Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Bu prosedürün genel amacı, yeni ayrışmış mezenterik arter düz kas hücrelerinde KV yedi potasyum kanalının aktivitesini ölçmek ve bunu fizyolojik koşullar altında kaydedilen arteriyel çap ölçümleriyle ilişkilendirmektir. Bu, önce mezenterik vasküler arcade'nin bir sıçandan cerrahi olarak çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mezenterik arterlerin segmentlerini incelemek ve temizlemektir.

Daha sonra, KV yedi potasyum akımının yama kelepçesi elektrofizyolojik ölçümleri için bireysel düz kas hücrelerini izole etmek için bazı segmentler kullanılır. Son adım, KV yedi potasyum kanalının farmakolojik modülatörlerine yanıt olarak arteriyel daralma veya dilatasyonun basınç miyo ölçümleri için sağlam arteriyel segmentlerin kanülasyonudur. Sonuç olarak, yama klemp elektrofizyolojisi ve basınç miyografisinin kombinasyonu, KV yedi potasyum kanalının aktivitesindeki bir artış veya azalmanın mezenterik arteriyel daralmayı nasıl etkilediğini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin, hücre hatlarında ifade edilen klon kanallarının kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, akımların, kanalları doğal olarak ifade eden kültürlenmemiş hücrelerden kaydedilmesi ve KV akımlarının, aynı hücrelerde aktive edilebilecek diğer potasyum kanal sınıflarından izole edilebilmesidir. Basınç miyografisi, izole edilen hücrelerin türetildiği aynı dokudan fonksiyonel yanıtların kaydedilmesine izin verir ve yöntem, arteriyel halkalar veya arteriyel şeritler gibi diğer preparatlardan hem daha hassas hem de daha fizyolojiktir. Laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Bareth Mani, arteriyel kanülasyon ve basınç miyografi tekniklerini gösterecek ve laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Dr.Luba Brueggeman, hücre izolasyonu ve yama planı prosedürlerini gösterecek.

Bu işleme başlamak için, bir farenin ince bağırsağının her iki ucunda 10 ila 12 santimetrelik bir segment kesmek için bir çift cerrahi makas kullanın. Daha sonra bağırsağı bağlı damar sistemi ile birlikte izole edin. Ardından, ince bağırsak segmentini sabitleyin.

Mezenteri, superior mezenterik arterin birincil dalı merkezde olacak ve sonraki dal sırası merkezden yayılacak şekilde odanın yakın tarafına yayın. Daha sonra pimleri sadece ışıklı bir diseksiyon mikroskobu ile görselleştirerek bağırsak segmentlerine yerleştirin. Mikro forseps ve makas kullanarak bağırsaklara yakın ikinci ila dördüncü dereceden arterleri çevreleyen yağ dokusunu ve bağ dokusunu dikkatlice temizleyin.

Yağ dokusunun ve bağ dokusunun temizlenmesini kolaylaştırmak ve arterlerin gereksiz yere gerilmesini önlemek için bitişik damarları tutun. Şimdi mezenterik arterin iki ila üç segmentini iki mililitre buz gibi soğuk izolasyon solüsyonu içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Çanağı daha sonra buzun üzerine yerleştirin, mezenterik arter segmentlerini ateşle parlatılmış bir uçlu pipetinizi kullanarak üç ila dört milimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin.

Arteriyel segmentleri, iki mililitre önceden ısıtılmış 37 santigrat derece izolasyon çözeltisi içeren bir cam şişeye aktarın. Daha sonra 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, 37 santigrat derece izolasyon solüsyonunu bir posterior pipetle dikkatlice aspire edin.

Üzerine iki mililitre ılık enzim çözeltisi ekleyin, ardından 37 santigrat derecede 35 dakika inkübe edin. Enzim çözeltisinde 35 dakikalık inkübasyondan hemen sonra, şişeyi buzun üzerine yerleştirin, enzim çözeltisini aspire edin ve iki mililitre buz gibi soğuk izolasyon çözeltisi ekleyin. Bu işlemi dört kez tekrarlayın.

Daha sonra bir mililitre buz gibi soğuk izolasyon solüsyonunda, cilalı arka pipet ile arteriyel segmentleri nazikçe yineleyin. Tek tek mezenterik arter düz kas hücrelerini serbest bırakmak için 10 ila 20 kez. 35 milimetrelik bir tabağa bir damla hücre süspansiyonu koyarak ve mikroskop altında görüntüleyerek miyositlerin görünümünü periyodik olarak doğrulayın.

Sağlıklı MA SMC'ler pürüzsüz, uzun bir görünüme sahip olmalıdır. Daha sonra, yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu cilalı bir macun pipeti ile kayıt odasına aktarın ve hücrelerin 15 dakika yapışmasına izin verin. Bu adımda, yama pipetinin ucunu, pipet ucunu içine atarak serbest iç çözelti olan amfoterisin B ile doldurun.

Ardından, bir boru parçasına bağlı 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak diğer ucuna emme uygulayın ve üstten pipet çözeltisi içeren bilgi terin B ekleyin. Pipetin yaklaşık yarısı çözelti ile dolana kadar bir einor mikro yükleyici pipet ucu kullanın. Pipete hafifçe vurarak hava kabarcıklarını çıkarın.

Bundan sonra, pipeti elektrot tutucusuna yerleştirin. Pipeti uzun bir miyositin yüzeyine indirmek için bir mikro manipülatör kullanın. Pipetin direnci altı ila 10 mega ohm'a yükseldiğinde, bir giga sızdırmazlık elde etmek için emme uygulayın.

Aynı zamanda, membran perforasyonunu beklerken tutma voltajını sıfır milivolta ayarlayın. Ardından, artı 10 milivolta ve ardından eksi 10 milivolta 100 milisaniye voltaj adımları uygulayın. Tüm hücre kapasitansının görünümüyle eş zamanlı olarak hızlı pipet kapasitansı geçici durumunu telafi etmek için amplifikatörü kullanın.

Geçici küçük sürekli pozitif akımlar iki ila 10 PICO amp, saf ve genlik, fonksiyonel KV yedi kanalının varlığını gösterir. Amfoterisin B ile başarılı perforasyon, erişim direncini 35 mega ohm veya altına düşürecektir. KV yedi akım voltajı ilişkisini kaydetmek için, KV yedi kanalının açık olasılığının minimum olduğu eksi 84 milivolt ile KV yedi kanalının açık olasılığının bir platoya ulaştığı artı 16 milivolt arasında değişen voltajlara beş saniyelik voltaj adımları uygulayın Her test voltajında beş saniye sonra, 10 saniye boyunca eksi dört milivolttaki tutma voltajına geri dönün.

Bu prosedürde, her iki tarafta önceden yapılmış iki ince naylon sütürü gevşek bir şekilde askıya alın. Cam kanülün bitişiğinde, diseke edilmiş mezenterik arter segmenti, diseksiyon odasından basınçlı myo greft haznesine, segmentin bir ucu bir çift mikro forseps kullanılarak tutularak dikkatlice aktarıldı. Daha sonra, ışıklı bir diseksiyon mikroskobu ile görselleştirmek, arter segmentinin bir ucunu tutun ve yavaşça sol cam kanülün üzerine kaydırın.

Naylon dikişleri kullanarak ucu sabitleyin. Ardından, kan ve kalıntıları temizlemek için lümen sıvısını monte edilmiş damardan nazikçe yıkayın. Sol şırıngaya giden valf daha sonra kapatılmalıdır, böylece bu taraf, mikro manipülatör kullanılarak basıncın sağ taraftan ayarlandığı statik bir sıvı sütunu sunar, hareketli sağ cam kanülü arter segmentine daha yakın konumlandırın ve segmentin sağ ucunu bunun üzerine çekin.

Son olarak, arter segmentini naylon dikişlerle sabitleyin ve fazla dikiş ipliklerini kesin. Şimdi basınç grafiği ünitesini s'ye monte edintage'yi basınç mikrograf mikroskobu üzerine. Basınç sütununu grafik odasının sağ tarafına bağlayın ve ardından kapağı odanın üzerine yerleştirin.

10 mililitrelik şırıngayı 15 dakikalık bir süre boyunca kademeli olarak kaldırın ve P bir basınç dönüştürücü 80 milimetre cıva okuyana kadar kapta herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin, gerektiğinde kanül arasındaki mesafeyi ayarlayın, mesafe, basınçlı arter segmenti yaklaşık olarak düz olacak ve bağların yapıldığı omuz benzeri bir desen oluşturacak şekilde ayarlanmalıdır. 30 saniye boyunca 60 milimolar potasyum klorür ile geçici süperfüzyon ile monte edilen kabın canlılığını kontrol edin. Canlı bir kap, potasyum klorür ilavesiyle hızla daralır ve yıkandıktan hemen sonra genişler.

Daha sonra, konsantre test maddesini doğrudan banyo solüsyonuna ekleyin, test maddesini banyo solüsyonunda karıştırmak için haznenin ucuna yakın bir yerde hafifçe ileri geri pipetleyin ve 10 mililitrelik haznede uygun nihai konsantrasyonu elde edin. Test maddesinin eklenmesini takiben kap çapındaki hacim değişiklikleri, canlı video görüntüsünde izlenebilir ve ayrıca deney devam ederken görüntü analiz penceresinde grafikte gösterilebilir. Bu şekil, siyah ile gösterildiği gibi tedaviden önce voltaj adımlarına yanıt olarak kaydedilen bir sıralı akım izleri ailesini göstermektedir ve kırmızı ile gösterildiği gibi tek bir mezenterik arter miyositinde 100 nanomolar çinko perion varlığında stabilizasyonu takiben, burada kontrol ve 100 nanomolar çinko perion için temsili akımlar verilmiştir.

Gri çubuklar, ortalama akım genliklerinin ölçüldüğü zaman aralığını gösterir Akım voltajı grafikleri için, adım voltajları sağda ok uçlarıyla gösterilir. Bu, eksi 20 milivoltta sürekli voltaj kelepçesi ile ölçülen 100 nanomolar çinko perion ile KV yedi akım artışının zaman seyridir. Gösterilen. Burada, 100 nanomolar çinko perion ile tedavi sırasında ve KV yedi kanal blokeri XC 9 9 1'in 10 mikromolar ile tedavi sırasında kaydedilen KV yedi akım yoğunluğundan türetilen ortalama akım voltaj eğrileri, 100 pikomolar arginin vazopressin ile önceden daraltılmış mezenterik arterin indüklenen gevşemesi.

Bu şekil, 100 pikomolar arginin vazopressin uygulamasına ve ardından 100 nanomolar çinko iyonunun uygulanmasına yanıt olarak kabın dış çapındaki değişikliklerin zaman seyrini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücrelerin izolasyonu için arterlerin nasıl hazırlanacağını veya arteriyel daralmanın, dilatör yanıtlarının basınç miyografik ölçümü için nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Ek olarak, yeni izole edilmiş arteriyel miyositlerdeki diğer akımlardan izole olarak KV yedi akımını nasıl kaydedeceğinizi bilmelisiniz.