 80 mililitreye ulaşmak için gerekli miktarda tampon çözelti ekleyerek tamamlayın. Ardından, sindirim çözeltisini 27 dakika daha sirküle edin. Sonrasında, kalbi kanülden ayırın.

Atriyumları ve aortu çıkarın, ardından ventrikülleri küçük parçalar halinde doğrayın. Sindirim tamponunun alt rezervuara akmasına izin verin. Doğranmış ventrikülleri %95 oksijen, %5 karbondioksit ile sürekli havalandırma altında 10 ila 15 dakika daha sindirmek için hacmi maksimum 40 mililitreye düşürün.

Ardından, hücre süspansiyonunu 200 mikron gözenek boyutundaki bir gazlı bez yardımıyla 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Son olarak, hücre süspansiyonunu 40 3G'de iki dakika boyunca santrifüj ederek hücrelerin kalsiyum içeriğini geri kazandırın. Oda sıcaklığında, hücreleri 10 mililitre içerisinde yeniden süspanse edin.

200 µM kalsiyum klorür içeren IB tekrar santrifüj edilir ve hücreler 10 mL içinde yeniden süspanse edilir. IB, 500 µM kalsiyum klorür ile hazırlanır. Son bir santrifüj işleminin ardından, kardiyomiyositler steril filtrelenmiş EB içinde mL başına 50.000 hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde yeniden süspanse edilir.

Dört kuyucuklu bir hazne içindeki lamel camları, kuyucuk başına 10 micrograms laminin ile kaplayın ve tamamen kurumasını bekleyin. Ardından her bir kuyucuğa bir milliliter kardiyomiyosit süspansiyonu ekleyin. Ucu kesilmiş bir mikropipet kullanarak hücrelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca tutunmasını sağlayın; bir milligram per milliliter fira 2:00 AM stok çözeltisinin 10 microliters'ını beş milliliters eb içinde seyreltin ve boyama çözeltisini karanlıkta muhafaza edin.

Ardından, lamellerden tamponu ve yapışmamış hücreleri uzaklaştırın ve her birine 0,5 milliliters boyama çözeltisi pipetleyin. Hücreleri her kuyucukta orta dereceli çalkalama altında 10 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, boyama çözeltisini uzaklaştırın ve hücreleri bir milliliter eb ile bir kez yıkayın.

Ardından, bu prosedürde her bir kuyucuğa 0,5 milliliters EB ekleyin ve lamine camı, bir miyosit kalsiyum ve kontraktilite kayıt sistemine bağlı ters floresan mikroskobunun altına yerleştirin. Giriş ve çıkış tüplerine sahip özel yapım bir elektrodu ilk kuyucuğa konumlandırın ve kardiyomiyositleri dakikada bir milliliter eb ile süperfüze edin.

Elektrik stimülasyonuna 20 volt, bir hertz ve pals başına beş milisaniye süre ile başlayın ve hücrelerin stimülasyona adapte olması için yaklaşık iki dakika bekleyin. Belirgin çizgilenmeye ve sabit kontraksiyona sahip, sağlam, çubuk şeklinde bir kardiyomiyosit seçin ve bunu görüş alanının merkezine konumlandırın. Ardından kamera kanalını açın; hücre çerçeveleme adaptörünü döndürerek ve mikroskop tablasını hareket ettirerek hücreyi video alanı içerisinde yatay olarak yönlendirin.

Video alanındaki saptama kontrol elemanlarının sınırlarını ayarlayın. İlk hücre kısalmasını ve kalsiyum geçişini elde etmek için floresan kanalını açın ve 10 ila 15 kasılmayı kaydedin. Ardından, floresan boyanın ağarmasını önlemek için mikroskop ışık kanalını kapatın.

Üç yollu bir vana ile akışı EB'den örnek baypasına yönlendirin ve kardiyomiyositleri bir mililitre hasta IgG ile süperfüze edin. Hava kuyuya ulaşmadan hemen önce pompayı durdurun, ışık kanalını açın ve akut hücre yanıtını elde etmek için 10 ila 15 kontraksiyon daha kaydedin. Ardından kaydı durdurun ve ışık kanalını tekrar kapatın, kayıtları iki ve beş dakika sonra tekrarlayın ve kayıtlar tamamlandığında elektrodu kuyudan çıkarın; sonunda, hücre kısalmasını ve kalsiyum transiyentini, ion wizard yazılımını kullanarak sırasıyla edge length/length ve URA two numeric subtracted/ratio pencereleri ile analiz edin.

Ardından, akut, iki dakikalık ve beş dakikalık yanıtlar için başlangıç hücre kısalması ve kalsiyum transiyent pik yüksekliğine göre yüzde değişimleri hesaplayın. Burada kontrol ölçümüne ait temsili bir örnek verilmiştir. Hücre kısalması ve kalsiyum transiyenti, IgG süperfüzyonundan önce ve IgG süperfüzyonundan hemen sonraki iki ve beşinci dakikalarda çevrimiçi olarak izlenmiştir.

Ve işte kardiyodepresif antikorlar içeren bir IgG örneğinin ölçümüne dair bir örnek. Hücre kısalması ve kalsiyum transiyenti, IgG süperfüzyonundan önce çevrimiçi olarak ve IgG süperfüzyonundan hemen sonra iki ve beşinci dakikalarda ölçülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, izole yetişkin kırmızı kardiyomiyositlerin hücre kısalması ve kalsiyum transiyenti üzerindeki izole IgG etkisini ölçerek, hasta plazmasındaki kardiyotoksik antikorların nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.