Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, canlı, dolaşımdaki tümör hücrelerini kan örneklerinden izole etmektir. İzolasyon mikro tüplerinin hazırlanması ile başlayın, ardından buffy ceketi kan örneklerinden izole edin. Daha sonra Buffy kaplamayı işlevselleştirilmiş mikro tüp cihazından geçirin.

Yakalanan hücreleri mikro tüpten toplayın ve hücresel hasara neden olmadan akan CTC'leri biyomimetik olarak yakalamak için bir mekanı fizyolojik olarak taklit eden bir cihaz kullanarak kültürü koruyun. Bu teknik, kişiselleştirilmiş kanser tedavileri geliştirmek için klinik bir ortamda işlevsellik sunar. Başlıca avantajları, bunun yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanan basit bir teknik olması ve kan damarlarında meydana gelen doğal katı doku sürecini yeniden oluşturmasıdır.

Ben Cornell Üniversitesi'nde biyomedikal mühendisliği doçenti olan Mike King, prosedürü laboratuvarımdan kıdemli bir teknisyen olan Jeff Madison gösterecek. Aşağıdaki protokol, tek bir mikro tüp cihazının üretimi içindir, 250 mikrolitre% 6.6 Halo sitesi nano tüp çözeltisini sonikleştirir. 30 saniye boyunca çözeltiyi soğuk suyla çağırın.

İkinci bir sonikasyondan sonra, çözeltiyi bir şırıngaya çekin. Çözeltiyi 0.45 mikronluk bir şırınga filtresinden temiz bir mikro çöp tüpü girdabına süzün. Halo bölgesi nano tüp çözeltisi periyodik olarak.

Homojenliği korumak için, 50 santimetre uzunluğunda bir mikro rehan mikro boru bölümü elde edin. Mikro tüp girişini çapraz olarak kesin ve mikro tüpün bir ucunu küçük bir IDEXX adaptör parçasına yerleştirin ve mikro tüpün diğer ucuna bir şırınga iğnesi yerleştirin. Mikro tüpü temizlemek için, mikro tüpün açık ucunu %70 etanolün içine yerleştirin ve etanolü mikro tüpten durulamak için mikro tüpü doldurmak için şırıngaya yaklaşık 50 mikrolitre etanol çekin.

Şırıngaya bol miktarda damıtılmış su çekin. Şimdi şırıngayı mikro tüpten ayırın, şırıngayı boşaltın ve ardından mikro tüpe tekrar takın. Hacim başına 0.02 ağırlığında 50 mikrolitre çizin.

Poliol lizini mikro tüpe yerleştirin ve beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra 100 mikrolitre filtrelenmiş nano tüp çözeltisini mikro tüpe çekin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Nano tüp çözeltisini durulamak için, mikro tüpten 100 mikrolitre su çekin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, mikro tüpten 50 mikrolitre PBS çekin, ardından mililitre başına 50 mikrolitre 10 mikrogram çekin.

Protein G çözeltisi oda sıcaklığında 90 dakika boyunca dengelenir. Daha sonra, mikro tüpe mililitre başına beş mikrogram, E selektin IgG ve mililitre başına 50 mikrogram antikor çözeltisi çekin. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin,% 5 süt proteini ile spesifik olmayan hücresel yapışmayı bloke edin.

Daha sonra, hücre izolasyonu için mikro tüpü kullanmadan 10 dakika önce kan veya buffy coat örnekleri işlenmeye hazır olana kadar PBS'yi oda sıcaklığında inkübe edin. Heparinize bir tüpte selektin moleküllerini aktive etmek için 50 mikrolitre kalsiyum doymuş PBS çizin. Lenfosit izolasyonu için bir hastadan 10 mililitre kan örneği alın.

10 mililitrelik fol pack çözeltisini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 10 mililitrelik tam kan numunesi santrifüjünü 2000 kez G'de 15 dakika, minimum yavaşlama ile dört santigrat derece ile nazikçe kaplayın. Ardından, buffy coat katmanını yeni bir tüpe aktarın.

Buffy ceketi PBS ile yıkayın ve eritrositleri yerleştirmek için santrifüjleyin. Hücre peletlerini bir mili litre RBC lizizinde nazikçe yeniden süspanse edin, tamponlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sonra 10 mililitre ekleyin.

PBS, santrifüjleme ile hücreleri nazikçe karıştırır ve damak alır. IDEXX adaptörlerini kullanarak PBS plus'taki hücreleri nazikçe yeniden askıya alın. İşlevselleştirilmiş mikro tüpün bir ucunu beş mililitrelik bir şırıngaya takın.

Şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin ve işlevselleştirilmiş mikro tüpün açık ucunu hücre önlemesine daldırın. Bağlanmamış ve gevşek bağlı hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu mikro tüpten geçirin. Mikro tüpün açık ucunu PBS plus içeren bir tüpe aktarın.

Şırınganın içine 300 mikrolitre PBS plus çekin. Ardından, mikro tüpün açık ucunu temiz bir tüpe yerleştirin. Şırıngayı mikro tüpten ayırın ve mikro tüpü doldurmak için akuate, hafifçe perfüze acuate içeren bir şırınga takın.

Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, bir mililitre büyüme ortamı içeren bir şırınga takın, mikro tüpü perfüze edin ve atık suyu uygun dokuya toplayın. Kültür plakaları kültüre devam eder. İzole edilen hücreler, dolaşan tümör hücreleri, beş gün sonra bir meme kanseri hastasının ve bir akciğer kanseri hastasının kan örneklerinden izole edildi.

Kültürde. Bu preparatlar, epitelyal hücresel molekül epikan için boyamaya dayalı olarak CTC yakalama için karakterize edildi ve ayrıca çekirdek yakalama saflığı, yakalanan toplam hücre sayısına kıyasla CT C olarak tanımlanan hücrelerin yüzdesi olarak hesaplandı. Bu görüntü, donör A ve B'den izole edilen CTC'lerin temsili mikrograflarını göstermektedir.Kültürde beş gün sonra, hücreler Alexa Fluor 4 88 ile EPAM için floresan olarak boyanmıştır.

Çekirdekler DPI boyama ile görselleştirildi. Bu prosedürü takiben, ilaç duyarlılığı veya hücre belirteç ekspresyonu gibi hastaya özgü bilgileri elde etmek için uygun CTC'ler ve kültür kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve iyi şanslar.