Name: Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Keşfedin, meme ve akciğer kanserli hastalardan canlı dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etme yöntemini. E-selektin ve antikorlarla fonksiyonelleştirilmiş mikro tüp cihazı kullanılarak hücre hasarı olmadan yüksek saflıkta yakalama sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü Ödülü Numarası U54CA143876 aracılığıyla Mikroçevre &amp; Metastaz üzerine Cornell Merkezi tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Bu çalışma ayrıca, Ulusal Bilim Vakfı Doktora Araştırma Bursu (ADH) tarafından kısmen finanse edildi.

Aşağıdaki protokol tek bir mikrotüp cihazın üretimi için. 1. Halloisit Nanotube Çözüm hazırlanması <ol><li> Sonikasyon (10-13 W (RMS)) 250 uL halloysitten nanotüp solüsyonu (su içinde ağırlıkça% 6.6) 30 sn. Bir kez soğuk su ve tekrar sonication ile serin bir çözüm. Tekrar soğutun. </li><li> Bir şırınga içine sonike çözüm çizin, bir 0.45 mikron şırınga filtre takın ve temiz mikrofuge&#39;de tüpe filtre çözüm. Homojenliği sağlamak için zaman zaman Vortex çözüm. </li></ol> 2. Halloisit Nanotüpler ile mikrotüp İç Yüzey Kaplama <ol><li> 50 cm Micro-Renathane microtubing uzun bölümü (300 mikron iç çapı, 35.3 uL iç hacmi) edinin. Diyagonal bir anda mikrotüp bir ucunu kesin ve küçük bir IDEX adaptör parça takın. Mikrotüp diğer ucunda bir 3/10 cc 29G şırınganın iğne yerleştirin. </li><li> Mikrotüp temizlemek için, mikrotüp açık ucundan (ucu yerleştirmekadaptör ile)% 70 etanol ve çekilişe ~ şırıngaya 50 uL etanol mikrotüp doldurmak için. </li><li> Şırıngaya distile su cömert bir hacim çizerek mikrotüp dışarı etanol durulayın. </li><li> Mikrotüp gelen şırınga ayırmak, şırınga boşaltılması ve ardından mikrotüp için takın. </li><li> % 0.02 su içinde a / h poli-L lisin çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL çizin ve oda sıcaklığında (RT) az 5 dakika oturup bekleyin. </li><li> Mikrotüp içine 100 uL filtre nanotüp çözüm çizin ve RT az 3 dakika inkübe sağlar. </li><li> Nanotüp çözüm durulama mikrotüp ile 100 uL su çizin. RT gece, su ile dolu, oturup kaplı mikrotüp izin verin. </li></ol> 3. Hücre İzolasyon için mikrotüplerdeki hazırlanması <ol><li> 1X Dulbecco fosfat içinde 10 ug / mL protein G çözeltisi hazırlayın (- 7.2 PBS, pH 7.0) tamponlu tuz. Mikrotüp ile 50 uL PBS çizin ve sonra 50 uL çekmekProtein G-solüsyonu ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe izin verir. </li><li> 5 ug / mL E-selektin-IgG ve PBS içerisinde 50 ug / mL antikoru (en kanseri numuneler için, anti-PSMA prostat kanseri numuneler için anti-EpCAM) ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır. Mikrotüp içine E-selektin ve antikor çözeltisi 50 uL çekecek ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe izin verir. </li><li> Nonspesifik hücresel adezyon% 5 süt proteini bloke edilir. % 5 (a / h) PBS içinde süt proteini çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL süt proteini çözeltisi çekecek ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe izin verir. </li><li> Tüpe 50 uL PBS çizin ve kan veya buffy coat örnekleri işlem için hazır olana kadar oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Önceden izolasyon için mikrotüp kullanılarak ila 10 dakika, selektin molekülleri aktive Ca2 + (&quot;PBS +&quot;) ile doyurulmuş olan 50 uL PBS çizer. </li></ol> 4. Hücre izolasyon için örneklerinin hazırlanması <ol><li> Hasta heparinize içine 10 ml kan çizin veya eldetüp. </li><li> 50 ml santrifüj tüpüne Yeri 10 ml Ficoll-Paque lenfosit izolasyonu çözüm. Ficoll üstüne hafifçe tabaka 10 ml tam kan, böylece kan ve Ficoll karıştırmak değil. </li><li> ° C ile 4 Minimal yavaşlama azından 15 dakika süreyle 2000x g&#39;de santrifüj;. </li><li> Yeni tüp buffy coat tabakası ve yer çıkarın. </li><li> PBS ile yıkama buffy coat (10 dakika 230X g de santrifüj, süpernatant atın). </li><li> Yavaşça 1 ml eritrosit lizis tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri ve eritrositler lyse RT az 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 10 ml PBS, yavaşça karıştırın ve 10 dakika 230X g santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve yavaşça 4 ml PBS + için 3 pelletini. </li></ol> 5.. Hücre izolasyonu <ol><li> IDEX bağdaştırıcılar kullanılarak bir 5 mL şırıngaya fonksiyonlandırılmış mikrotüp bir ucunu. </li><li> Bir şırınga pompası üzerine şırınga yerleştirin. </li><li> Hücre suspensio inmeye fonksiyonlandırılmış mikrotüp açık ucundann. </li><li> 1-4 mL / saat hızda mikrotüp yoluyla hücre süspansiyonu işlemek. </li><li> PBS içeren bir tüpe mikrotüp açık ucuna transfer + ve mikrotüp ilişkisizleştirilir ve gevşek bağlı hücreleri çıkarmak için 0.016 ml / dk şırıngaya 300 uL PBS + çizin. </li><li> Temiz bir tüp içine mikrotüp açık ucuna yerleştirin. Mikrotüp gelen şırınga çıkarın ve Accutase ile doldurulmuş bir şırınga takın. Yavaşça doldurmak için mikrotüp (~ 50 uL) içine yeterince Accutase serpmek ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe izin verir. </li><li> Toplama, mikrotüp içine 1 büyüme ortamı mL (% 79 RPMI,% 20 FBS,% 1 penisilin streptomisin) ve yayma ile doldurulmuş bir şırınga takın doku kültürü içine atık plaka iyi muamele. </li><li> 37 de kültüre hücreleri ° C ile nemlendirilmiş koşullar altında% 5 CO2. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu tekniğin amacı, kanser hastalarında kan uygulanabilir kanser hücreleri izole etmek için bir. Çeşitli yöntemler kültüründe kanser hücrelerini tanımlamak için vardır; cihazın başarısı için gerekli bir doğrulama. Biz, sağlam hücre çekirdeğine (Şekil 2 ve 3) tespit etmek DAPI ek olarak, bu tür EpCAM (epitel hücre adezyon molekülü) veya PSMA (prostat spesifik membran antijeni) epitel yarımlar karşı antikorları ile kültür içinde hücreleri leke seçmiştir. Kanser hücrelerinin sayısı, bu teknik kullanılarak ille başlangıç ​​numunedeki nedenle kapalı zaman eğrileri sayısının bir fonksiyonu olduğu, ve hastanın değişkenliği yüksek olabilir yakalanır. Evre IV kanser tanısı almış hastalardan alınan numuneler işleme, biz rutin saflıklarda kan tüp başına 100 ve 500 arasında kanser hücrelerini,&gt;% 50 yakalamak. Hemen izolasyon ardından, kontamine lökositlerin fazla sayıda mevcut olabilir. Ancak bu rakamlar kadar 5 gün için kültür ortamında aşağıdaki kuluçka tüketilmiş olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Şekil 1. antikor-aracılı statik yapışma takip selektin aracılı haddeleme gösteren CTC izolasyonu için fonksiyonlandırılmış mikrotüp şematik. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Şekil 2. Kan örneklerinden CTC izolasyon Temsilcisi verileri bir meme kanseri hasta ve bir akciğer kanseri hastanın çekilen. CTC EpCAM boyama dayalı olarak tanımlanan uygulanabilir pozitif hücrelerin sayısı CTC yakalanan hücrelerin sayısı ile karşılaştırıldığında katı çubukları ve sol ordinat ve tespit edilmiştir hücrelerin yüzdesi ilgilendirmeyen ile temsil edilen açık çubuklar ile temsil edilir ve Sağ ordinat üzerinde ölçüldü. Sonuçlar kültür beş gün takip ediyoruz. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Isolati ila 5 gün sonraki kültüründe CTC ayrı donör (A ve B) den Şekil 3. Örnek mikrografikleriBir kanser hastasının kan örneği üzerinde. Hücreler floresan çekirdeği (mavi) görselleştirmek için AlexaFluor 488 (yeşil) ve 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile EpCAM için boyandı.

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+AD+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22">Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology</a>. , (2011).</li>
<li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells%3A+a+new+model+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li>
<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+Building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li>
<li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade%3A+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.</li>
<li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li>
</ol>

MRK CellTraffix, Inc (Rochester, NY) bilimsel danışmanı.

Genellikle yeni kanser tedavi keşfi erken adımları birincil kanser hücrelerinin şüpheli benzemeyenlerdendi kanser hücre hatları, henüz laboratuvar kullanım kolaylığı nedeniyle kullanmak kalır kullanan bu böyledir. Birincil insan kanser hücreleri erken roman araştırma yararlanılmıştır eğer yeni kanser tedavilerinin geliştirilmesine yönelik araştırmalar hızlandırılmalıdır olacaktır. CTC kanlarında varlığı ve standart bir kan beraberlik kolaylığı sayesinde kanser hücresinin en kolay ulaşılabilir tipi vardır. Buna ek olarak, dolaşımdaki tümör hücreleri metastazı 5,6 sürecinde gerekli bir aşama temsil eder, böylece yeni bir ilaç hedefleme için hastalığı ve yarar önemleri açıktır. In vitro kandan CTC izolasyonu onların düşük konsantrasyonlarda da karmaşık hale geliyor: Bir milyon nüfus başına lökosit veya eritrosit 7 milyar başına bir sırasına. Tek FDA onaylı tekniği Hücre dahil olmak üzere, kanda CTC tespit için mevcut yöntemlerin çoğunluğu<html> Arama (Veridex), hasar veya numaralandırma ötesinde kullanımı engelleyen, algılama sürecinde hücrelerini yok. Yöntemi hücre canlılığı ödün vermeyen yukarıda açıklanan ve böylece kanser gelecekte yapılacak klinik araştırmalar için kapıyı açar. Sağlam hücreleri kurtarma bu tekniğin amacı olduğu için, hücreleri özellikle kan ayırma adımları sırasında, dikkatle şarttır. Örneğin kanser türü olarak kritik bir özelliğine göre geliştirilmiş verim elde etmek için değiştirilebilir olabilir, bu sistemde ayarlanabilir parametrelerin vardır. Yukarıda tarif edilen adımlar olarak, anti-PSMA kullanılan bileşikler, prostat kanseri örnekleri işlerken dışında tüm kanserler için bir CTC-özgü antikor olarak EpCAM kullanmak seçmiştir. Kansere özgü antikorların daha da kesin ikamelerini bireysel hastalar için performansını iyileştirmek için kullanılabilir. Dahası, selektin ve antikor konsantrasyonları yakalama 8 geliştirmek için değiştirilebilir. &quot;&gt; Cihazı elzem bir özelliği yüzeye E-selektin moleküllerinin birleşmesi. E-selektin normal endotelyal hücreler ve inflamasyon siteleri, hızlı hareket eden lökositlerin toplamak için fonksiyonun lümen yüzeyi üzerinde ifade edilir. Akan lökositlerin için geçici olarak bağlamak integrinler tarafından endotel hücre daha yavaş ve daha güçlü bir bağlayıcı kolaylaştıran bir yavaş, haddeleme davranış çıkan selektin moleküller. İkna edici deneysel kanıt CTC benzer bir mekanizma ile 9,10 extravasate olduğunu durumda yaptığı var. selektin eklenmesi de Cihaz yüksek debi de çalıştırılmasına olanak sağlar, aksi takdirde antikorlar 11 bağlanmasını hücreleri önleyecektir oranları. Böylece bizim cihaz fizyolojik biomimetically hücresel hasarı maruz kalmadan CTC akan yakalamak için bir venül taklit eder. Geliştirilmiş cihaz performansı lümen yüzeyine halloysitten nanotüp kaplamanın Ayrıca atfedilebilirCihazın. Önceki çalışmalar geliştirilmiş işlevsellik sağlıyor nanotüp kaplamanın üç ana bileşen olduğunu göstermiştir. İlk olarak, nanotüp kaplama yüzeyinin üzerinde daha büyük bir proteine ​​4 çökelmesine olanak, artan yüzey alanı sağlamaktadır. İkincisi, nanotüp kaplama atomik kuvvet mikroskobu yerine getirirken bireysel nanotüpler akışına yüzeyinden çıkıntı olduğunu tespit etti. Bu, hücre tüp 4 yoluyla çekilen ve önceki bunların yörüngesi içinde yüzeyine işe böylece selektin moleküller yüzeyi üzerinde bir gibi büyük bir mikron sunulabilir sağlar. Son olarak, halloysitten nanotüp kaplama lökosit yapışması önlemek ve CTC ile birlikte ele lökositlerin azaltılmış bir dizi izin veren, yüzey üzerinde yayılan ve böylece daha sonraki CTC saflıklarda 3 edebilmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> 300 um ID hortum </td><td> Braintree Bilimsel </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Şırıngaya bağlantı için büyük boru </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Pompa için 5 mL şırınga </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Büyük tüp küçük Konnektör </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Şırıngaya Konnektör büyük boru </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> F-120 ve P-659 </td></tr><tr><td> Mikrotüp için Şırınga (3/10cc İnsülin Şırınga U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Artı </td><td> GE Healthcare Bio-Bilimleri AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lizis Buffer (Tampon EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Protein G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> İnsan EpCAM/TROP-1 Antikor </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA Antikor (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96 oyuklu plakalar (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Sınıf Engelleyicisi Sigara Yağ Kuru Süt, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloisit Nanotüpler </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Kalsiyum Karbonat, 5g </td><td> Aldrich Kimya </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Orta RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poli-L lisin% 0.1 w / v su içinde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Model 100 </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Atlanta Biyokimyasallar </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin </td><td> Sigma Yaşam Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

hasta kan Örneklerinden canlı dolaşımdaki tümör hücreleri rapid İzolasyonu

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (CTC) dolaşım sistemi boyunca primer tümörün yayılması ve nihayetinde uzak bölgelerde ikincil tümörler oluşabilir hücrelerdir. CTC sayımı, kan ve hastalığın şiddetine 1 in CTC konsantrasyonu arasındaki korelasyon üzerine dayanan hastalığın ilerleyişini takip etmek için kullanılabilir. Bir tedavi aracı olarak CTC kişiselleştirilmiş tedaviler geliştirmek için laboratuar okudu olabilir. Bu amaçla, CTC izolasyon hiçbir hücresel hasara ve özellikle diğer hücre tipleri, lökositler tarafından kontaminasyona neden gerekir, mümkün 2 olarak kaçınılmalıdır. CTC sayımı için tek FDA onaylı cihaz dahil, geçerli teknikleri, çoğu, (Daha fazla bilgi için Ref. 2) izolasyon sürecinin bir parçası olarak CTC yok. Uygulanabilir CTC yakalamak için bir cihaz mikroakışkan epiteliyal belirteçler 3 karşı antikorların yanısıra E-selektin glikoproteini ile fonksiyonelleştirilmiş bir yüzey oluşan, tarif edilmektedir. Cihazın performansı artırmak içinBir nanoparçacık kaplama Mance halloysitten nanotüpler, kil 4 hasat bir alüminosilikat nanoparçacık oluşan uygulanan edildi. E-selektin moleküllerin alternatif mikroakışkan cihazları üzerinde bir avantaj daha uzun işlem süreleri bir yüzey etkileşim için yeterli zamana sahip hedef hücreleri sağlamak için gerekli olan neyin kredi, cihaz üzerinden pompalanan hızlı hareket CTC yakalamak için bir yol sağlar. Epitel hedeflere antikorlar gibi izolasyon ayarlamak için, kolayca ayarlanabilir parametre sağlamak gibi, cihaza CTC-özgüllük sağlar. Son olarak, halloysitten nanotüp kaplama önemli ölçüde geliştirilmiş izolasyon, hızlı hareket eden hücreler yakalamak için yardımcı protein adsorpsiyonu için, yüzey alanı artırılmış sağlayarak ve tehlike lökosit 3,4 kovucu diğer tekniklere nazaran sağlar. Bu cihaz, off-raf malzemeleri kullanarak basit bir teknik ile üretilir, ve başarılı bir şekilde metastatik kandan kanser hücrelerinin yakalamak için kullanılmıştırkanser hastası. Yakalanan hücre izolasyonu takiben kültürde 15 gün için kadar korudu ve bu örneklerin genellikle her hastadan&gt;% 50 canlı primer kanser hücreleri oluşur edilir. Bu cihaz, seyreltilmiş ve tam kan buffy tabaka örneklerinin her iki canlı CTC yakalamak için kullanılmıştır. Sonuçta, biz Kişiye özel kanser tedavileri geliştirmek için bir klinik ortamda işlevselliği ile bir teknik sunduk.

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Dolaşan tümör hücreleri (CTC), primer tümörden koparak dolaşım sistemi aracılığıyla yayılan ve nihayetinde sekonder ... oluşturabilen hücrelerdir.

Bu prosedürün genel amacı, kan örneklerinden canlı, dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etmektir. Öncelikle izolasyon mikro tüplerinin hazırlanmasıyla başlayın, ardından kan örneklerinden buffy coat katmanını izole edin. Son olarak, buffy coat katmanını fonksiyonelleştirilmiş mikro tüp cihazı aracılığıyla işleyin.Mikro tüpten yakalanan hücreleri hasat edin ve hücrelere zarar vermeden akan CTC'leri biyomimetik olarak yakalamak için fizyolojik olarak bir ortamı taklit eden bir cihaz kullanarak kültürü sürdürün. Bu teknik, klinik ortamda kişiselleştirilmiş kanser tedavileri geliştirmek için işlevsellik sunar. Temel avantajları, yaygın olarak bulunan malzemelerin kullanıldığı basit bir teknik olması ve kan damarlarında meydana gelen doğal katı doku sürecini yeniden canlandırmasıdır.Ben Mike King, Cornell Üniversitesi biyomedikal mühendisliği doçentiyim; prosedürü uygulamakla laboratuvarımdan kıdemli teknisyen Jeff Madison ilgilenecek. Aşağıdaki protokol, tek bir mikro tüp cihazın üretimi içindir; 250 µL %6,6'lık Halo site nanotüp çözeltisini 30 saniye boyunca sonike edin. Çözeltiyi soğuk su ile soğutun.İkinci sonikasyon işleminden sonra çözeltiyi bir şırıngaya çekin. Çözeltiyi 0,45 mikronluk bir şırınga filtresi aracılığıyla temiz bir mikro santrifüj tüpüne filtreleyin. Nano tüp çözeltisini periyodik olarak vorteksleyin.Homojenliği korumak için, 50 santimetre uzunluğunda bir mikro rehan mikro tüp bölümü temin edin. Mikro tüp girişini çapraz şekilde kesin ve mikro tüpün bir ucunu küçük bir IDEXX adaptör parçasına, diğer ucunu ise bir şırınga iğnesine yerleştirin. Mikro tüpü temizlemek için, mikro tüpün açık ucunu %70 etanol içine yerleştirin ve mikro tüpü doldurmak ve etanolle durulamak için şırıngaya yaklaşık 50 mikrolitre etanol çekin.Şırıngaya bol miktarda distile su çekin. Şimdi şırıngayı mikro tüpten ayırın, şırıngayı boşaltın ve ardından tekrar mikro tüpe takın. Ağırlık başına hacimce %0,02'lik çözeltiden 50 µL çekin.Mikrotüpe poliyol lizin ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, mikrotüpe 100 µL filtrelenmiş nanotüp çözeltisi çekin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Nanotüp çözeltisini durulamak için mikrotüpten 100 µL su geçirin ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin; ardından mikrotüpten 50 µL PBS ve ardından 10 µg/mL konsantrasyonunda 50 µL geçirin.Protein G solüsyonu oda sıcaklığında 90 dakika boyunca dengeye getirin. Ardından, 5 µg/mL E selectin IgG ve 50 µg/mL antikor solüsyonundan 50 µL'yi mikrotüpe çekin. Oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin, spesifik olmayan hücresel yapışmayı %5 süt proteini ile bloke edin.Ardından, hücre izolasyonu için mikrotüp kullanılmadan 10 dakika önce kan veya buffy coat örnekleri işlemeye hazır olana kadar PBS'yi oda sıcaklığında inkübe edin. Heparinli bir tüpte selektin moleküllerini aktive etmek için 50 µL kalsiyum doyurulmuş PBS çekin. Lenfosit izolasyonu için hastadan 10 mL kan örneği toplayın.50 milliliter'lik bir santrifüj tüpüne 10 milliliter fol pack solüsyonu ekleyin. 10 milliliter tam kan örneğini nazikçe üzerine ekleyerek, minimal yavaşlama ile dört derece Celsius'ta, 15 dakika boyunca 2000 times G hızında santrifüjleyin. Ardından, buffy coat tabakasını yeni bir tüpe aktarın.Buffy coat'u PBS ile yıkayın ve eritrositleri çöktürmek için santrifüjleyin. Hücre peletlerini nazikçe 1 ml RBC liziz tamponunda yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından 10 ml ekleyin.PBS ile nazikçe karıştırın ve santrifüjleme yoluyla hücreleri çöktürün. IDEXX adaptörlerini kullanarak hücreleri nazikçe PBS plus içinde yeniden süspande edin. Fonksiyonelleştirilmiş mikro tüpün bir ucunu beş mililitrelik bir şırıngaya takın.Şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin ve fonksiyonelleştirilmiş mikro tüpün açık ucunu hücre süspansiyonuna daldırın. Bağlanmamış ve gevşekçe bağlanmış hücreleri uzaklaştırmak için hücre süspansiyonunu mikro tüpten geçirin. Mikro tüpün açık ucunu PBS artı içeren bir tüpe aktarın.Şırıngaya 300 µL PBS plus çekin. Ardından, mikro tüpün açık ucunu temiz bir tüpe yerleştirin. Şırıngayı mikro tüpten ayırın ve acuate içeren bir şırınga takarak mikro tüpü doldurmak için acuate'i nazikçe perfüze edin.Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyonun ardından, bir mililitre büyüme medyası içeren bir şırınga takın, mikro tüpü perfüze edin ve efllüenti uygun doku kültür plaklarına toplayarak kültüre alın. İzole edilen hücreler, bir meme kanseri hastasının ve bir akciğer kanseri hastasının kan örneklerinden beş gün sonra izole edilen dolaşan tümör hücreleridir.Kültürde. Bu preparatlar, epitel hücresel molekül EPAM boyamasına dayanarak CTC yakalama kapasitesi açısından karakterize edildi ve çekirdek yakalama saflığı, yakalanan toplam hücre sayısına kıyasla CTC olarak tanımlanan hücrelerin yüzdesi olarak hesaplandı. Bu görüntü, A ve B donörlerinden izole edilen CTC'lerin temsili mikrograflarını göstermektedir. Kültürde beş gün geçtikten sonra, hücreler Alexa Fluor 488 ile EPAM için floresan boyama ile işaretlendi.Çekirdekler DPI boyaması ile görselleştirildi. Bu prosedürün ardından, canlı CTC'ler ve kültür, ilaç duyarlılığı veya hücre belirteç ekspresyonu gibi hastaya özgü bilgiler elde etmek için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve başarılar dileriz.

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, ötenazi uygulanmış bir kolorektal tümör fare modelinin tam kan örneğinden dolaşımdaki tümör hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu izole CTC'ler kültürlenebilir ve amaçlanan aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Tam Kan Örneğinden CTC İzolasyonu: Murin Kolorektal Kanser Modelinden CTC Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, hepatosellüler karsinom (HCC) metastazı sinjeneik fare tümörü modelinin tam kanından CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Protokol, bir poli (N-ISO-propylacrylamide) etkili bir yakalama ve canlı dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) arasında thermoresponsive salınması için (PIPAAm) kaplanmış mikro filtre sunulmaktadır kullanılması. Bu yöntem analizleri ve karakterizasyonu, aşağı off-çip kültürü için hastaların kan ve canlı CTC sonraki sürümünden CTC yakalanmasını sağlar.

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Kült WC'ler, belirli belirteç ifadesini test ederek ve ilaç direncini ve karaciğeri diğer olasılıklar arasında kolonileştirme yeteneğini değerlendirerek kanserin daha derin bir fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Genel olarak, CTC kültürü hasta sonucunu iyileştirmek için kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir klinik araç olabilir.

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

Bu makalede, hücresiz DNA ve dolaşımdaki tümör hücreleri gibi maddeleri tam kandan kolayca ve verimli bir şekilde ayırmak ve toplamak için otomatik ekipmanın uygulanması açıklanmaktadır.

Kanserle İlgili Maddelerin Klinik Örneklerden Otomatik Olarak Ayrılması ve Toplanması

Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Burada, akciğer kanseri hücrelerinde tam kan içeren ve sprek olan yapay bir örnekten nadir kanser hücrelerinin izole edilmesini gösteren bir protokol sunuyoruz. Protokol, yarı otomatik, etiketsiz hücre izolasyon platformu kullanır. Zenginleştirilmiş hücreler, epidermal büyüme faktörü reseptör mutasyonları için damlalı dijital PCR kullanılarak analiz edilir.

Dolaşan Nadir Hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör DNA Mutasyonlarının Profillenmesi Hücre İzolasyon Sistemi ve Damla Dijital PCR Kullanılarak

Keşfedin, meme ve akciğer kanserli hastalardan canlı dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etme yöntemini. E-selektin ve antikorlarla fonksiyonelleştirilmiş mikro tüp cihazı kullanılarak hücre hasarı olmadan yüksek saflıkta yakalama sağlanır.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Daha fazla video keşfet