İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dilate kardiyomiyopati veya otoimmün geçmişi olan diğer kalp hastalıkları olan hastaların plazmasındaki kardiyotropik antikorları tespit etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak immünoglobulin G'yi saflaştırmak için anti IgG spheros kolonları üzerinde hasta plazmasının ilk mini immüno-absorpsiyonu ile elde edilir. Ventriküler kardiyomiyositler, bu biyo-tahlil için hücresel temel sağlayan yetişkin wistar sıçanlarından izole edilir.

Daha sonra, kasılmalar sırasında hücre içi kalsiyum geçişinin gözlenmesini sağlamak için kardiyomiyositlerin oda örtü fişlerine yapışmasına izin verilir ve URA 2:00 ile boyanır, daha sonra hastanın IgG'si kardiyomiyosit kasılması üzerindeki etkisini gözlemlemek için test edilir. Sonuçlar, bir hastanın IgG'sinin, izole edilmiş kardiyomiyositlerdeki kasılma ve kalsiyum geçişindeki değişikliklere dayalı olarak tropik antikorlar içerip içermediğini göstermektedir. Bu tekniğin, antikorların tespiti için standart immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, spesifik bir antijenden bağımsız olması ve uyarıcı ve bloke edici antikorlar arasında ayrım yapılmasına izin vermesidir.

Prosedürün gösterilmesi Google'a izin verecek ve laboratuvarımızdan teknik yardım alacaktır. Bu prosedüre başlamak için, iki mililitre hasta EDTA plazması başına üç mililitre, anti IgG sferosunu boş bir ekonopak kolonuna doldurarak mini immüno-absorpsiyon kolonlarını hazırlayın. Ardından, anti IgG sferolarının üzerine bir filtre yerleştirin.

Kolonun alt ucunu kesin ve saniyede yaklaşık bir damla akış hızına ulaşmak için filtreye basın. Daha sonra sütunu üç kez% 0.9 Sodyum klorür plazma hacmi ile yıkayın, plazma tamamen anti IgG Spheros'a daldırıldığında aynı hacimde% 0.9 sodyum klorür ile yıkayın. Daha sonra, kolonda pH 2.8'de 0.2 molar glisin hidroklorürden oluşan bir plazma hacmini pipetleyin ve fosun içine daldırılmasına izin verin.

Ardından kolona başka bir hacimde glisin hidroklorür ekleyin. Akışı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve sütunu yeniden oluşturmak için p pH 8.0'da 0.5 molar tris hidroklorür ile pH'ı 7.3'e ayarlayın. İki hacim% 0.9 sodyum klorür ile son bir yıkamadan sonra üç plazma hacminde glisin hidroklorür ile yıkayın.

Kolon, kardiyomiyositlerde kullanılmak üzere bir sonraki plazma numunesi için kullanılabilir. Toplanan IgG fraksiyonu, önce IgG fraksiyonunun 100 kilodaltonda bir moleküler ağırlık kesimi ile bir selüloz ester diyaliz membran tüpüne doldurulmasıyla deneysel tampona karşı diyalize edilmelidir. Daha sonra tüpü bir litre EB'ye koyun ve dört santigrat derecede manyetik bir karıştırma ile yavaşça karıştırın Sekiz saat sonra, diyaliz tüpünü üç litre taze EB'ye aktarın ve diyalizi takiben dört santigrat derecede 20 saat daha diyalize alın.

Numuneyi bir su banyosunda 57 santigrat derecede 30 dakika kaynatın. Kompleman faktörlerini etkisiz hale getirmek için, toplam IgG konsantrasyonunu belirleyin ve her biri 330 mikrogram IgG içeren alikotlar hazırlayın. Bu prosedürde, ekteki el yazmasına göre kalsiyumsuz izolasyon tamponu hazırlayın.

Daha sonra bir termostat lanor perfüzyon sisteminin üst rezervuarına 80 mililitre IB doldurun ve tamponu 37 santigrat derecede tutun ve 30 dakika boyunca %95 oksijen, %5 karbondioksit ile havalandırın. 20 mililitrede yaklaşık 7.000 ila 10.000 ünite kollajenaz tip iki ve 174 miligram yağ asidi içermeyen BSA'yı çözün. 112.5 mikromolar kalsiyum klorür içeren IB ve gerekirse üst rezervuardaki izolasyon tamponunun pH'ını ayarlayın.

Daha sonra, 175 ila 200 gramlık bir wistar sıçanını, kilogram başına 375 mikrogramda tiyopental kullanarak 2.500 IU heparin ile tiyopental çözeltiye ilave edin. Torakotomiden sonra, kalbi sağlam bir aort arkı ile dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk sodyum klorür içinde buz gibi, sıfır nokta yüzde sodyum klorüre aktarın. Kanı ve çevresindeki dokuyu kalpten çıkarın.

Daha sonra taze% 0.9 sodyum klorüre aktarın ve aortu açığa çıkarın. Saniyede iki ila üç arasında bir düşme hızı elde etmek için langor sisteminin akış azaltıcısını açın. Sonra kalbi kanüle takın.

Kalan kanı yıkamak için saniyede bir damla akış hızıyla üç dakikaya kadar perfüze edin. Bundan sonra, IB'yi LOR sisteminde dolaştırın. Şimdi üst rezervuardan 20 mililitre tamponu çıkarın.

Rezervuarı kollajenaz çözeltisi ile doldurun ve 80 mililitreye ulaşmak için gerektiği kadar tampon doldurun. Daha sonra sindirim solüsyonunu 27 dakika daha dolaştırın. Sonra, kalbi kanülden ayırın.

Atriyum ve aortu çıkarın, ardından ventrikülleri küçük parçalar halinde doğrayın. Sindirim tamponunun alt rezervuara akmasına izin verin. % 95 oksijen,% 5 karbondioksit ile sürekli havalandırma altında 10 ila 15 dakika boyunca doğranmış ventrikülleri daha fazla sindirmek için hacmi maksimum 40 mililitreye düşürün.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu 200 mikron gözenekli bir gazlı bezden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Son olarak, hücre süspansiyonunu iki dakika boyunca 40 3G'de santrifüjleyerek hücrelerin kalsiyum içeriğini geri yükleyin. Oda sıcaklığında, hücreleri 10 mililitre içinde tekrar askıya alın.

200 mikromolar kalsiyum klorür içeren IB tekrar santrifüj edilir ve hücreleri 10 mililitrede yeniden süspanse eder. 500 mikromolar kalsiyum klorür içeren IB. Son bir santrifüjlemeden sonra, resus, steril filtrelenmiş EB'deki kardiyomiyositleri mililitre başına 50.000 hücre yoğunluğuna kadar askıya alır.

Kapak camlarını, oyuk başına 10 mikrogram laminin ile dört kuyulu bir odaya kaplayın ve tamamen kuruyana kadar bekleyin. Daha sonra her bir kuyucuğa bir mililitre kardiyomiyosit süspansiyonu doldurun. Kesilmiş uçlu bir mikro pipet kullanarak ve hücrelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca yapışmasına izin verin, mililitre fira 2:00 stok çözeltisi başına bir miligramın 10 mikrolitresini beş mililitre, eb ile seyreltin ve boyama solüsyonunu karanlıkta tutun.

Daha sonra, tamponu ve bağlanmamış hücreleri kapak camlarından çıkarın, 0,5 mililitre boyama solüsyonu pipetleyin. Her birinde, hücreleri orta derecede çalkalama altında 10 dakika boyunca iyice inkübe edin. Daha sonra, boyama solüsyonunu çıkarın ve hücreleri bir kez bir mililitre eb ile yıkayın.

Daha sonra bu prosedürde her bir oyuğa 0,5 mililitre EB ekleyin, kapak camını bir miyosit kalsiyum ve kasılma kayıt sistemine bağlı bir ters floresan mikroskobu altına yerleştirin. İlk kuyuya ve süpere bir akış ve akış tüpü ile özel yapım bir elektrot yerleştirin. Kardiyomiyositleri dakikada bir mililitre eb ile kaynaştırın.

Elektrik stimülasyonuna nabız başına 20 volt, bir hertz ve beş milisaniye süreyle başlayın ve hücrelerin yaklaşık iki dakika boyunca stimülasyona adapte olmasına izin verin. Net çizgili ve sürekli kasılma ile sağlam çubuk şeklinde bir kardiyomiyosit seçin ve onu görme alanının merkezine yerleştirin. Ardından kamera kanalını açın ve hücre çerçeveleme adaptörünü döndürerek ve mikroskop aşamasını hareket ettirerek hücreyi video alanı içinde yatay olarak yönlendirin.

Video alanının algılama kontrol öğelerinin sınırını ayarlayın. Floresan kanalını açın ve ilk hücre kısalmasını ve kalsiyum geçişini elde etmek için 10 ila 15 kasılma kaydedin. Bundan sonra, floresan lekesinin ağarmasını önlemek için mikroskop ışık kanalını kapatın.

Üç bir valf ile akışı EB'den numune baypasına geçirin ve kardiyomiyositleri bir mililitre hasta IgG ile süper Kaynaştırın. Hava ulaşmadan hemen önce pompayı durdurun, ışık kanalını iyice açın ve akut hücre tepkisini elde etmek için 10 ila 15 kasılma daha kaydedin. Ardından kaydı duraklatın ve ışık kanalını tekrar kapatın, kayıtları iki ve beş dakika sonra tekrarlayın ve sonunda bittiğinde elektrodu kuyudan çekin, kenar uzunluğu eğik çizgi uzunluğunu ve URA iki sayısal çıkarılmış eğik çizgi oranı penceresini kullanarak iyon sihirbazı yazılımı ile hücre kısalmasını ve kalsiyum geçişini analiz edin.

Daha sonra, ilk hücre kısalması ve kalsiyum geçici tepe yüksekliğinden akut, iki dakikalık ve beş dakikalık yanıtlar için yüzde değişikliklerini hesaplayın. İşte kontrol ölçümünün temsili bir örneği. Hücre kısalması ve kalsiyum geçişi, IgG ile süperfüzyondan önce ve IgG ile süperfüzyondan hemen iki dakika beş dakika sonra çevrimiçi olarak izlendi.

Ve burada kardiyo depresif antikorlar içeren bir IgG örneğinin ölçümüne bir örnek. Hücre kısalması ve kalsiyum geçişi, IgG ile süperfüzyondan önce ve IgG ile süperfüzyondan hemen iki dakika beş dakika sonra çevrimiçi olarak ölçüldü. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş yetişkin kırmızı kardiyomiyositlerin kalsiyum geçici kalsiyonunda hücre kısalması üzerindeki izole IgG'nin etkisini ölçerek hasta plazmasındaki kardiyotrafik antikorlarının nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız.