Name: Granülosit-bağımlı otoantikor indüklenen Cilt Kabarcıklanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Keşfedin, farelerde kolajen VII antikorları ile pasif transfer yöntemiyle cilt kabarcıklanmasının indüksiyonunu ve analizini. Bu model, epidermolizis bulloza akvizita patogenezini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Freiburg Üniversitesi (CS) Tıp Fakültesi Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 ve BIOS&#39;lar hibeleri ile destek için minnettarım.

1. Patojenik antikorun hazırlanması Not: antikorlar gece boyunca 0.1 M glisin pH 2.5-3 (elüsyon tampon) (ON) saklanan olmamak gibi Saflaştırılması ve antikor konsantrasyonu, aynı gün yapılmalıdır. IgG Affinity saflaştırılması: Bağışıklık tavşan serumu 25 ml kullanın: <ol><li> 4. ON tavşan serumu çözülme ° C, 20 ° C de 1xPBS (tampon çalıştıran) ile 1:1 Karışım, 10 dakika boyunca 1260 x g de santrifüjlenir İsteğe bağlı olarak, filtre kağıdı ile filtre adım serum yağ olması durumunda santrifüj sonrası dahil olabilir. </li><li> Bu arada, G matrisi 1XPBS (tampon) çalışan 10 yatak hacmi (yatak hacmi = matriks hacmi) ile sütun doldurulur proteini yıkayın. </li><li> Seyreltildi ve sütuna uygulanır serum filtre edilmiş ve oda sıcaklığında (RT) de sallanan platform üzerinde 1 saat inkübe edilir. </li><li> Collect akan (FT) 50 ml Flakon tüp. Bunu atmayın konsantrasyona kadarve saflaştırılmış IgG titreleri bilinmektedir. </li><li> 1XPBS 5 yatak hacmi ile matris yıkayın ve arada Elüsyonlanan IgG fraksiyonu toplamak için 50 ml Falcon tüpleri hazırlayın. Pipet 1 ml pH nötralize edici tamponu: her bir tüp içinde 1 M Tris pH 10 (aksi takdirde elde edilecek arındırıldı ve miktarına bağlı olarak 1:20 TRIS tampon oranı). </li><li> Sütun 0.1 M glisin pH 2.5-3 ve 50 ml fraksiyon (ler) toplamak: 100-150 ml elüsyon tamponu uygulanır. , Tüp 2-3x çevirin pH ölçümü ve pH 7.2-7.4 ulaşana kadar nötralize tampon eklemek. </li><li> IgG ile arındırıldı ve birkaç damla toplayın ve etalon 280 nm&#39;de OD ölçmek olarak elüsyon tamponu kullanılarak. OD &lt;0.1 durağı koleksiyonculuğu ise. </li><li> Protein G matrisi Regenerate ve üreticinin yönergelerini izleyerek saklayın. </li></ol> Amicon tüpleri ile ultrafiltrasyon ile Konsantrasyon: <ol><li> 15-20 dakika santrifüj edilerek 1XPBS ile Amicon Ultra (15 ml / 30KDa) ultrafiltrasyon tüpler Yıkama4 ° C&#39;de 3.220 x g&#39;da Amicon gelen FT atın. </li><li> 25-30 3.220 xg&#39;de dk ve 4 için yıkandı, IgG fraksiyonu ve santrifüj 15 ml Amicons doldurun ° C; santrifüjleme zamanı hep eluat protein içeriğine bağlıdır. </li><li> FT atın ve sol hiçbir Elüsyonlanan Kesir kadar ultrafiltrasyon tekrarlayın. </li><li> Santrifüjle 1XPBS 25-30 dk, yoğun, iki kez konsantre IgG yıkayın. </li><li> 1XPBS 1,500-2,000 arasında ul nihai hacim içinde Amicon filtreden &quot;yapışkan&quot;, sarımsı bir çözelti antikor toplayın. </li><li> Bir spektrofotometre Nanodrop kullanılarak IgG hazırlık Tedbir konsantrasyonu: Kons. (Mg / ml) = A (280 nm) x seyreltme faktörü / 1,4 </li><li> Üreticinin yönergelerini takip Amicons yıkayın ve saklayın. </li></ol> 2. Fareler içine Kollajen VII-spesifik IgG Enjeksiyon Gerçek deneysel prosedür başlamadan önce, emin olun deneysel proprotokolünü yazılır ve tüm malzemeler deney için hazır edilir. <ol><li> Hastalığın puanlama, ELISA&#39;lar, immünofloresan (IF) analizi ve miyeloperoksidaz (MPO) testi 4 veri sayfalarına hazırlayın. </li><li> Kan ve organlar, cryomolds yanı sıra histolojik işleme ve kasetler gömmek için tüpler etiketleyin. </li><li> Antikor çözeltileri taze hazırlanmış ya da stoklarından çözülmüş ve (IF mikroskopi ve / veya ELISA ile titre) kendi reaktivite bakımından karakterize edilmelidir. Steril filtre edilmiş antikor solüsyon enjeksiyon için gerekli doz ul 250-1000 arasında değişen bir şekilde PBS ile seyreltilmelidir. Eğer tüm deneme gerçekleştirmek için yeterli IgG sahip olduğunuzdan emin olun. </li><li> Hazırlayın taze antikoagülan: Heparin 20 U / ml ve 8.7 mg / ml ketamin / anestezi için 1.3 mg / ml xylazine karışımı. Farelerde hazırlanan% 3.7 formaldehit ile tüpler etiketli ödün zaman. </li><li> (Neşter, makas, ince noktası ve curv cerrahi aletler sterilizeed forcipes) ve şırıngalar (insülin şırıngaları, 1 ve 2 ml şırınga), iğneler, dijital kamera ve ekstra hafıza kartı hazırlayın. </li></ol> Not: ketamin / xylazine veya izofluran uyuşturulur fareler üzerindeki tüm prosedürleri gerçekleştirin fareler hızlı bir şekilde kurtarmak gibi İzofluran, günlük cilt kontrolleri için tercih edilen anestezi seçenektir.. Ancak, resim, 87 mg / kg ketamin ve 13 mg / kg xylazine çekerken genellikle cilt altına enjekte edilir. Ötenazi için ketamin / xylazine doz 130 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg xylazine yükselmiştir. <ol><li> Genel sağlık durumu, deri ve kürk görünümü için zaten işaretlenmiş hayvanlar kontrol, onları tartmak ve (her zaman aynı kulak sopa) onların kulak kalınlığını ölçmek. </li><li> Gözlenen değerler ve klinik değerlendirme levha değişiklikleri kaydedin. </li><li> Antikoagülan aynı hacimde içeren bir şırınga içinde, kuyruk veni 20-30 ul (2-3 damla), kan toplamak. </li><li> Kürk Dezenfekte ve% 80 etanol kullanılarak cilt. </li><li> . Subkutan insülin şırınga kullanarak arkasına antikor çözüm enjekte (bazı sitelerde (örneğin, kulaklar) için sadece küçük miktarlarda (10-50 ul) enjekte edilmesi mümkün bulunmaktadır.) </li></ol> Enjeksiyonlar, ikinci günde 4 kez tekrar edilmelidir. Balb / c ve yaklaşık olarak 20 g vücut ağırlığı C57BL6 fareler 3-4 günde 750 mcg / g vücut ağırlığı / enjeksiyon otoantikor için 400-500 ilk uygulamadan sonra hastalık geliştirme başlar. Deney çalışması bittikten sonra: <ol><li> 130 mg / kg ve ketamin / xylazine subkutan 20 mg / kg enjekte ederek derin narkoz altında fareler koyun, posterior vena kava onları exsanguinate ve kalbini sökecek. </li><li> Deri gibi organ / doku örnekleri toplayın: kuyruk, kulak, kan ve özofagus ve önceden etiketlenmiş ve PBS veya% 3,7 formaldehit dolu tüplerin koydum. </li></ol> Dönen zamanlaboratuvar: <ol><li> 1.200 xg, ayrı plazma RT 10 dak kan santrifüj, düzgün etiketli tüplere plazma aktarmak ve onları uygun şekilde saklayın. </li><li> Cilde düzgün cryomolds, etiket kullanarak Optimal Kesme Sıcaklık orta biyopsisi ve -80 saklayın Embed ° C. </li><li> Etiketli gömme kalıplara histoloji içindir doku örnekleri yerleştirin ve parafine gömme kadar% 3,7 formaldehit içinde saklayın. </li></ol> 3. Hastalık Şiddeti Klinik Değerlendirme Fare deri ve mukoza lezyonları için günlük muayene edilmeli ve bulguların uygun formları kullanarak kayıt edilmelidir. Erken ötanazi için kriterler 5 bir hastalık skoru (Tablo 1) sayma, daha o 20 vücut yüzeyinin% ve üç gün üst üste toplam vücut ağırlığının% 5-10 kilo kaybı etkileyen deri lezyonları olduğunu. <ol><li> Karnı üzerinde fare yerleştirin. Sağ, yani baş bölgesi ile başlayınkulak ve kabarcıklar, erozyonlar, iç kabuk üzerinde hem de dış tarafında kontrol edin. Sol kulak ile aynı şekilde devam edin. </li><li> Sağ ve sol gözler alopesi, eritem belirtileri için kontrol, erozyonlar ve / veya kabuk vardır. </li><li> Alın ve burun alan burun, dudak ve ağız mukoza ventral kısmı ile devam eden, önümüzdeki aracılığıyla fırçalanır. </li><li> Yukarı hareketli, pençe itibaren sağ ön bacak inceleyin; sol ön bacağa geçin. Sağ ve sol arka ayakları ile aynı prosedür. </li><li> Kavisli bir ince nokta forseps ile boyun ve sırt alanda kürk ile fırçalayın. </li><li> Sırt üstü çevirin ve fare karın bölümü ile birlikte uzuvların ventral tarafı önceden olduğu gibi aynı şekilde kontrol edin. </li><li> Kuyruk kontrol edin. </li><li> Farelerde hastalığı geliştirmek vücudun ilgili fotoğraflarını çekin. Dikkat resim kalitesi ve miktarına dikkat edilmelidir. </li><li> Klinik hastalık puanları hesaplayın. </li></ol> 4. Cilt ve Plazma Örneklerinin Analizi <ol><li> , Mağaza ve / hazırlayın veya planına göre toplanan tüm dokuları işlemek. </li><li> Dondurulmuş doku kesitlerinde Cut IF tavşan antikorları ve fare kompleman sistem bileşenlerinin tespiti. </li><li> Dondurulmuş doku ve / veya organ ekstre farklı enzim ve protein içeriği (MPO tahlil) analiz edin. </li><li> Bölüm parafine gömülü dokuda ve doku hasarı ölçüde görselleştirmek için H &amp; E ile leke. </li><li> ELISA, immunoblotting tarafından plazma analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
<li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%CE%B2+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li>
<li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li>
<li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li>
<li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li>
<li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li>
<li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li>
<li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc%CE%B3-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes%2C+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066(2012).</li>
<li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease%2C+bullous+pemphigoid%2C+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen%2C+BP180%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li>
<li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li>
<li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis%3A+passive+transfer+from+man+to+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li>
<li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+%28Witebsky%27s+postulates+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).</li>
<li>Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita.</a> Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).</li>
<li>Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+type+VII+collagen+mediate+Fcgamma-dependent+neutrophil+activation+and+induce+dermal-epidermal+separation+in+cryosections+of+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin.</a> Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).</li>
<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Deney hayvanlarının içine otoantikorların pasif transfer onların patojenite 7, -12 göstermek için önemli bir yaklaşımdır. Bu yöntemle elde edilen hayvan modelleri üzerinde, otoimmünite 13 için dolaylı kanıt olmanın yanı sıra, patojenik mekanizmasının efferent faz inceleme sağlar. Epidermolizis bülloza (EBA) ve kabarma antikorun neden granülosit-bağımlı cilt pasif transfer modeli otoimmün dermatozlarda doku hasarının mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Biliyorsunuz kolajen VII karşı otoimmü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> rekombinant antijen </td><td></td><td></td><td> Mürin kolajen VII rekombinant biçimleri için kodlayan plasmidin karşılık gelen yazar temin edilebilir. </td></tr><tr><td> immun tavşan serumu </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Biz antijen 200 mikrogram, 2 haftalık aralıklarla 3 kez ile immünize Beyaz Yeni Zelanda tavşan vardı. Bu amaçla Eurogentec SA, Belçika hizmetleri kullandık. </td></tr><tr><td> Protein A agaroz </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c fareleri </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Ekim bileşik, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> OCT, optimum kesim sıcaklık </td></tr><tr><td> Cryomold standart </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 mm × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold ara </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm × 15 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Histoloji işleme ve gömme kasetleri </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co KG </td><td> 71492000 </td><td> yapıştırma dövme </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> Cihaz dövme </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 7692.1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehit% 37 </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Ksilazin hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> steril PBS </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> dijital fotoğraf makinesi </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga filtre ünitesi 0.45 mikron tahrik </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (distribütör) </td></tr><tr><td> hastalığı puanlama sac </td><td></td><td></td><td> Örneğin enclosed </td></tr></tbody></table>

granülosit-bağımlı otoantikor indüklenen cilt kabarcıklanma

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Otoimmün fenomenler sağlıklı bireylerde ortaya, ama öz-hoşgörü başarısız olduğunda, otoimmün yanıtı spesifik bir patoloji neden olabilir. Göre Witebsky sitesi, otoimmün bir hastalık tanısında kullanılan kriterlerden biri önermeleri otoantikorların pasif transferi ile deney hayvanlarında hastalık üreme olduğunu. Epidermolizis için bülloza (EBA), deri ve mukoza bir prototipi organ-spesifik otoimmün hastalık, çeşitli deneysel modeller yakın zamanda kuruldu. Kolajen VII 200 amino asit (aa 757-967) bir streç karşı IgG antikorları saflaştırılmış, bugünkü iş tarif hayvan modelinde kabarma fenotipi yanı sıra insan için karakteristik histolojik ve immunopatolojik özellikleri üreten farelere sürekli enjekte edilir İTÇ 1. Tam teşekküllü bir yaygın hastalık genellikle ilk enjeksiyondan sonra 5-6 gün görülen ve hastalığın yaygınlığını yönetilen c dozu ile ilişkilidir edilirollagen VII-spesifik IgG. Deneysel EBA doku hasarı (kabarcık oluşumu) -4 doku bağlı otoantikorlar 2 ile granülosit alımı ve aktivasyon bağlıdır. Örnek efferent otoimmün tepki sadece T hücre-bağımsız bir faz üretir Bu nedenle, bu model, otoimmün doku hasarına neden granülosit-bağımlı enflamatuvar yolunun diseksiyon sağlar. Ayrıca, değeri in vivo otoantikorların blister uyaran potansiyelini gösteren ve İTÇ 1,3, -6 yılında blister oluşumu mekanizması araştıran çok sayıda çalışma tarafından belirlenmektedir. Son olarak, bu model oldukça otoantikor kaynaklı hastalıklarda yeni bir anti-inflamatuar tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Genel olarak, İTÇ pasif transfer hayvan modeli, erişilebilir ve öğretici hastalık modeli ve araştırmacılar İTÇ patogenezi sadece analiz etmek değil, temel biyolojik ve klinik cevap yardımcı olacakesansiyel otoimmünite sorular.

Klinik, histolojik ve immunopatolojik düzeyde insan İTÇ benzeyen farelerde tam şişmiş bir hastalık spesifik antijen antikor sonuçları, pasif transfer. Kabarcıklar, kabuklar, erozyonlar ve alopesi kulakları, burunları, pençeleri, bacaklar, sırt ve farelerin göz etrafında gelişir. Hastalığın ilk klinik bulguların muhtemelen kulak ve / veya kafa alanı görünecektir. Belirli tavşan IgG ve fare kompleman C3 çökelmesi IF perilezyonel deri cryosections içinde dermal epidermal bileşkede doğrudan tarafından tespit edilir. Lezyond...

Kolajen VII 200 amino asit (aa 757-967) bir streç karşı IgG antikorları saflaştırılmış, bugünkü iş tarif hayvan modelinde kabarma fenotipi yanı sıra insan için karakteristik histolojik ve immunopatolojik özellikleri üreten farelere sürekli enjekte edilir epidermolizis bülloza (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granülosit-bağımlı otoantikor indüklenen Cilt Kabarcıklanma

Otoimmün fenomenler sağlıklı bireylerde görülür, ancak öz-tolerans başarısız olduğunda, otoimmün yanıt spesifik bir patoloji ile sonuçlanabilir. ...-e göre

Ben Almanya'daki Fryberg Üniversitesi Dermatoloji Bölümü'nden Cassian RO. Laboratuvarımızın araştırmaları, otoimmün cilt hastalıklarının patogenezi üzerine odaklanmıştır. İlgilendiğimiz otoimmün hastalıklardan biri olan Epidermolysis QUISTA veya EBAA, iyi tanımlanmış bir antijen oto-antikor sistemine sahip organ spesifik bir otoimmün hastalıktır ve bu hastalık için birbirini tamamlayan exvivo ve hayvan modelleri mevcuttur.EBA'nın vezikül oluşumu, tip yedi kolajene karşı antikorların farelere pasif transferi (PE) ile yeniden üretilebilir. Bu nedenle, bu video makalesinde, kolajen yedi spesifik antikorların pasif transferi yoluyla farelerde deri vezikülasyonunun indüklenmesini ve analizini sunacağız. Merhaba, ben Freiburg Üniversite Hastanesi Dermatoloji Bölümü'ndeki CAS Grubu'ndan King OBA.Bu videoda, EBA'nın deneysel fare modelinin patojenik otoantikorların pasif transferi ile nasıl indüklendiğini göstereceğiz. Bu prosedürü, otoimmün cilt bozukluklarındaki olası patomekanizmaları incelerken veya patojenik epitopları araştırırken kullanıyoruz. EBA için pasif transfer modeli oluşturulurken, yaban tipi BALB/c farelerine otoantikor enjeksiyonu yapılmadan önce birkaç ek adım gerçekleştirilmelidir.İlk adım olarak beyaz tavşanlara saflaştırılmış rekombinant antijen deri altına enjekte edilir. Tavşan serumundan toplam IgG, afinite kolon kromatografisi ile izole edilir ve ardından vahşi tip farelere enjekte edilir. Enjeksiyonlar iki günde bir toplam dört kez deri altına uygulanır ve iki günlük aralıklarla kan alınır.Farelerin genel durumları ve kutanöz lezyon belirtileri günlük olarak incelenir. Deney sırasında, her bir birey için hastalık aktivitesini yansıtan klinik skorlar hesaplanır ve ilk enjeksiyondan iki hafta sonra hayvanlar sakrifiye edilerek serum örnekleri ile deri biyopsileri alınır ve ayrıca analiz edilir. İnkübasyon süresinin ardından, dikey bir destek rafına yerleştirilen kolonun altı açılır, hafifçe vurulur ve akış toplanır.50 mL'lik Falcon tüplerinde, immünofloresan analiz onayı alınana kadar akışa izin verin; ardından ultrafiltrasyon yöntemiyle, özel Amicon tüplerinde 4 °C'de 30 dakika boyunca 3.220 ×g'de seyreltilmiş IgG'yi spesifik antikor içermeyen konsantre haline getirin. Konsantrasyon işlemi, elüatı bir filtreden geçirip akış kısmını atmak, tüpü yeniden doldurmak ve elüat kalmayana kadar bu işlemi tekrarlamak şeklinde gerçekleştirilir. Son adım olarak 1× PBS ile yıkayın, sarımsı yapışkan konsantre IgG'yi toplayın, konsantrasyonunu ölçün ve uygun şekilde etiketlenmiş tüplerde saklayın.Otoantikorların gerçek enjeksiyonuna başlamadan önce, dolaylı immünofloresan yöntemle özgüllüklerini ve titrelerini değerlendirin. Normal hafif deri kriyobölümlerini, konsantre IGT preparasyonunun seri dilüsyonları ile inkübe edin ve uygun sekonder antikor ile işaretlenmiş immün floresan birikimlerini, hayvan tesisine gitmeden önce fotoğraflarını çekerek görselleştirin. Hayvan protokolünün yazıldığından ve tüm malzemelerin hazırlandığından emin olun.Kan ve doku örnekleri için etiketlenmiş tüpler ile hastalık aktivitesinin klinik skorlamasına yönelik veri sayfaları. Uygun hacmin enjekte edilebilmesi için seyreltilmiş antikor solüsyonu. Taze antikoagülan ve anestezi maddesi ile sterilize edilmiş cerrahi aletler ve şırıngalar.Kontrol listesine bir kumpas ve dijital kamera da eklenmelidir. Çalışma yüzeyi temizlendikten ve izoflorin düzeneği hazırlandıktan sonra, kan çekimi için şırınga heparinize edilmeli ve bir insülin şırıngası antikor çözeltisi ile doldurulmalıdır. Fare kafesten çıkarılmalı, kimlik numarası kontrol edilmeli ve tartılmalıdır.Ölçülen ve gözlemlenen tüm verileri fare Kişisel Veri ve Klinik Skorlama Çizelgesi'ne kaydedin. Fare zaten ssis altındayken kulak kalınlığını ölçün, ardından hayvanın cilt ve kürk görünümünü kontrol edin. Baş bölgesine, sırta, karna ve ekstremitelere özel dikkat gösterin.Kuyruk veninin üst üçte birlik kısmına uygulanan küçük bir insizyon aracılığıyla kan alın; tüyleri dezenfekte edin ve sırt kısmındaki deriyi kaldırarak IgG solüsyonunu dikkatlice subkütan olarak enjekte edin. Laboratuvar ortamına dönüldüğünde, serumu elde etmek için kanı oda sıcaklığında 1.200 ×g hızda 10 dakika santrifüjleyin. Numuneyi uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın ve plan doğrultusunda saklayın.Fareleri, eritem, alopesi ve cilt lezyonları gelişmeye başladığında hastalık belirtileri açısından günlük olarak inceleyin. Ağırlıklarını ölçmenin yanı sıra hastalık aktivitesini değerlendirin. Fareyi anestezi altına almak için ketamin-ksilazin karışımını deri altına enjekte edin.Kulak kalınlığını ölçün ve ardından genel vücut kontrolüne başlayın. Olası etkilenmiş bölgeleri açığa çıkarmak için kavisli ince uçlu pensler kullanarak tüyleri çıkış yönünün tersine doğru tarayın. Yüz çevresinde sistematik olarak ilerleyin.Göz ve burun çevresinden kulakların dış ve iç kısımlarına doğru hareket edin ve ardından başın diğer tarafını da kontrol edin. Ağız boşluğu mukozası, burnun ventral kısmı ve abdominal bölge ile devam edin. Dorso-lateral, dorsal ve boyun bölgesinin yanı sıra ön ekstremiteleri ve elleri kontrol edin.Kayda geçen lezyonların boyutunu; kaplanan cilt alanı, belirli vücut bölümlerinin ve bölgelerinin farenin toplam cilt yüzeyine oranındaki yüzdesi şeklinde forma işleyerek miktarlandırın. Toplam etkilenen cilt ve mukoza membran alanı temel alınarak klinik bir hastalık skoru hesaplanır. Son olarak, ilgili vücut bölümlerinin ve hastalıklı alanların fotoğraflarını çekin.Deneyin sonunda, hayvanları derin nekroz altında sakrifiye edin ve kan ile doku örneklerini toplayın. Bu deneysel düzende kulaklar, kuyruk ve özofagus en sık alınan bölgelerdir. Lezyonlu deri biyopsilerini daha küçük şeritler halinde kesin.Bunları histoloji işlem ve gömme kasetlerine yerleştirin ve parafine gömülene kadar %3,7 formaldehyde saklayın. Ardından, örnekleri immünofloresan analiz için h ve e boyama işlemine tabi tutun. Peral deri şeritlerini Optimal cutting temperature medium içine gömün ve altı mikrometre kalınlığında kesitler almak için bir kriyostat kullanın.Dokuya bağlı spesifik tavşan antikorlarını ve fare kompleman bileşenlerini görüntülemek için direkt immünofloresan analizi gerçekleştirin; ek bir analiz olarak, dolaşımdaki otoantikor seviyelerini ölçmek amacıyla rekombinant antijen kaplı mikro titrasyon plakaları ve fare serumunun seri dilüsyonlarını kullanarak ELISA uygulayın. Kollajen seven spesifik antikorların pasif transferi, farelerde klinik, histolojik ve immünopatolojik düzeylerde insan EBA'sına benzeyen tam gelişmiş bir hastalıkla sonuçlanır. Farelerin kulağında, göz çevresinde, burnunda, patilerinde, bacaklarında ve sırtında insan EBA benzeri bülleler, kabuklanmalar, erozyonlar ve alopesi gelişir.Deney boyunca artış eğilimi gösteren hastalık aktivitesi, etkilenen deri ve mukoza membran alanı üzerinden hesaplanmıştır. Dermal epidermal bileşkede indirekt immünofloresan ile tespit edilen spesifik tavşan IgG ve fare kompleman C3 birikimini tasvir eden temsili sonuçlar verilmiştir. Burada peral deri kriyoseksiyonları gösterilmektedir.Kontrollerde IgG veya kompleman C3 saptanmamıştır. Lezyonlu derinin ardından yapılan histolojik analizi, subepidermal bülleler ve inflamatuar infiltrasyonu ortaya çıkarmaktadır. Ancak, kontrol grubu uygulandığında subepidermal bül oluşumu görülmemektedir.Burada gösterildiği gibi, subepidermal bül oluşumunda kullanılan otoantikor modeli, otoantikorlar tarafından tetiklenen ve doku hasarıyla sonuçlanan ROS bağımlı inflamatuar yolakların detaylı incelenmesine büyük katkı sağlayacaktır. Sağlam tasarımı ve basit protokolü, bu modeli otoantikor kaynaklı hastalıklarda yeni antiinflamatuar tedavilerin geliştirilmesi ve test edilmesi için de uygun kılmaktadır.

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dermatitis herpetiformis (DH) IgA ve epidermal transglutaminaz (ETG) arasında otoimmün bir reaksiyon ile karakterize kronik inflamatuar bir durumdur. DH gluten duyarlı ve / veya çölyak hastaların çok küçük bir kısmında gelişir. Bu çalışmanın sonuçları, DH de Rhesus maymun konak idiyopatik dermatit semptomları ile geliştirebilir göstermektedir.

Nadir bir Case IgA ve Doku Transglutaminaz 2 Antikorlar Epidermal Transglutaminaz tanınması Rhesus Dermatit

Dolaylı immünofloresan (IIF) deneyleri, geleneksel olarak, insan serumunda antinükleer antikorlar (ANA) tespiti için kullanılmıştır. Bu antikorların varlığı, sistemik otoimmün romatizmal hastalıklar (SARD) teşhisinde yardımcı olabilir. Bu protokol etkili doğru bu otoantikor saptamak için IIF tekniği gerçekleştirmek için nasıl gösterir.

Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Burada, bir gösteri emme blister kutanöz geri çekme modeli sağlamak. Model insan vivo içinde edinilmiş bağışıklık yanıtı, örneğin aşı geliştirme bağlamında incelemek basit bir erişim sağlar.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Bu iletişim kuralı hangi autoreactive photoactivatable yeşil flüoresan protein (PA-GFP) muhabir lenfositleri taşımak spontan otoimmün germinal merkezleri ile karışık fare kemik iliği chimeras nesil açıklar. Bu hücresel aşağı akım moleküler ve fonksiyonel analizleri kurcalayarak konumda bağlantı olanağı sağlar.

Bireysel Autoreactive Germinal merkezleri Photoactivation otoimmünite, karışık Chimeric modeli tarafından sorguya

Bazofil aktivasyon testi, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla spesifik bir uyaran varlığında bazofil aktivasyonunun saptanmasına dayanan IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir.

Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi

Çalışma, epikütan (EC) bağışıklama yoluyla farelerde bağışıklık tepkilerini modüle etmede cildin rolünü göstermektedir. Bir protein antijeni ile EC bağışıklaması, patojenle ilişkili moleküler paternlerle birleştirildiğinde temas aşırı duyarlılığında veya ters cilt kaynaklı baskılamada bağışıklık tepkilerini baskılayabilir. EC bağışıklaması, immünoterapiye etkili, iğnesiz bir yaklaşım olarak umut vaat etmektedir.

Epikütan İndüklenen İmmünomodülasyonun Murin Modeli

Deri lezyonları birçok romatizmal hastalıkta sık görülen ve önemli özelliklerdir ve patolojik inceleme ile biyopsi yapılması tanıda kritik rol oynar. Bu makale, standardize deri biyopsisi prosedürüne ayrıntılı bir genel bakış sunmakta ve örnek olarak diskoid lupus eritematozus kullanarak, romatizmal hastalıkların teşhisinde dermatopatolojinin önemli rolünü vurgulamaktadır.

Diskoid Lupus Eritematozus Tanısı için Deri Biyopsisi

Intradermal enjeksiyonu ile kutanöz leishmaniasis için deneysel Hamster model...

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Keşfedin, farelerde kolajen VII antikorları ile pasif transfer yöntemiyle cilt kabarcıklanmasının indüksiyonunu ve analizini. Bu model, epidermolizis bulloza akvizita patogenezini anlamak için kullanılır.

Granülosit-bağımlı otoantikor indüklenen Cilt Kabarcıklanma

Daha fazla video keşfet