İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Bu prosedürün amacı, yetişkin zebra balıklarının işitsel ve vestibüler uç organlarından sağlıklı, sağlam tüy hücreleri elde etme yöntemlerini göstermektir, böylece yama kelepçelerinde kullanılabilirler. Gerilim kapılı kanallarının biyofiziksel özelliklerini karakterize etmeyi amaçlayan çalışmalar. Bu, önce beynin balıktan çıkarılması ve ardından labirentleri içeren beyin kasasının ventral kısmının çıkarılmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci adım, uç organları, S lega, utrikül ve yarım daire biçimli kanalları içeren labirentleri izole etmek için kemik kasesini parçalamaktır. Daha sonra, saç hücrelerini içeren epitel tabakaları olan uç organlardan kaldırmak için bir köpek kılı kullanılır. Son adım, epitel tabakalarını iki köpek kılı ile üçlü kürleyerek tek tek saç hücrelerini izole etmektir.

Sonuç olarak, voltaj kapılı kanalların özelliklerini karakterize etmek için izole edilmiş saç hücreleri üzerinde yama lambası kayıtları yapılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, genetik olarak izlenebilir zebra balığı model organizmasından canlı saç hücrelerinin nasıl elde edileceğini göstermesidir. Bu yöntem, işitme ve dengeye aracılık eden hücrelerden nörotransmiterlerin salınımını kontrol eden mekanizmaları anlamaya çalışanlar gibi işitsel ve vestibüler fizyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir.

Bu prosedüre, ekteki el yazmasına göre altı farklı çözüm hazırlayarak başlayın. Daha sonra, 4 adet 35 milimetrelik Petri kabını etiketleyin ve beraberindeki el yazmasında belirtilen solüsyonlarla yaklaşık yarısına kadar doldurun. Bundan sonra, kürlenmiş sil koruyucu ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir Petri kabında balık şeklinde bir boşluk keserek bir diseksiyon kabı hazırlayın.

Bu, diseksiyon sırasında hayvanın devrilmesini önleyecektir. Bir köpek tüyünün folikül ucunu süper yapıştırıcı ile bir cam makarna pipetinin ucuna yapıştırarak en az iki hücre izolasyon aleti hazırlayın ve saçın pipetin ucunun ötesine yaklaşık 0,5 santimetre uzamasına izin verin. Şimdi, bir yetişkin zebra balığını, normal zebra balığı halkaları veya NZR ve trica içeren bir behere batırarak kurban edin.

Tüm kulak hareketleri durana kadar solungaçları görsel olarak izleyin. Balıkları çıkarmadan ve taze NZR ile durulamadan önce en az 10 dakika daha bekleyin. Sonra. Balıkları sırt tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon kabına yerleştirin.

Her bir göz yuvasından bir standart dikiş düz pimi ve dorsal ventral eksenden üçüncü bir pim yerleştirin. Bir zoom stereo diseksiyon mikroskobu altında baştan kuyruğa olan mesafenin yaklaşık üçte biri ila yarısı, kafatası çatısını solungaçların seviyesine kadar yaklaşık 0,5 santimetre kordaldeki bir noktadan balığın burnuna çıkararak beyni ve omuriliğin kısa bir bölümünü açığa çıkarın. Daha sonra omuriliği kesin ve sinirleri ve diğer ekleri keserken ince forseps ile beyni kaldırın.

Bundan sonra, beyni çıkarın ve atın. Kafatası kapsülünün kalan ventral kısmı, iç kulak organlarını içeren bir kase oluşturur. Her bir iç kulağın çeyrek ucunda simetrik olarak yerleştirilmiş legina ve sculli'deki belirgin beyaz opak OTA otolitlerini ve yer alan yanal olarak konumlandırılmış utrikül otolitlerini gözlemleyin.

Daha fazla çetele. Bu yapılar, labirentin bir çift ince forseps ve yaylı makasla sağlam bir şekilde çıkarılmasına yardımcı olacak yararlı yer işaretleridir. Yavaşça baştan kaldırırken tüm ventral ve lateral ekleri keserek kemik kasesini çıkarın.

Daha sonra düşük kalsiyum çözeltisi veya düşük cas içeren Petri kabına yerleştirin. Kaseyi orta hattından ayırın ve ince forseps uçlarını merkeze sokarak ve yarımları birbirinden ayırarak sağ ve sol yarıları ayırın. Sonra iki labirenti kemikten çıkarın.

Labirentleri inceleyin ve işitsel ve vestibüler uç organları tanımlayın. Yarım daire biçimli kanallar, urasil, sculli ve legina. İnce forseps kullanarak koku kaldırıcılarını legina ve utrikülden dikkatlice çıkarın.

Bu prosedürde, uç organları lokas ve propan içeren tabağa aktarın. Plastik bir transfer pipeti kullanarak bu yapıları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, yapıları NZR ve BSA içeren tabağa aktarın ve en az 30 dakika inkübe edin.

Hücre izolasyonuna hazırlanmak için daha fazlası. Uç organlardan birini, örneğin legina'yı NZR içeren tabağa aktarın. Bu çanak daha sonra bir stereo zoom diseksiyon mikroskobu sahnesine yerleştirilir.

Saç hücrelerini içeren pembemsi epitel dokusu tabakası olan makulayı nazikçe kaldırmak için bir köpek kılı kullanın. Topuz ayrıca sculli ve urasilden çıkarılabilir ve kae, yarım daire biçimli kanalların içindeki yerlerinden izole edilebilir. Daha önce hazırlanan hücre izolasyon araçlarından ikisini kullanarak, saç hücrelerini içerecek bir enkaz alanı oluşturmak için makulayı Tate'leyin.

Tabağı hareket ettirmeden önce hücrelerin dibe çökmesi için en az beş dakika bekleyin. Daha sonra, çanağı yüz kontrast optiği ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına aktarın. Hücreleri 40 kat büyütme altında gözlemleyin.

Hücre morfolojisindeki çeşitliliğe dikkat edin. Bazı hücreler avokado şeklindedir, bazıları ise uzun ve incedir. Apikal saç demetlerinin varlığı saç hücrelerini gösterir ve faz parlaklığı sağlıklarını garanti eder.

Delikli yama kayıtları için, önce beş miligram amfoterisin B'yi 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirerek amfoterisin içeren bir çözelti hazırlayın. Daha sonra 100 mikrolitre DMSO ekleyin ve tüm amfoterisin eriyene kadar tüpü hemen 10 ila 20 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra, 625 mikrolitre potasyum iyonu iç çözeltisini ikinci bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin.

Daha sonra potasyum iyonu iç çözeltisine 10 mikrolitre amfoterisin çözeltisi ekleyin ve 10 ila 20 saniye daha girdaplayın. Boro silikat cam kılcal boru içeren filamentten yama pipetleri üretin. Çok kademeli bir çektirme kullanarak, pipetin uç çapları yaklaşık iki mikron ve bir ila üç mega ohm arasında dirençler olmalıdır.

Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında en az erişim direnci sağladıkları için künt mermi şeklindeki pipetler tercih edilir. Bundan sonra, bir yama pipetini yarıya kadar potasyum iyonu içeren amfoterisin iç çözeltisiyle doldurmak için 28 gauge mikro dolgulu bir şırınga iğnesi kullanın. Bu pipeti bir yama kelepçesinin baş aşamasına sabitleyin.amp yama kelepçesi kayıtlarını etkinleştirmek için amplifikatör.

İlk olarak, hava çözeltisi arayüzünden ve hücrelerin yakınındaki kayıt kabının dibine indirilirken elektroda pozitif basınç uygulayın. Ardından, elektrodu sağlıklı görünen bir hücreye dik olarak yerleştirin. Elektrot, hücre dışarı akan çözeltiden uzaklaşmaya başlayacak kadar yakın olduğunda, hücre üzerine atlayana kadar elektrotta hafif bir vakum oluşturarak basıncı hızla tersine çevirin.

Hücre ile bir giga ohm conta oluşumuna izin vermek için elektrot üzerindeki emmeyi hemen durdurun. Elektroda 10 milivoltluk tekrarlayan hiperpolarize voltaj adımları uygulayın ve kapasitif akım geçişini gözlemleyin. Geçici durumun büyüklüğü maksimum boyutlarına ulaştıkça amfoterisin kaynaklı membran deliklerini izlemeye devam edin.

Sağlıklı bir hücrede delikli yama konfigürasyonunun kurulmasını doğrulamak için, potansiyelin hiperpolarize edici ve depolarize edici adımlarını uygulayarak voltaj kapılı akımları ortaya çıkarın. Çoğu saç hücresi, sürekli depolarizasyon sırasında hızla inaktive olan belirgin dış akımlara sahiptir. Bu şekil, beynin çıkarılmasından sonra beyin durumunun ventral kısmını göstermektedir.

Tulo, cins ve sculli ile ilişkili otolitlerin yanı sıra iki utrikül ile ilişkili olanlar, kemik kasesinin çıkarılmasından sonra üzerlerini kaplayan ince kemikten görülebilir. Otolitlerin varlığı, labirentlerin yerini belirlemeye yardımcı olur. Çizgi filmdeki çizgi çizgisi, sol labirentin yaklaşık çevresini gösterir.

Labirent izole edildiğinde, s, legina, utrikül ve yarım daire kanalları gibi işitsel ve vestibüler uç organlar tanımlanabilir. Karikatür, yarım daire biçimli kanalların A, B ve C olmak üzere bu yapıların konumunu göstermektedir. D utrikül, E s ve f lega'dır.

Tüy hücresi morfolojisindeki çeşitlilik, legadan izole edilen bu hücre figüründe belirgindir. Hücreler kabaca ince veya avokado şeklinde olmak üzere iki sınıfa ayrılır. Sağlıklı hücreler, aksine, keskin ana hatlar ve belirgin saç demetleri ile aşamalı olarak parlaktır.

Burada ek B'de gösterilen ölü hücreler granüler siyah bir görünüme sahiptir. Bu şekil, eksi 140 milivolttan artı 70 milivolta kadar 10 milivoltluk artışlarla uygulanan ve eksi 70 milivoltluk bir tutma potansiyeli olan üç voltaj adımına bir hücredeki ortalama tepkileri göstermektedir. Devre dışı bırakma akımının daha depolarize potansiyellerde göründüğüne dikkat edin.

Bir kez ustalaştıktan sonra, prosedürün başlamasından 90 dakika sonra elektrofizyolojik kayıtlar alınabilir. Ayrıca, üç adım ertelenir ve uç organlar BS'de tutulursa, diseksiyonun başlamasından dört saat sonrasına kadar bir çözelti, sağlıklı hücreler elde edilebilir. Bu hazırlık, yaygın olarak bulunan zebra balığı genetik mutasyonları ile birlikte kullanıldığında, işitme dengesizliği mekanizmalarının altında yatan moleküler faktörleri araştırmak için benzersiz bir model sistem sağlar.