Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Bu prosedürün genel amacı, taze olarak disosiye edilmiş mezenterik arter düz kas hücrelerindeki KV seven potasyum kanallarının aktivitesini ölçmek ve bunu fizyolojik koşullar altında kaydedilen arter çapı ölçümleriyle ilişkilendirmektir. Bu işlem, öncelikle bir sıçandan mezenterik vasküler arkadın cerrahi olarak çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mezenterik arter segmentlerinin diseke edilmesi ve temizlenmesidir.

Ardından, KV seven potasyum akımlarının yama kenetleme (patch clamp) elektrofizyolojik ölçümleri için tekil düz kas hücrelerini izole etmek amacıyla bazı segmentler kullanılır. Son adım, KV seven potasyum kanallarının farmakolojik modülatörlerine yanıt olarak arteriyel daralma veya genişlemenin basınç miyografisi ölçümleri için sağlam arteriyel segmentlerin kanülasyonudur. Nihayetinde, yama kenetleme elektrofizyolojisi ve basınç miyografisinin kombinasyonu, KV seven potasyum kanallarının aktivitesindeki artış veya azalışın mezenterik arter daralmasını nasıl etkilediğini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin, hücre hatlarında eksprese edilen klon kanalların kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, akımların kanalları doğal olarak eksprese eden kültürlenmemiş hücrelerden kaydedilmesidir ve KV akımları, aynı hücrelerde aktive olabilecek diğer potasyum kanalı sınıflarından izole edilebilmektedir. Basınç miyografisi, fonksiyonel yanıtların izole hücrelerin elde edildiği aynı dokudan kaydedilmesine olanak tanır ve bu yöntem, arteriyel halkalar veya arteriyel şeritler gibi diğer preparasyonlardan hem daha hassas hem de daha fizyolojik bir yaklaşımdır. Laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Bareth Mani, arteriyel kanülasyon ve basınç miyografisi tekniklerini; laboratuvarımdaki araştırma yardımcı profesörü Dr. Luba Brueggeman ise hücre izolasyonu ve patch clamp prosedürlerini uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu prosedüre başlamak için, bir çift cerrahi makas kullanarak bir sıçanın ince bağırsağının her iki ucundan 10 ila 12 santimetrelik segmentler kesin. Ardından, bağırsağı bağlı olan damar yapısıyla birlikte izole edin. Sonrasında, ince bağırsak segmentini iğneleterek sabitleyin.

Mezenteri, superior mezenterik arterin ana dalı merkezde olacak ve sonraki dallar merkezden dışarıya doğru yayılacak şekilde haznenin yakın tarafına yayın. Ardından, aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobu altında izleyerek pinleri yalnızca intestinal segmentlerin üzerine yerleştirin. Mikro pens ve makas kullanarak, bağırsaklara yakın olan ikinci ile dördüncü derece arterlerin etrafındaki adipoz dokuyu ve bağ dokusunu dikkatlice temizleyin.

Adipoz dokunun ve bağ dokusunun temizlenmesini kolaylaştırmak ve arterlerin gereksiz yere gerilmesini önlemek için komşu venleri tutun. Şimdi mezenterik arterden iki ila üç segmenti, iki mililitre buz soğukluğunda izolasyon solüsyonu içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Ardından kabı buz üzerine yerleştirin ve mezenterik arter segmentlerini, uçları ateşle parlatılmış bir PEs pipet kullanarak üç ila dört milimetre uzunluğunda parçalara bölün.

Arteriyel segmentleri, 37 °C'ye önceden ısıtılmış iki mililitre izolasyon çözeltisi içeren cam bir viyale aktarın. Ardından 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, 37 °C'deki izolasyon çözeltisini bir pastör pipetiyle dikkatlice aspire edin.

İçine iki mililitre ılık enzim çözeltisi ekleyin, ardından 37 °C'de 35 dakika inkübe edin. Enzim çözeltisi içindeki 35 dakikalık inkübasyonun hemen ardından tüpü buza yerleştirin, enzim çözeltisini aspire edin ve iki mililitre buz gibi soğuk izolasyon çözeltisi ekleyin. Bu prosedürü dört kez tekrarlayın.

Ardından, bir mililitre buz soğukluğunda izolasyon çözeltisi içinde, arter segmentlerini cilalı posterior pipetle nazikçe 10 ila 20 kez tritüre ederek tekil mezenterik arter düz kas hücrelerini serbest bırakın. Hücre süspansiyonundan bir damlayı 35 milimetrelik bir kaba yerleştirip mikroskop altında inceleyerek miyositlerin görünümünü periyodik olarak doğrulayın.

Sağlıklı MA SMC'ler pürüzsüz ve uzamış bir görünüme sahip olmalıdır. Ardından, cilalanmış bir pastier pipeti ile yaklaşık 100 ila 200 microliters hücre süspansiyonunu kayıt odasına aktarın ve hücrelerin tutunması için 15 dakika bekleyin. Bu adımda, patch pipetinin ucunu amphotericin B içermeyen iç solüsyona batırarak ucunu doldurun.

Ardından, bir boru parçasıyla bağlanan 10 mililitre şırıngayı kullanarak diğer uçtan vakum uygulayın ve üstten pipet çözeltisi içeren info terin B ekleyin. Pipet, çözelti ile yaklaşık yarıya kadar dolana kadar einor mikro yükleyici pipet ucu kullanın. Pipete hafifçe vurarak hava kabarcıklarını giderin.

Ardından, pipeti elektrot tutucuya yerleştirin. Pipeti uzamış bir miyositin yüzeyine indirmek için bir mikro manipülatör kullanın. Pipetin direnci 6 ila 10 mega ohm değerine yükseldiğinde, giga seal oluşturmak için vakum uygulayın.

Aynı zamanda, membran perforasyonunu beklerken tutma voltajını sıfır milivolt olarak ayarlayın. Ardından, artı 10 milivolt ve sonrasında eksi 10 milivolta 100 milisaniyelik voltaj basamakları uygulayın. Tüm hücre kapasitansı ortaya çıktığında, pipetin hızlı kapasitans geçişini kompanse etmek için amplifikatörü kullanın.

İki ila 10 pA arasındaki geçici küçük süreli pozitif akımlar, saf ve genlik değerleri, fonksiyonel KV7 kanallarının varlığını gösterir. Amfoterisin B ile başarılı perforasyon, erişim direncini 35 MΩ veya altına düşürecektir. KV7 akım-voltaj ilişkisini kaydetmek için, KV7 kanallarının açık olma olasılığının minimum olduğu -84 mV'den, açık olma olasılığının bir platoya ulaştığı +16 mV'ye kadar değişen voltaj adımlarını beş saniye boyunca uygulayın. Her test voltajında beş saniye bekledikten sonra, 10 saniye boyunca -4 mV tutma voltajına geri dönün.

Bu prosedürde, her iki tarafa önceden hazırlanmış iki adet ince naylon sütür gevşekçe asın. Diseke edilmiş mezenterik arter segmentini, bir ucundan mikro pensle tutarak diseksiyon haznesinden basınçlı miyograf haznesine, cam kanülün yanına dikkatlice aktarın. Ardından, aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobu aracılığıyla görüntüleyerek, arter segmentinin bir ucunu tutun ve nazikçe sol cam kanülün üzerine kaydırın.

Ucu naylon sütürler kullanarak sabitleyin. Ardından, kanı ve kalıntıları temizlemek için monte edilmiş damarın lümenini nazikçe sıvı ile yıkayın. Sol şırıngaya giden valf, bu tarafın sağ taraftan ayarlanan basınca karşı statik bir sıvı sütunu oluşturması için kapatılmalıdır; mikromanipülatörü kullanarak hareketli sağ cam kanülü arter segmentine yaklaştırın ve segmentin sağ ucunu kanülün üzerine çekin.

Son olarak, arter segmentini naylon süturlarla sabitleyin ve fazla sütur ipliklerini kesin. Şimdi, basınç mikrograf mikroskobunun üzerindeki sahneye basınç grafik ünitesini yerleştirin. Basınç kolonunu grafik odasının sağ tarafına bağlayın ve ardından kapağı odanın üzerine yerleştirin.

10 mililitrelik şırıngayı 15 dakikalık bir süre boyunca kademeli olarak yükseltin ve P one basınç dönüştürücüsü 80 milimetre civa değerini okuyana kadar kapta herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin; gerektiğinde kanül arasındaki mesafeyi ayarlayın. Mesafe, basınçlandırılmış arter segmentinin yaklaşık olarak düz olduğu ve bağların yapıldığı noktalarda omuz benzeri bir yapı oluşturduğu şekilde ayarlanmalıdır. Monte edilen kabın canlılığını, 30 saniye boyunca 60 milimolar potasyum klorür ile yapılan geçici superfüzyonla kontrol edin. Canlı bir kap, potasyum klorür ilavesiyle hızla büzülür ve yıkanma ile birlikte hemen genişler.

Ardından, konsantre test maddesini banyo çözeltisine ekleyin; test maddesini banyo çözeltisiyle karıştırmak ve 10 mililitrelik haznede uygun nihai konsantrasyonu elde etmek için haznenin ucuna yakın bölgede pipetle nazikçe ileri geri çekme işlemi yapın. Test maddesi eklendikten sonra kap çaprındaki hacim değişiklikleri, deney devam ederken canlı video görüntüsünden izlenebilir ve görüntü analiz penceresinde grafikleştirilebilir. Bu şekil, tek bir mezenterik arter miyositinde, siyahla gösterilen tedavi öncesi voltaj basamaklarına yanıt olarak kaydedilen ve kırmızıyla gösterilen 100 nanomolar çinko perion varlığındaki stabilizasyon sonrası kaydedilen bir dizi ardışık akım izini göstermektedir; burada kontrol ve 100 nanomolar çinko perion için temsili akımlar yer almaktadır.

Gri çubuklar, ortalama akım genliklerinin ölçüldüğü zaman aralığını belirtmektedir. Akım-gerilim grafikleri için basamak gerilimleri, sağ tarafta ok başlarıyla gösterilmiştir. Bu, -20 mV'da sürekli voltaj klempi ile ölçülen, 100 nM çinko perion tarafından KV7 akımının artışının zaman seyridir. Burada, 100 nM çinko perion ile işlem öncesinde, işlem sırasında ve 10 µM KV7 kanal blokeri XC 9 9 1 ile işlem sırasında kaydedilen KV7 akım yoğunluklarından türetilen ortalama akım-gerilim eğrileri gösterilmiştir. 100 pM arjinin vazopressin ile önceden daraltılmış mezenterik arterin çinko iyonu ile indüklenen relaksasyonu.

Bu şekil, 100 pikomolar arginin vazopressin uygulamasının ve ardından 100 nanomolar çinko iyonu uygulamasının ardından damar dış çapındaki değişimlerin zaman seyrini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre izolasyonu veya arteriyel konstrüksiyon ve dilatör yanıtların basınç miyografik ölçümü için arterlerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, taze izole edilmiş arteriyel miyositlerde, diğer akımlardan bağımsız olarak KV seven akımlarının nasıl kaydedileceğini öğrenmiş olmalısınız.