Name: Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin murin myoblast progenitör hücreleri kullanarak mühendislik iskelet kası dokuları üretme yöntemini. Elektrik stimülasyonu ile kasılmaları tetikleyerek rejeneratif tıp ve alternatif et üretimi için fonksiyonel doku geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar kültürleme Şekil 2&#39;de sunulmuştur dokular için Yabin Wu teşekkür etmek istiyorum, resmi Bart van Overbeeke tarafından çekildi. Iş mali SenterNovem, hibe ISO 42022 tarafından desteklenmiştir.

1. Mürin myoblast Progenitör Hücreleri veya C2C12 Hücre Kültürü <ol><li> Başlangıçta Shefer ve arkadaşları 10 tarafından yayımlanan ve Collins et al. 11 ve Boonen ve ark. 12 göre adapte protokolüne göre hücreler izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Bu fareler, örneğin, C57BL / 6 gerektirir. Alternatif yöntemler örneğin Li, Y ve arkadaşları ile görselleştirilmiş Deney yayınlanan bir yöntemi, diğer laboratuarlarda kullanılmaktadır. 13. Reaktifler ve cihazlar için, sayfa 7 ve 8&#39;de verilen tabloda verilir. Tek bir fare kas itibaren genellikle sıvı azot içinde yaklaşık 20 şişeleri cryopreserve yeterli hücre elde edecektir. Sonra, sıvı azot depolama hücrelerinin çözülme için protokol başlar. </li><li> 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) kaplanmış doku kültürü şişesi içine 1 şişeden hücrelerin yerleştirin ve oluşan büyüme ortamı (GM) (335 ml DMEM gelişmiş, 100 ml cenin bovin eklemeke serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin, 5 ml tavuk embriyo özü (OA)). </li></ol> Not: Oda sıcaklığı az 2 saat süreyle ceket ve aspirasyon ile Matrigel çıkarın. <ol start="3"><li> Hücrelerin yaklaşık olarak 3 gün boyunca her 01:03 alt kültür. Bu şu anlama gelir: 3. gün: biri 75 cm 2 balon iki 150 cm 2 matara (kaplamasız şişeler preplating 30 dk) geçişi hücreleri: günde 6, 75 cm 2 balon bir 25 cm 2, gelen Passage hücreler. Günde 9 tek transfer 150 cm 2 balon üç 150 cm 2 matara (gerekirse preplate tekrar hücrelerin fenotipi bağlı olarak) kullanılamayabilir 1 üçlü 150 cm 2 balon veya eğer. Günde 12 hücreleri kas yapı içine tohum hazır bulunmaktadır. </li></ol> Notlar: - Üçlü 150 cm 2 başına hücre sayısı yaklaşık 4,5 x 10 6 hücre olacak. - Via kullanınfarklı izolasyonların gelen ls ekimi sırasında hücre karışık bir nüfus elde etmek karıştırın. Not: birincil piller ile çalışmak istemezseniz, C2C12 miyoblastları iyi bir alternatiftir. 2. Mühendislik İskelet Kası Dokular <ol><li> &quot;Sertleştirici&quot; (10:1) ile &quot;elastomer&quot; karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Tek üçgen tarafı (; Şekil 1 şekil ev gibi) ile Velcro 5 mm kare bölümler + / - Kes. Kare arasında yaklaşık olarak 12 mm arasında bir boşluk bir 6-kuyulu kültür plakasının kuyu içine Tutkal Velcro. </li></ol> Notlar: - Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarıya dönük. - Çatıları birbirine baktığından emin olun. - Sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapak, iyi boyunca tutkal yayılır yok. - Daha sonra elektriksel stimülasyon için bu iyi bir maç dikey yönde yapıları hizalamak alakalı(uzun ekseni boyunca) yedik. <ol start="2"><li> Vakumlu fırın içinde gece boyunca kurumaya bırakın, ısıtmalı değil, öncelikle hava kabarcıklarını çıkarmak için. 15 dakika için inkübe kuyuları ve% 70 EtOH ilave edilerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve 15 dakika UV altında koymak. Kuyulardan tüm PBS ve kullanıma kadar kuvöz Velcro ve yer çıkarın. </li><li> Buzdolabında Matrigel çözüm çözülme ve kısa süre 3D yapıları yapmadan önce istenilen konsantrasyona kollajen solüsyon hazırlanır. Steril% 0.02 asetik asit (nihai konsantrasyon 3.2 mg / ml) ile stok kollajen seyreltilir. </li></ol> Not: buz üzerinde her şeyi bırakın. <ol start="4"><li> GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize. Inkübatör santrifüj tüpündeki hücreler bırakın. </li><li> Bu kollajen çözüm 0.5M NaOH ekleyin, bir tüp (Tablo 1 &#39;e göre) yapmak istediğiniz yapıları numaraları için Kollajen stok solüsyonu istenilen miktarda Ekle açık pembe Colo kadarr 7,5 arasında bir pH değerine işaret etmektedir. Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kabarcık oluşumunu önlemek. Sonra Matrigel ekleyin ve yavaşça ama iyice çok karıştırın. Nihayet, Kollajen / Matrigel karışımı (uygun miktarlarda için Tablo 1&#39;e bakınız) için GM ekleyin. </li></ol> Notlar: - buz üzerinde her adımı gerçekleştirin! Matrigel ve kollajen artan sıcaklıkta kolayca jel olacaktır. - Rengi aslında pembe olduğunu dikkat! PH seviyesindeki artış da hızlı jelleşme neden olacaktır. Kollajen - nihai konsantrasyon: 1.6 mg / ml. <ol start="6"><li> 5 dakika için 1000 rpm&#39;de hücrelerin istenen miktarda santrifüjlenir ve süpernatant çıkarın. </li></ol> Not: - yapı başına hücre sayısı ayarlanması gerektiğinde hücre faaliyeti bağlı olarak değişir. Tipik olarak, hücre sayısını yapı başına 750,000 ila 1,250,000 hücreler yer alır. <ol start="7"><li> Hücre pelet tekrar süspansiyon jel karışımı bazı kullanınve kalan karışımı içine hücreleri aktarmak ve iyice karıştırın, ama hava kabarcıkları tanıtan olmadan. </li><li> Kuvöz ve pipet Velcro ilk içine hücre jel karışımı 0.35 -0.4 ml ısıtılmış kuyucuğu çıkarın. Ardından, ek siteler arasında merkezine karışımı Pipeti ve Velcro uzatmak başlar. Son olarak, Velcro parçaları etrafında iki Velcro çapa ve pipet arasındaki boşluğu doldurmak için jel kalanını da kullanabilirsiniz. </li><li> Jeller aktarılacak yeterince sağlam olup olmadığını dikkatlice 5-10 dakika sonra kontrol edin, yani hafifçe yemekleri dokunun ve jel katı ise görsel inceleyin. Eğer öyleyse, bir inkübatörde yemekleri dikkatle yerleştirin. Genellikle, onlar on dakika sonra alınabilir. Daha sonra, 1-2 saat sonra, yavaşça sıcak GM 4 ml her biri jel üzerinde görüntülenir. </li></ol> Not:-Do tabak tutarken güçlü hareketleri yapamaz. <ol start="10"><li> (Büyüme ortamında farklılaşma, orta GM değiştirincivciv embriyo özü olmadan) 24 saat sonra, ve taze orta 2-3 günde bir ile değiştirin. Gün 7 sitesinde sigortalı kas liflerinin çapraz çizgili gelişimi için boyama ile değerlendirilebilir gibi, olgun odaklı kas liflerinin elde olmalıdır. </li></ol> 3. Elektriksel Stimülasyon <ol><li> Bir güvenlik kabininde UV altında% 70 etanol ve sonra kuru kullanmadan önce ionoptix plaka elektrotlar (reaktifler ve ekipman tabloya bakınız) sterilize edin. Yapıları ile kültür plaka üzerine elektrotlar ile plaka yerleştirin ve kültür plaka ve bir inkübatöre transfer kapağı ile kapatın. Kablolar ile uygun Ionoptix C-pacer bağlayın. </li></ol> Not: Elektrotlar kas yapı (Şekil 2) ile birlikte paralel olarak yerleştirilir. <ol start="2"><li> Beklendiği gibi stimülasyon protokolü uygulayın. </li></ol> Not: Biz genellikle, 4 V / CM kullanın2Hz bir frekansta 6ms bakliyat. Kültür ortamı uyarılma sırasında her 24 saat değiştirin.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Kas dokularının mühendislik rejeneratif tıpta ilaç tarama için bir hastalık modeli olarak ve et üretimi için kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, bu tür uygulamalar için gereksinimleri değişir. Kollajen hücre hizalama sağlar çünkü önceki 2B çalışmaları 12 yılında belirlenen miyoblast progenitör hücreler bazal membran kaynaklı proteinlerin varlığını gerektirir çünkü, kollajen ve Matrigel kombinasyonu ile çalışmayı seçti. Ayrıca, fibrin jel bizim laboratuvarda test ve kollajen ve ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Matrigel-büyüme faktörü azalır </td><td> Beckton ve Dickinson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (yüksek glukoz) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Greiner </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 ve 0.22 mikron şırınga filtresi * </td><td> Whatmann (Schleicher ve Scheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amfoterisin </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kültür plastik </td><td> Greiner </td><td></td><td> Kültür şişeleri ve pipetler içerir </td></tr><tr><td> Civciv embriyo özü </td><td> Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur pipeti * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pamuk, açık ucu L daralma ile Pasteur pipetler,: 0,9 ucu çapı 230 mm - 1,1 mm </td></tr><tr><td> Pasteur pipeti * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pamuk, açık ucu L daralma ile Pasteur pipetler,: 1,4 ucu çapı 230 mm - 1,6 mm </td></tr><tr><td> Pasteur pipeti </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz tip I* </td><td> Sigma </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40 mikron hücre süzgecinden * </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 19G iğne </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elastomer </td><td> Dow Corning şirketi </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastik MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> Ajan Kür </td><td> Dow Corning şirketi </td><td></td><td> Silastik MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> Velcro </td><td> Düzenli mağaza </td><td></td><td> Siz düzenli bir mağazasında bu satın alabilirsiniz, sadece yumuşak tarafı kullanın </td></tr><tr><td> Kollajen tip I, sıçan kuyruğu </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-Pace EP Kültür Pacer </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektriksel uyarım için 6-kuyulu kültür tabaklarında </td><td> Beckton Dickinson-Falcon </td><td> BD Falcon # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-Bulaşık kültür çanak elektrotlar </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Hücrelerin izolasyonu (puan 1.1) için ihtiyaç duyulan # Birlikte tek bir kit içerisinde </td></tr></tbody></table>

elektrik stimülasyonu murin myoblast progenitör hücreler ve uygulama mühendislik İskelet kası dokular

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered kas dokularının ve rejeneratif ilaç için bir alternatif et 1. basınç ülserleri çalışmak için in vitro olarak örneğin, bir hastalığın örnek olarak kullanım için dokuların üretimi, dahil çeşitli farklı amaçlar için kullanılabilir. İlk rapor 3D kas yapıları yıllar önce yapılan ve alanında öncü Vandenburgh ve arkadaşları 2,3 olan oylandı. Kas doku mühendisliği alanındaki ilerlemeler biyokimyasal faktörler, kök hücre ve progenitör hücrelerin bilgisi engin kazanç gelen sonuç değil sadece, ama fiziksel faktörlerin hücre davranış kontrolünde önemli rol oynadığı araştırmacılar tarafından kazanılan öngörüleri özellikle tabanlı olan ve doku gelişimi. State-of-the-art mühendislik kas anda hücre nüfuslu hidrojel yapıları oluşur oluşturur. Bizim laboratuvarımızda bu genellikle C2C12, mil murin arka bacak kasları izole sıçan miyoblast progenitör hücreleri, ya da bir fare miyoblast hücre hattı oluşurkollajen / Matrigel oluşan bir karışım ile Duran ve iki ankraj noktası arasındaki kaplama, kas bağları taklit. Diğer hücrelerin yanı gibi L6 sıçan miyoblastları 4, yenidoğan kas kaynaklı progenitör hücreleri 5, insan 6 hatta indüklenen pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) 7 gibi diğer türlerden erişkin kas dokularının türetilen hücreler olarak örneğin alternatif hücre hatları kabul edilebilir . Hücre kontraktilite yapı 8,9 ve kültür yaklaşık bir hafta sonra kas progenitör hücrelerin farklılaşma uzun ekseni boyunca hücre hizalama yapar. Dahası, elektrikli uyarım uygulama ölçüde 8 farklılaşma sürecini geliştirmek olabilir. Çünkü sınırlı boyutu (8 x 2 x 0,5 mm) tam doku örneğin canlılığı, farklılaşma ve hücre hizalama izlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilebilir. Söz konusu uygulamaya enginee için gereksinimleri bağlı olarakkırmızı kas dokusu değişecektir; diğer türler için bir et alternatif çeviri gerekli olarak hizmet ederken rejeneratif tıp örneğin kullanımı, doku boyutu ve vaskülarizasyon yukarı ölçeklendirme gerektirir.

Son ürün olarak Şekil 3 &#39;de gösterilen kas yapı olacaktır. Doku büyüklüğü yaklaşık 8 mm uzunluğunda, 2 mm genişliğinde ve 0,5 mm kalınlığında olacaktır. Farklılaşması sırasında elektrik stimülasyonu miyozin ağır zincir izoform ifadesi değişecektir, ancak farklılaşma orta 8 ile uyarılan olarak büyük ölçüde farklılık sürecini geliştirmek değil, aynı zamanda elektrik stimülasyonu kas işlevselliğinin kontrol etmek için işlem sonunda uygulanabilmektedir çünkü, tam gelişmiş sarkomer ile kas elektriksel da...

Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Mühendislik ürünü kas dokuları; in vitro ortamda hastalık modeli olarak kullanılacak dokuların üretimi gibi birçok farklı amaç için kullanılabilir, örneğin...

Bu prosedürün genel amacı, mühendislik ürünü kas dokuları üretmektir. Bu işlem, öncelikle gerekli hücre sayısına ulaşmak için uydu hücrelerin veya bir miyoblast hücre hattının kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise sabitleme noktalarının oluşturulmasıdır.Ardından, hücreler bir jel ile karıştırılır ve elde edilen karışım sabitleme noktaları arasına dökülür. Son adım, hücrelerin kas dokusuna farklılaştırılmasıdır. Nihayetinde, hücrelerin kasılmalarını tetiklemek için elektriksel stimülasyon kullanılabilir; farklılaşmış kas hücrelerindeki hücre iskeletinin sarkomerik organizasyonunu tespit etmek için ise floresan boyama ve floresan veya konfokal mikroskopi kullanılabilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu dokulardaki kas hücrelerinin tek bir yönde hizalanacak olmasıdır. Bu teknik aynı zamanda kas kaybı yaşayan hastalar için de önem taşımaktadır. Örneğin, gelecekte bu dokuları oluşturmak için hastanın kendi hücrelerini kullanırsak, bunlar transplantasyon amaçlı kullanılabilir.Bu yöntem, kas gelişimi ve kas hasarı hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra rejeneratif tıp ve in vitro kültürlenmiş et gibi yeni uygulamalar için de içgörü sunacaktır. Uygulama prosedürü, miyoblast progenitör hücrelerinin izole edilmesi ve dondurulmasına yönelik yöntemleri gösterecektir; bu hücreler başka çalışmalarda tanımlanmıştır.Tam referanslar için lütfen yazılı protokole başvurun. Fare miyoblast progenitör hücreleri içeren tüp sıvı azottan çıkarıldıktan sonra, çözdürmek için tüpü 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.Ardından, 25 santimetrekarelik matric gel kaplı bir doku kültürü flaskına 10 mililitre ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Hücreler çözünür çözünmez, vial içeriğini ortama ekleyin. Hücreleri doku kültürü flaskında 37 °C ve %5 karbondioksit altında inkübe edin.İnkübasyonun üçüncü gününde, hücreleri tripsin, resüspansiyon ve santrifüjleme ile hasat edin. 1000 RPM'de santrifüjledikten sonra hücreleri 75 santimetrekarelik matrigel kaplı bir doku kültürü flaskına pasajlayın; hücreleri her üç günde bir bölün ve altıncı günde hücreleri 150 santimetrekarelik matrigel kaplı bir doku kültürü flaskına pasajlayın. Dokuzuncu günde, hücreleri 150 santimetrekarelik matrigel kaplı doku kültürü flaskından üç adet 150 santimetrekarelik matrigel kaplı doku kültürü flaskına veya üç adet 150 santimetrekarelik flaska aktarın.İnkübasyonun 12. gününde hücreler, bir kas konstrüktüne ekilmeye hazırdır. Bu şemada gösterildiği gibi, bir kenarı üçgen şeklinde olan yaklaşık beş milimetrekare boyutunda cırt cırt (Velcro) parçaları keserek başlayın; cırt cırtın sadece yumuşak tarafı kullanılır. Ardından, elastomeri kürleme ajanıyla 10'a 1 oranında karıştırarak silikon yapıştırıcıyı hazırlayın.Ardından, altı kuyucuklu bir kültür plağının her kuyucuğuna, parçalar arasında yaklaşık 12 milimetre mesafe bırakacak şekilde iki parça cırt cırt bant yapıştırın ve gece boyunca kurumaya bırakın. Ertesi gün, kuyucuklara %70 ethanol ekleyip 15 dakika inkube ederek kuyucukları ve cırt cırt bantları sterilize edin. Sonrasında, kuyucukları PBS ile üç kez durulayın.Üçüncü yıkama çözeltisini kuyucuklarda bırakın ve plakayı 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ardından PBS'yi aspire edin ve plakaları, kullanıma hazır olana kadar doku kültürü inkübatörüne aktarın. Mililitre başına 3,2 miligram kolajen ve steril %0,02 asetik asit içeren bir çözelti hazırlayın.Kollajen çözeltisini, daha önce buzdolabında çözülmüş olan matrigel çözeltisiyle birlikte buz üzerine yerleştirin. Ardından, hücreleri tripsinizasyon ve santrifüjasyon ile toplayın. Daha sonra hücre peletini büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve standart prosedürlere göre hücre sayımı gerçekleştirin.Hücreler sayıldıktan sonra, hücreleri içeren tüpü doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Matriks çözeltisi, aşağıdaki yüzdelerdeki çözeltilerin buz üzerinde karıştırılmasıyla hazırlanır: %51,3 Kolajen çözeltisi (0,2% 0,5 molar sodyum hidroksit), %8,6 matriks jel ve %39,9 büyüme ortamı. pH artışının hızlı jelleşmeye yol açabileceğini göz önünde bulundurarak, nihai çözeltinin pembe renkte olduğundan emin olun.Final hacim, ekilecek kuyu sayısına bağlıdır. Bu tablo 10 kas için gereken hacimleri göstermektedir. Hücrelerin tamamen resüspande olduğundan emin olun ve konstrükt başına 750.000 ila 1.250.000 hücreyi taze bir santrifüj tüpüne aktarıp beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve hücre peletini matris karışımının küçük ancak yeterli bir hacminde resüspande edin.Ardından, pelet tamamen süspanse edildiğinde, hücreleri geri kalan matris karışımı hacmine ekleyin. Önceden ısıtılmış plakaları inkübatörden çıkardıktan sonra, her bir Velcro parçasına 0.35 ile 0.4 mililitre hücre matris karışımı pipetleyin. Ardından, karışımı tutunma bölgeleri arasındaki merkezden pipetlemeye başlayın ve Velcro'ya doğru yayın.Son olarak, iki Velcro sabitleyici arasındaki boşluğu doldurmak için kalan jeli kullanın ve Velcro parçalarının etrafına pipetleme yapın. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin. Ardından kabı hafifçe tıklatın ve jelin sertleşip sertleşmediğini görsel olarak kontrol edin.Eğer öyleyse, kaplar dikkatlice doku kültürü inkübatörüne aktarılabilir. İnkübatörde bir ila iki saat bekledikten sonra, her bir jelin üzerine dört mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı nazikçe ekleyin. Ardından plakayı tekrar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.24 saat sonra, büyüme ortamını diferansiyasyon ortamı ile değiştirin. Ortam değişimini her iki ila üç günde bir tekrarlayın. Olgunlaşmış yönelimli kas lifleri, kültürün yedinci gününde belirgin hale gelmelidir.Bu noktada, lifler elektriksel olarak stimüle edilebilir. İlk olarak, iyon optik plakasındaki elektrotları %70 etanol ile 15 dakika boyunca sterilize edin ve 30 dakika boyunca UV ışığı altında kurutun. Ardından, sterilize edilmiş elektrotları, bir plakanın altını gösteren bu resimde belirtildiği gibi elektrotların kas konstrüktüne paralel yerleştirildiğinden emin olarak kültür plakasına yerleştirin; beyaz oklar elektrotların plakayı kapladığını göstermektedir, plakanın kapağını kapatın ve doku kültürü inkübatörüne aktarın.İyon optik C pacer'ı uygun kablolarla bağlayın ve stimülasyon protokolünü burada uygulayın. Santimetre başına dört volt. İki hertz frekansında altı milisaniyelik palslar kullanılır.Elektriksel stimülasyon genellikle 48 saatlik bir süre boyunca uygulanır. Stimülasyon sırasında kültür ortamını her 24 saatte bir değiştirin. Bu görüntü, olgun bir kas konstrüktünün tipik bir örneğini göstermektedir.Dokunun boyutu yaklaşık sekiz milimetre uzunluğunda, iki milimetre genişliğinde ve 0,5 milimetre kalınlığındadır. Bu görüntü, mühendislik ürünü iskelet kası dokularındaki tipik bir kas progenitör hücresi örneğini göstermektedir. Stimüle edilmemiş aynalayıcı biyo yapay kasların veya M bm'lerin dondurulmuş kesitleri.Diferansiyasyonun sekizinci gününde; sarkomerik alfa aktinin kırmızı, sarkomerik miyozin yeşil ve çekirdekler mavi renkte boyanmıştır. Sağdaki paneller, kutu içine alınmış alanların büyütülmüş halleridir. Protokol, C2C12 hücreleri için de kullanılabilir.Bu görüntü, son görüntüde gösterildiği şekilde boyanmış diferansiye C2C12 hücrelerini göstermektedir. Sarkomerik alfa aktinin kırmızı renkle, sarkomerik miyozin yeşil renkle ve çekirdekler mavi renkle gösterilmiştir.Yine, sağdaki paneller kutulu alanların büyütülmüş halleridir. Bu prosedürü uygularken, her şeyi buz üzerinde tutmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, gelişim sonrası gen ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri göstermek için kantitatif PCR gibi ek soruları yanıtlamaya yönelik diğer yöntemler uygulanabilir.Bu teknik, araştırmacıların doku morfogenezinde mekaniğin rolünü incelemelerinin önünü açmıştır. Ayrıca, mühendislik ürünü kalp kası modellerinin tasarımına da yardımcı olmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, hidrojel tabanlı bir iskele kullanarak mühendislik ürünü kas dokularının nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Ön kompartman kasları nöromüsküler elektriksel stimülasyon bir fare modeli (NMES), güvenli ve ucuz bir klinik yöntem, anlatılmıştır. Bu modelde, farelerde ve spesifik hedef kas kontraksiyonlarının ortaya çıkarmak amacıyla, kolayca bulunabilen bir klinik cihazı değiştirerek bir avantaja sahiptir.

Nöromüsküler Elektriksel Stimülasyon tarafından Kas Eğitimi A Mürin Modeli

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Burada elektrik ve mekanik uyaranlara kardiyak Fizyoloji taklit kullanan bir hücre kesimin eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu elektromekanik stimülasyon işlem görmüş hücreleri cardiomyogenic potansiyelini artırır ve daha fazla hücre tedavisi, hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması için umut verici bir stratejidir.

Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Bu protokolde, kas kök hücreleri için endojen nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyan bir in vitro kültleme ve fonksiyonel analiz yöntemi tanımlanmıştır.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan İskelet Kas Mikrotissularında İskelet Kas Sağlığının Fonksiyonel Ölçümlerinin Değerlendirilmesi

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Öğrenin murin myoblast progenitör hücreleri kullanarak mühendislik iskelet kası dokuları üretme yöntemini. Elektrik stimülasyonu ile kasılmaları tetikleyerek rejeneratif tıp ve alternatif et üretimi için fonksiyonel doku geliştirin.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Daha fazla video keşfet