Name: İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Keşfedin iç kulak saç hücrelerini izole zebrafish'ten patch clamp kayıtları için. Bu yöntem, voltaj kapılı kanalların biyofiziksel özelliklerini karakterize ederek işitme ve denge fizyolojisini anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NSF (0854551) tarafından finanse edilmiştir.

1. Ön-deneysel Hazırlıklar <ol><li> Altı çözeltileri (kompozisyonlar için bakınız Tablo 1) hazırlanması: (a) 100 ml NZR (normal zebrafish Ringer), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (düşük Ca 2 + çözelti), (e) 10 ml Locas + papain, (f) ve 100 ml K +-iç çözelti. Solutions (a), (b), (d) ve (f) 4 ° C&#39;de yukarı bir ay depolanabilir Solutions (c) ve (e) deney günü hazırlanması gerekmektedir. Tüm çözümler deneyler başlamadan önce oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> Etiket ve yaklaşık olarak yarım çözümleri (a), (c), (d) ve (e) dört adet 35 mm Petri kapları doldurun. </li><li> Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) ile 60 mm Petri kabı doldurma ve daha sonra bir balık devrilme olmaksızın dik oturmak için izin verecek içine bir oyuk keserek bir diseksiyon çanak olun. </li><li> Bir cam sonuna bir köpek saç yapıştırma folikül sonuna kadar en az iki hücre izolasyonu araçları hazırlayınYapıştırıcı ile Pasteur pipeti, saç yaklaşık olarak 0.5 cm pipet sonunun uzatmak için izin verir. Labrador Retriever ve Weimaraners gibi yumuşak tüylü köpeklerin tüyleri iyi çalışır. </li></ol> 2. İşitsel ve Vestibüler Labirent İzolasyonu <ol><li> NZR + Tricaine içeren bir behere daldırılarak bir yetişkin zebrafish Kurban. Tüm opercular hareketleri sona kadar Görme solungaçları izlemek. Balık çıkarma ve taze NZR ile yıkamadan önce ek bir on dakika bekleyin. Bu prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Pepperdine Üniversitesi Komitesi (IACUC) kullanın fakat onay için kendi kurumunuzun alınmalıdır edilmiştir. </li><li> Için balık Pin kafasından uzaklığın yarısına yaklaşık üçte biri dorsal-ventral eksen boyunca her göz soketi ve bir üçüncü pin aracılığıyla bir standart dikiş düz pim (yaklaşık 2,5 cm uzunluğunda) takarak çanak dorsal yüzü yukarı diseksiyon de gösterildiği gibi, kuyrukŞekil 1A. </li><li> Bir zoom (0.62-5x) 10x oküler ile donatılmış stereo mikroskop altında, yaklaşık bir noktadan kafatası çatı kaldırarak beyin ve omuriliğin bir kısa segment ortaya çıkarmak için makas makas (Güzel Bilim Araçları katalog numarası 15000-02) kullanın ileri balık burun solungaçları seviyesine kaudal 0.5 cm. Omurilik kesin ve spinal sinirler ve diğer ekleri kesim sırasında ince forseps (Güzel Bilim Araçları katalog numarası 11251-30) ile beyin kaldırın; beyin kaldırmak ve (Şekil 1B) atın. </li><li> Kalır kafatası kapsül ventral yarısında iç kulak organları içeren bir &quot;kase&quot; oluşturur. Her iç kulak ve daha rostrally yanal konumlandırılmış kırbacık otolit (Şekil 1C ve 4A) kaudal ucunda simetrik olarak yerleştirilen lagenas ve sacculi öne çıkan, beyaz, opak otolit gözlemleyin. </li><li> Tüm ventral ve lateral attachmen keserek kemik kasesini çıkarınts yavaşça ince forseps ile başının dışarı kaldırırken. Locas (Şekil 1D ve 4B) içeren Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Ince forseps iki çift kullanarak, iki kemik arasında yanal kenarları kapma ve merkezi forseps noktalarına ekleme ve yarıya meraklı ile sağ ve sol yarısı ayrılması, ya da alternatif olarak ayrı çekerek kendi orta hattan kase ayrı çatlak dışında. Ince forseps (Şekil 2) kullanarak kemik iki labirent çıkarın. </li><li> Semisirküler kanallar, utricles, sacculi ve lagenas (Şekil 4C): işitsel ve vestibüler end-organ tanımlamak için labirentler inceleyin. Her bir otolit altında pembemsi alanlar saç hücrelerini içeren makulaları vardır. Benzer bir şekilde, yarı dairesel kanal ampülleri içinde pembe bir şerit saç hücrelerinin bulunduğu kupulada tanımlar. </li><li> Dikkatlice ince forseps kullanarak lagena ve kesecik gelen otolit çıkarın ( <strong&gt; Şekiller 2 ve 4C). O bunu yaparken sakküler saç hücrelerinin zarar verebilir kesecik gelen otolit kaldırmak için gerekli değildir. </li></ol> 3. Saç Hücre İzolasyon <ol><li> Plastik bir transfer pipet (Fisher Scientific katalog numarası 13-711-09:00) kullanarak içeren çanak sonuna organları taşımak Locas + papain sıvı transfer hacmi en aza indirir. </li><li> Oda sıcaklığında otuz dakika için bu çözelti bu yapıların inkübe edin. </li><li> İnkübasyon süresinin sonunda, NZR + BSA ihtiva eden çanak için yapı taşımak ve en azından otuz dakika süreyle bu çözelti içinde inkübe edilir. Saç hücreleri dört saate kadar bu çözüm sağlıklı kalacak ama (sonraki adımlara bakın) izolasyonunu takiben 1-2 saat sonra bozulacaktır. </li><li> Hücre izolasyonu için hazırlık olarak, NZR içeren çanak sonu organlardan biri taşıyın. </li><li> Lagenas ve utricles için hafifçe pembemsi epitel ti makulaları-sayfaları çıkarmak için bir köpek saç kullanmaksaç hücreleri (Şekil 3A) ihtiva ssue. Makulaları scooped edilebilir sacculi bir otolitler altında (a köpek saç kullanılarak), ve yarı-daire şekilli kanalların ampülleri içinde kendi konumlarından cupulae. </li><li> Adım 1.4 olarak hazırlanan iki hücre izolasyonu araçlarını kullanarak, saç hücreleri (Şekil 3B) içeren bir enkaz alanı oluşturmak için bir makula veya kupulada çiğnemek. Hücreler taşımadan önce çanak alt üzerine yerleşmek için en az beş dakika bekleyin. </li><li> Faz kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop aşamasına çanak yerini değiştirin. 40X büyütme altında hücrelerde gözlemleyin ve morfolojisinde çeşitliliği dikkat. Diğerleri uzun ve ince ise birçok hücre avokado şeklindedir. Apikal saç demetleri varlığı saç hücreleri olarak tanımlayan ve faz-parlaklık sağlık sağlar. İzole saç hücrelerinin fotomikrografı Şekil 5 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 4. Zebra balığı Saç Hücreleri Mengene Patch <ol><li> Perfo için hazırlıkyeri 5 mg amfoterisin B (Sigma A4888) bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe ve 100 ul DMSO ile doldurun: anma yama kayıtları 5,6, şöyle amfoterisin içeren iç solüsyon hazırlanır. Amfoterisin tüm eriyene kadar 10-20 saniye boyunca hemen vorteks bu çözüm. Ikinci bir mikrosantrifüj tüp içine Sonra, pipetle 625 ul K +-iç çözüm. Yukarıdaki gibi iç çözelti +-K ve girdap için amfoterisin çözeltisi 10 ul ekle. Stok amfoterisin çözümü birkaç saat sürer, ancak bir saat sonra nihai çözüm kaybolacak. </li><li> Bir çok aşamalı çektirmesi (Sutter P-1000) kullanarak BF 150-86-10 borosilikat cam (Sutter Instruments) yama pipetler Fabrikasyona. Pipetler yaklaşık 2 mikron çapları Öneri olmalı ve Tablo 1&#39;de çözümleri ile MΩ 1-3 dirençleri olacaktır. Aşağıdaki gibi isler iyi olduğunu çektirmesi üzerine ayarları: Isı = Rampa minus10, = 0, Hız çekin = 18, Gecikme = 1, Basınç = 600. Şekliİyi bir pipet ucu Şekil 5&#39;in ilave c fotoğraf bellidir. Onlar elektrofizyolojik kayıtlar sırasında en az erişim direniş olarak Blunt &quot;mermi şeklinde&quot; pipetler tercih edilir. </li><li> Amfoterisin içeren K +-iç çözümü ile yarım bir kayıt elektrot doldurmak için, bir 28 gauge Mikrofil şırınga iğnesi (Dünya Hassas Aletler MF28G-5) kullanın. </li><li> Bir yama kelepçe amplifikatör headstage için takılan elektrot. -10 MV, 10 Hz&#39;de 10 ms gerilim adımlar uygulanır ve bu hücrelerin yakın kayıt tabağın tabanına karşı aşağıya doğru hava / çözelti arabirimi üzerinden hareket ettirilebilir ve olduğu gibi elektrot pozitif basıncı muhafaza. </li><li> Sağlıklı görünen bir hücreye ortogonal elektrot yerleştirin. Bunun üzerinden akan çözüm uzaklaşmaya başlar böylece elektrot yeterli hücre yakın olduğunda, hızlı bir elektrot için hafif bir vakum uygulanarak, basınç tersine üstüne hücre &quot;atlar&quot; kadar. Hemen th emiş durdurmae ve elektrot elektrot içine -70 mV&#39;luk bir tutma potansiyel uygulanır. Birkaç saniye içinde bir gigaohm mühür oluşturacak. </li><li> Yakında mühür oluşumundan sonra görünen gerilim adımların başlangıcı ve bitiminde kapasitif akımı geçici gözlemleyin. Transientler (yaklaşık on dakika), maksimum boyutuna büyüklüğü arttıkça izleyerek amfoterisin tarafından elektrodu altında membran perforasyonu izlemek için devam edin. </li><li> Sağlıklı hücre tam hücreli (delikli) yapılandırma kurulması onaylamak gerilim adımları hiperpolarizan ve depolarizan uygulayarak dışa K + akımları ortaya çıkarmak. Çoğu saç hücreleri belirgin dışa akımları (bkz. Şekil 6) var. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 4 hücre izolasyonu adımları sırasında çekilen görüntüleri gösterir. Panelin A lagenas, saccluli ve utricles ile ilişkili otolitler throu görülebilirgh kemik ince bir tabaka onları üzerler olduğunu. Bu opak yapılar diseksiyon sonraki adım sırasında hayvan son organ güvenli çıkarmaya yardım etmek için uygun görülecek sağlar. Panel B bozulmamış labirentler ve utricles, lagenas ve sacculi öne çıkan otolit içeren kemik &quot;kase&quot; gösterir. Panel C kemik kaldırılmış bir labirent gösterir. Lagena içinde taraklı kenarı ile büyük otolit, kesecik de kesecik ile fasulye-şekilli otolit içinde saçağı-şekilli otolit not edin. Boyut ve lagena izole edilen hücrelerde görülen morfolojik olarak çeşitlilik bazıları Şekil 5 de gösterilmiştir. Sağlıklı bir hücre kolayca keskin bir çevre ile parlak aşaması olarak tanımlanır. Hücre şekil kabaca iki sınıfa ayrılabilir: avokado-şekilli (AVO) ve uzun ve ince (thn) her bir grup içindeki hücre boyutları önemli ölçüde değişebilir olmakla beraber (örneğin AVO 1 ve AVO 3 karşılaştırın). Inset bir bir küme gösterirBu hücreler üç tamamen birbirlerinden izole edilemedi. Içerlek b hücre siyah renkli ve granüler bir görünüm kolaylıkla ölü olarak bu hücreyi tanımlar. Ankastre c bu hücrelerin kayıt için uygun şekil ve boyutlar gösteren bir yama pipet ucu göstermektedir. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi akım izleri Şekil 5&#39;te gösterilen AVO 2&#39;ye benzer bir lagena hücre uygulanan olası aşamaları hiperpolarize ve depolarize yanıt olarak elde edildi. Farklı boyutlarda ve şekillerde hücrelerinde Güncel yanıtları yaygın voltaj kapılı kanallar tamamlayıcı çeşitlilik gösteren değişebilir. Şekiller 1-3: saç hücrelerinin izolasyonu adımları gösteren Çizgi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Şekil 1. Kafatası capsu çıkarılmasızebrafish gelen iç kulak labirentler içeren le. A. Çanak diseksiyon için zebrafish dorsal yüzü yukarı feda pin. B. Açık kafatası, kaldırmak ve beyin atın. C. Utricles, lagenas ve sacculi. D otolit uyun. Labirentler içeren kafatası kapsül ventral kısmı çıkarın. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Şekil 2. Kafatası kapsül labirentler kaldırılması. A. Onun orta hatta kafatasının kapsülü dışında Crack. B. Kemik labirentler çıkarın. C. Forseps kullanarak lagenas ve utricles gelen otolit çıkarın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Şekil 3. Labirentler saç hücrelerinin izolasyonu. A. Yavaşça ma kaldırınBir köpek saç ile culae. B. İki köpek tüyleri ile makulaları Karışım. C. yama kelepçe için izole saç hücreleri kullanın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Şekil 4,. Görüntüler ayrı ayrı hücrelerin izolasyonu adımları sırasında alınmıştır. Beyin çıkarılmasından sonra A., iki lagenas ve sacculi (oklar) ve utricles (ok uçları) ile ilişkili otolitler görselleştirilebilir. B. ventral çıkarıldıktan sonra hayvan iç kulak organları içeren kafatası kapsül kısmı. B sağ yarısında karikatür sol kesecik, lagena ve Keseciklerin konumları tanımlar. Kesikli çizgi sol labirent yaklaşık konumunu gösterir. C. Sağ labirent (medial görünüm) D: C labirent anahtar bölümlerini gösteren Karikatür çizimi. Bir: ön yarıdairesel kanal, b: Yatay kanal, c: Posterior kanal, d: utricular otolit, E: sakküler otolit, f: lagenal otolit. D Ölçek çubuğu A ve B için 1 mm, C ve D için 0,5 mm temsil <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Şekil 5 morfolojisi çeşitlilik gösteren lagena İzole, sağlıklı hücreler; avo:. Avokado şekilli hücrelerden; thn: Uzun, ince hücreler. Inset bir: Üç tam olarak izole hücre kümesi; içerlek b: ölü hücre; içerlek c: zebrafish saç hücrelerinden elektrofizyolojik kayıtlar kullanılan yama elektrot ucu. Ölçek bar = 20 mikron ana figürü ve tüm parçalar için geçerlidir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Bir yama kaydedilen Şekil 6. Akımlar saç hücresi kenetlenir. Hücreye Ortalamalı yanıtları (benzer t-70 mV&#39;luk bir tutma potansiyelinden +70 mV&#39;a -140 mV 10 mV aralıklarla uygulanan voltaj adımı üç sunum için, Şekil 5&#39;te o AVO 2). Daha depolarize potansiyelleri görünür inaktive geçerli unutmayın. Gerilim adım büyüklükleri izleri bazı yanında gösterilir.

<ol><li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li>
<li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li>
<li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li>
<li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Ca2%2B+entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li>
<li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211(2009).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell%3A+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li>
<li>Kim, M. -H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345(2012).</li>
<li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li>
<li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Son organ ve hücreler nazik tedavi dikkatli bir teşrih sağlıklı, bozulmamış ve fizyolojik olarak aktif saç hücrelerinin başarılı bir şekilde izolasyon için çok önemlidir. Aşağıdaki ipuçları bağlılık başarı sağlayacaktır: <ol><li> Bu küçük balık (uzunluğu 2-2.5 cm) sağlıklı hücreleri elde etmek kolaydır. Büyük balık diseksiyon işlemi sırasında olduğu belirsiz görselleştirme daha birçok yağ damlacıkları var. </li><li> Kıl hücreleri örten otolit, çıkarırken dikkatli olunmalıdır. Forseps ile otolit kapma sırasında hücreler dokunmaktan kaçının. </li><li> En iyi sonuçlar, makulaları ve cupulae epitel tritüre yaprak ve hücreler olarak kaldırdı zaman elde edilir. </li><li> Biz insan kirpik gibi konik ve daha az esnek olmayan 7 kullanıyorsanız dahil diğer yöntemleri, üstün olduğu hücreleri öğütmek için bir köpek saç kullanım alanı bulmaktadır. </li><li> Yama klemp, t pozitif basınç uygulanması sırasındaHava / çözüm arayüzü ucu temiz tutmak önemlidir aracılığıyla geçerken o elektrot. Elektrot üzerine &quot;atlamak&quot; için hücrenin etkinleştirmek için pozitif basınç serbest bırakılması da önemlidir. Bu nedenle bu yöntem hücreye bir gigaohm mühür oluşturan olasılığını arttırarak, uzak ucundan itibaren amfoterisin B ihtiva eden çözelti küçük bir hacim temizler. Deneylerde yerine daha fazla geleneksel tüm-hücre konfigürasyonu nedeniyle hücrelerin kırılganlık delikli yama kayıt tekniği kullanır. Gigaohm mühür kaybı genellikle sonuçları &quot;tüm hücre go&quot; çalışılıyor. </li></ol> Burada açıklanan yöntem, hayvan başına sağlıklı saç hücrelerinin yüzlerce verecektir. Teknik oda sıcaklığında yapıldı ve bir diseksiyon mikroskobu ötesinde hiçbir özel ekipman gerektirir. Edilebilir Vallahi bir önceki raporun bir ventral yaklaşımı 8 kullanarak zebrafish içinde iç kulak diseksiyonu açıklar. Bu yazarlar disse göstermekbütün, paraformaldehid sabit iç kulak organlarının ction. Biz okuyucu bizim yöntemleri ile karşılaştırmak için bu videoyu izlemenizi tavsiye ederiz. Burada anlatılan yöntemlerin bir avantajı, fizyolojik araştırmalar için yararlı canlı hücrelerin elde edilmesidir. Bu hücrelerin kullanımı kapasitans ölçümleri 11,12 yaparak hücre rezonans 9,10, monitör nörotransmitter serbest çalışmak için uzatılabilir (burada görüldüğü gibi) voltaj kapılı kanallar incelemek için yama kelepçe deneylerde kullanılmasının yanı sıra, neden nöromodülasyon araştırmak ligand kapılı kanallar 13 aktivasyonu yanı sıra işitme ve denge 14 hem etkileyen mutantlar kullanılarak toplanan edilebilir bilgi zenginliği içine dokunun.

<table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm Adı </td><td> Yemek tarifi </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Zebrafish Ringer) (mM olarak) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 glikoz, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR +% 0.02 3-aminobenzoik asit etil ester metan sülfonat (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR +% 0,4 Bovine Albumin Serum (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Düşük Ca 2 + Çözüm) (mM) </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl2, 0,05 MgCl2, 3 glikoz, 30 Na-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + papain </td><td> Locas +% 0.05 L-sistein (Sigma C1276) +% 0.2, papain (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7.3. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözümler.

İç kulak saç hücreleri patch clamp kayıtlar İzole zebrafish gelen

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Çeşitli türlerin izole duyu saç hücreleri voltaj kapılı kanallar Yama kelepçe analizleri önceden 1-4 tarif ama bu videoyu zebrafish saç hücreleri bu teknikleri ilk uygulamayı temsil edilmiştir. Kesecik, lagena, kesecik ve semisirküler kanallar: Burada iç kulak sonu tüm organlarının sağlıklı, sağlam saç hücreleri izole etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Ayrıca, biz saç hücre boyutu ve morfolojisi çeşitliliğini göstermek ve elde edilebilir yama klemp kayıtları türlü bir örnek vermek. Diğerleri üzerinde bu zebrafish model sisteminin kullanım avantajı işitme ve denge hem etkileyen zebrafish mutant durumu kaynaklanmaktadır. Transgenik hatları ve genetik analiz ve manipülasyon, hücre izolasyonu ve elektrofizyolojik yöntemler kullanan diğer tekniklerin kullanımı ile birlikte rol saç hücrelerinin p içine daha fazla fikir kolaylaştırmalıdır burada tanıttıBu duyu modaliteleri arabuluculuk yatıyordu.

Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Çeşitli türlerden izole edilen duyusal tüy hücrelerindeki voltaja bağımlı kanalların patch clamp analizleri daha önce tanımlanmıştır1-4 ancak bu...

Bu prosedürün amacı, yetişkin zebra balıklarının işitsel ve vestibüler uç organlarından, yama kenetleme (patch clamp) yöntemlerinde kullanılabilmeleri için sağlıklı ve sağlam tüy hücreleri elde etme yöntemlerini göstermektir. Bu çalışmalar, voltaj kapılı kanallarının biyofiziksel özelliklerini karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Bu işlem, öncelikle balıktan beynin çıkarılması ve ardından labirentleri içeren beyin kasasının ventral kısmının alınmasıyla gerçekleştirilir.İkinci adım, uç organları, yani sacculus, utriculus ve semisirküler kanalları içeren labirentleri izole etmek amacıyla kemik kapsülünü parçalamaktır. Ardından, saç hücrelerini içeren epitel tabakalarını uç organlardan kaldırmak için bir köpek kılı kullanılır. Son adım, iki köpek kılıyla epitel tabakalarını ayırarak tekil saç hücrelerini izole etmektir.Nihayetinde, voltaj kapılı kanalların özelliklerini belirlemek amacıyla izole tüy hücreleri üzerinde patch lamp kayıtları yapılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genetik olarak işlenebilir bir model organizma olan zebra balığından canlı tüy hücrelerinin nasıl elde edileceğini göstermesidir. Bu yöntem, işitme ve dengeyi sağlayan hücrelerden nörotransmitter salınımını kontrol eden mekanizmaları anlamayı amaçlayanlar gibi, işitsel ve vestibüler fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olmak için kullanılabilir.Bu prosedüre, beraberindeki makaleye göre altı farklı çözelti hazırlayarak başlayın. Ardından, 4 adet 35 mm'lik Petri kabını etiketleyin ve bunları beraberindeki makalede belirtilen çözeltilerle yaklaşık yarıya kadar doldurun. Daha sonra, kürlenmiş sil guard ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına balık şeklinde bir boşluk açarak bir diseksiyon kabı hazırlayın.Bu, diseksiyon sırasında hayvanın devrilmesini önleyecektir. Bir köpek tüyünün folikül ucunu, hızlı yapıştırıcıyla bir cam pasta pipetinin ucuna yapıştırarak en az iki hücre izolasyon aracı hazırlayın; tüyün pipet ucunun dışına yaklaşık 0.5 santimetre kadar uzanmasını sağlayın. Şimdi, bir yetişkin zebra balığını, normal zebra balığı ringers veya NZR ve trica içeren bir behere daldırarak sakrifiye edin.Tüm auriküler hareketler sona erene kadar solungaçları görsel olarak izleyin. Balığı çıkarmadan ve taze NZR ile durulamadan önce en az 10 dakika daha bekleyin. Ardından, balığı dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde diseksiyon kabına yerleştirin.Her bir göz çukurundan bir standart dikiş iğnesi ve dorsal ventral eksenden üçüncü bir iğne geçirin. Bir zoom stereo diseksiyon mikroskobu altında, kafadan kuyruğa olan mesafenin yaklaşık üçte biri ile yarısı arasında, yaylı makas kullanarak kafatasının üst kısmını solungaç seviyesinden yaklaşık 0,5 santimetre kordal bir noktadan balığın burnuna kadar kaldırarak beyni ve spinal kordun kısa bir segmentini açığa çıkarın. Ardından spinal kordu kesin ve sinirleri ile diğer bağlantıları keserken ince penset yardımıyla beyni kaldırın.Ardından, beyni çıkarın ve atın. Kafatası kapsülünün kalan ventral kısmı, iç kulak organlarını içeren bir çanak oluşturur. Her bir iç kulağın çeyrek ucunda simetrik olarak yer alan legina ve sculli bölgelerindeki belirgin beyaz opak OTA otolitlerini ve lateralde konumlanmış utricle otolitlerini gözlemleyin.Daha fazla sayım. Bu yapılar, labirentin bir çift ince pens ve yaylı makasla bozulmadan çıkarılmasına yardımcı olan yararlı işaretçilerdir. Kemik çanağına bağlı olan tüm ventral ve lateral bağlantıları keserek ve yapıyı nazikçe kafadan kaldırarak çıkarın.Ardından, örneği düşük kalsiyumlu çözelti veya düşük cas içeren Petri kabına yerleştirin. Çanağı orta hattından çatlatın ve ince uçlu penslerin uçlarını merkeze yerleştirip yarıları birbirinden ayırarak sağ ve sol yarıları ayırın. Daha sonra iki labirenti kemikten çıkarın.Labirentleri inceleyin ve işitsel ile vestibüler uç organları tanımlayın. Yarım daire kanalları, utrikül, sakül ve lagena. İnce pensler kullanarak lagena ve utriküldeki otolitleri dikkatlice uzaklaştırın.Bu prosedürde, uç organları locas ve propan içeren kaba aktarın. Plastik bir transfer pipeti kullanarak bu yapıları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresinin sonunda, yapıları NZR ve BSA içeren kaba aktarın ve en az 30 dakika boyunca inkübe edin.Hücre izolasyonu için hazırlıklara devam edin. Uç organlardan birini, örneğin legina'yı, NZR içeren kaba aktarın. Bu kap daha sonra stereo zoom diseksiyon mikroskobunun tablasına yerleştirilir.Tüy hücrelerini içeren pembemsi epitel doku tabakasını nazikçe kaldırmak için bir köpek kılı kullanın. Macula ayrıca sacculus ve utriculus'tan da çıkarılabilir ve kristalar semisirküler kanallar içindeki konumlarından izole edilebilir. Daha önce hazırlanan hücre izolasyon araçlarından ikisini kullanarak, tüy hücrelerini içerecek bir debris alanı oluşturmak için macula'yı parçalayın.Kabı hareket ettirmeden önce hücrelerin dibe çökmesi için en az beş dakika bekleyin. Ardından, kabı faz kontrast optiklerine sahip bir evirtme mikroskobunun tablasına yerleştirin. Hücreleri 40 kat büyütme altında gözlemleyin.Hücre morfolojisindeki çeşitliliğe dikkat edin. Bazı hücreler avokado şeklindeyken diğerleri uzun ve incedir. Apikal tüy demetlerinin varlığı tüy hücrelerini gösterir ve faz parlaklığı sağlıklarının yerinde olduğunu kanıtlar.Perfore patch kayıtları için, önce beş miligram amfoterisin B'yi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirerek amfoterisin içeren bir çözelti hazırlayın. Ardından 100 mikrolitre DMSO ekleyin ve tüm amfoterisin çözünene kadar tüpü hemen 10 ila 20 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, ikinci bir mikro santrifüj tüpüne 625 mikrolitre potasyum iyonu internal çözeltisi pipetleyin.Ardından, potasyum iyonu iç solüsyonuna 10 µL amfoterisin solüsyonu ekleyin ve 10 ila 20 saniye daha vorteksleyin. Borosilikat cam kılcal tüpler içeren filamanlardan patch pipetleri hazırlayın. Çok aşamalı bir çekici (puller) kullanarak, pipetin uç çapları yaklaşık iki mikron ve dirençleri bir ila üç mega ohm arasında olmalıdır.Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında en düşük erişim direncini sundukları için küt uçlu mermi şeklinde pipetler tercih edilir. Ardından, bir patch pipetiyle yarıya kadar amfoterisin içeren potasyum iyonu iç solüsyonunu doldurmak için 28 gauge microfill şırınga iğnesi kullanın. Patch clamp kayıtlarını gerçekleştirebilmek için bu pipeti bir patch clamp amplifikatörünün kafa aşamasına sabitleyin.İlk olarak, elektrot hava-solüsyon arayüzünden geçirilip hücrelerin bulunduğu kayıt kabının tabanına doğru indirilirken pozitif basınç uygulayın. Ardından, elektrodu sağlıklı görünümlü bir hücreye dik olacak şekilde konumlandırın. Elektrot, hücrenin dışarı akan solüsyondan dolayı uzaklaşmaya başlayacağı kadar yaklaştığında, hücre elektrodun üzerine sıçrayana kadar basıncı hızla tersine çevirerek elektrot içinde hafif bir vakum oluşturun.Hücre ile giga ohm sızdırmazlığının oluşmasını sağlamak için elektrot üzerindeki vakumu derhal kesin. Elektroda 10 millivoltluk tekrarlayan hiperpolarize voltaj basamakları uygulayın ve kapasitif akım geçişini gözlemleyin. Geçişlerin büyüklüğü maksimum seviyeye ulaşırken, amphotericin kaynaklı membran perforasyonlarını izlemeye devam edin.Sağlıklı bir hücrede perforize yama konfigürasyonunun kurulduğunu doğrulamak için, hiperpolarize ve depolarize potansiyel basamakları uygulayarak voltaja bağımlı akımları ortaya çıkarın. Çoğu tüy hücresi, sürdürülen depolarizasyon sırasında hızla inaktive olan belirgin dışa yönlü akımlara sahiptir. Bu şekil, beynin çıkarılmasından sonra beyin kasasının ventral kısmını göstermektedir.Kemik çanağı çıkarıldıktan sonra, tulo, genus ve sculli ile ilişkili otolitlerin yanı sıra iki utricle ile ilişkili olanlar da üzerlerini örten ince kemik aracılığıyla görülebilir. Otolitlerin varlığı, labirentlerin konumunun belirlenmesine yardımcı olur. Şemadaki kesikli çizgi, sol labirentin yaklaşık çevresini göstermektedir.Labirent izole edildiğinde, sacculus, lagena, utricle ve semisirküler kanallar gibi işitsel ve vestibüler uç organlar tanımlanabilir. Çizim; semisirküler kanalların A, B ve C noktalarıyla birlikte bu yapıların konumunu göstermektedir. D utricle, E sacculus ve f lagena'dır.Tüy hücresi morfolojisindeki çeşitlilik, lega'dan izole edilen hücrelerin yer aldığı bu şekilde belirgindir. Hücreler kabaca iki sınıfa ayrılır: ya ince ya da avokado şeklindedirler. Buna karşılık, sağlıklı hücreler, keskin dış hatları ve belirgin tüy demetleri ile faz kontrastında parlak görünürler.Ek B'de gösterilen ölü hücreler granüler siyah bir görünüme sahiptir. Bu şekil, -70 mV tutma potansiyeli ile -140 mV'den +70 mV'ye kadar 10 milivoltluk artışlarla uygulanan voltaj basamaklarının üç sunumuna karşı bir hücredeki ortalama yanıtları göstermektedir. İnaktive eden akımın daha depolarize potansiyellerde ortaya çıktığına dikkat edin.Yöntem öğrenildikten sonra, prosedürün başlangıcından itibaren 90 dakika kadar kısa bir sürede elektrofizyolojik kayıtlar alınabilir. Ayrıca, üç aşamalı adım ertelenirse ve uç organlar BS çözeltisinde tutulursa, diseksiyonun başlangıcından dört saate kadar sağlıklı hücreler elde edilebilir. Bu hazırlık, yaygın olarak mevcut olan zebra balığı genetik mutasyonları ile birlikte kullanıldığında, işitme dengesizliğinin mekanizmalarının altında yatan moleküler faktörleri incelemek için benzersiz bir model sistem sağlar.

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef iskelet kası aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu video segmental CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, felçli bir zebra balığı larvasındaki afferent nöronlardan gelen elektrik sinyallerinin, lateral hat ganglionunun yakınına bir mikropipet yerleştirerek ve sinyal yakalama için gevşek bir conta oluşturarak kaydedilmesini göstermektedir. Hücre dışı çözelti, bu işlem sırasında nöronal canlılığı korur.

İmmobilize Bir Zebra Balığı Larvasında Afferent Nöronlardan Gelen Elektrik Sinyallerinin İzlenmesi

Bu video, iç kulak duyusal nöron hücre gövdelerindeki iyonik akımları ölçmek için yama-kelepçe tekniğini göstermektedir. Hücre içi koşulları korurken iyon hareketine izin vermek için zarı delen amfoterisin B içeren dahili bir çözelti ile doldurulmuş cilalı bir yama kelepçeli pipetin hazırlanmasını ve kullanımını detaylandırır. Voltaj darbeleri, iyon kanalı aktivitesini tetiklemek ve kaydetmek için uygulanır ve özellikleri ve davranışları hakkında bilgi sağlar.

İç Kulak Duyusal Nöron Hücre Gövdelerinin Delikli Yama-Klemp Kayıtları

Kaynak: Lukasz, D., et al. Larva Zebra Balıklarında Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinin İn Vivo Kalsiyum Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, felçli bir transgenik zebra balığı larvasının lateral çizgi saç hücrelerindeki kalsiyum akışının konfokal mikroskop kullanılarak canlı olarak görüntülenmesini göstermektedir. Saç demetlerinin sıvı darbeleri yoluyla mekanik olarak uyarılması, floresan göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak görselleştirilen mekanotransdüksiyon kanalları ve voltaj...

Larva Zebra Balıklarının Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Larva zebrafish önbeyin ekstrasellüler alanın potansiyellerini kaydetmek için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem, bir sağlam...

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Zebra balığı optik netlik, hızlı harici diller, dahil olmak üzere birçok değerli özellikleri ve işitme ve denge için belirli önemini, dışarıdan duyu saç hücreleri bulunan bir modeli sistemidir. Bu makalede nasıl transgenik zebra balığı özetlenmektedir saç hücreli mechanosensation ve presynaptic fonksiyonu toto tahlil için kullanılabilir.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Keşfedin iç kulak saç hücrelerini izole zebrafish'ten patch clamp kayıtları için. Bu yöntem, voltaj kapılı kanalların biyofiziksel özelliklerini karakterize ederek işitme ve denge fizyolojisini anlamaya katkı sağlar.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Daha fazla video keşfet