Name: Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin, fare kalp dokusundan kromatin bağlı proteinleri izole etme yöntemini. Kantitatif etiketsiz kitle spektrometrisi ile nükleer proteomun özelliklerini analiz edin ve kalp hastalığı mekanizmalarını anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vondriska laboratuar NIH ve UCLA Laubisch Endowment Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir. EM UCLA Fizyoloji Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship alıcısı olduğunu; HC Amerikan Kalp Derneği Pre-doktora bursu sahibidir; MP bir NIH Ruth Kirschstein Doktora Sonrası Bursu alıcı olması ve SF alıcısı bir NIH K99 Ödülü.

Deneysel akışı yedi önemli adımlar (Şekil 1). Kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak olacaktır örnekler içeren herhangi bir iş için, deneyci bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve saç filesi giymek ve toz ve keratin kişisel dökülme kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için özen göstermelisiniz. 1. Kalp Homojenizasyon ve Nükleer İzolasyon Fare kalpleri homojenize edilir ve bir bozulmamış çekirdekler pelet (Şekil 2) izole edilir. <ol><li> , Yetişkin fare Kurban tüketim kalp, buz gibi soğuk PBS içinde yıkayın ve 2 ml içeren (biz Fisher Wheaton Doku Öğütücü, # 08-414-13A tercih, ancak diğer yöntemler eşit derecede iyi çalışır olabilir) cam Dounce buz üzerinde homojenize lizis tamponu (10 mM Tris, pH 7.5, 15 mM NaCI ve% 0.15 v / v Nonidet P-40 [NP-40], deiyonize su içinde artı (diferansiyel olarak çekirdek içeren organel üzerinde hücre zarı lysis oluşumunu hipotonik bir çözeltisi) proteaz ve fosfataz inhibitor karışım: 10 mM sodyum butirat, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluorür [PMSF], 0.2 mM 3 VO 4, 0.1 mM NaF, 1 Roche proteaz pellet/10 ml, Na - lizis tamponu -20 ° C&#39;de bir hafta kadar saklanabilir ). (Not: Biz kütle spektrometresi veri olarak, PBS ile kalpleri serpmek için gerekli bulmak ve analiz ağırlıklı kardiyomiyosit kan kontaminasyonu aksine kökenli [p-değeri 3.8E-22] [p değeri 5.0 olarak proteinleri tespit GO yok E-2].) </li><li> 100 mikron süzgecinden lizat dökün ve 1.5 ml santrifüj tüp yoluyla akışını toplamak. Belirtilmediği sürece, bu noktada, örnek buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 4000 rpm&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatantı. (Bu sitozolüne ve -80 saklanmalıdır ° C. parçalanan mitokondri içerir.) Yeniden süspanse pelet triturating tarafından 200 ul lizis tamponu. (Bu ham Nükleer pellet olduğunu.) </li><li> Sakaroz buff 1 ml 1.5 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne DolguER (% 24 sakaroz ağırlık / hacim, 10 mM Tris, pH 7.5, proteaz ve / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde 15 mM NaCl - sakaroz tampon kullanımının gününde taze yapılmış olmalıdır). 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 5000 rpm&#39;de santrifüj ve sakaroz ped üzerine yavaşça tabaka yeniden süspanse topak </li><li> Üstüne ince bir film olarak sakaroz tampon (membran içeren) çıkarın. 200 ul buz gibi soğuk PBS / EDTA (1 mM EDTA ile 1 x PBS) ile geriye kalan topak durulayın. (Bu çekirdekler pelet ve blot batı veya elektron mikroskobu kullanımı için çözündüğünü veya sabit olabilir [adımları 4.1 ve 4.2 &#39;ye bakınız] zenginleştirme ölçmek için.) </li></ol> 2. Çekirdek plazması ve Deterjan-ekstrakte kromatin Fraksiyonasyon Ham topak gevşek çekirdekleri DNA ile ilişkili proteinler ihtiva eden bir çekirdek plazması ve deterjan ile ekstre kromatin fraksiyon ayrılır. <ol><li> 200 ul deterjan ekstraksiyon tamponu (2 adım 1.6 pelet Karışım0 mM HEPES pH 7.6, 7.5 mM MgCI2. 0.2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M üre,% 1 proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde NP-40 - deterjan ekstraksiyon tampon çözeltisi) -20 ° C&#39;de bir hafta için saklanır. </li><li> Vortex örnek 2 kez, 10 sn her. Buz 10 dakika yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 13,000 rpm&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatantı. (Bu çekirdek plazması ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir). Buz gibi soğuk PBS / EDTA ile pelet durulayın. (Bu kromatin pelet olduğunu.) </li><li> Tris, SDS, EDTA tampon azından bir hafta için hafızada saklanması - 300 ul Tris, SDS, EDTA tampon maddesi (50 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde% 1 SDS içinde pelet Karışım -20 ° C). </li><li> 10 sn her DNA kırmak için 3-6 kez sonikasyon. Sonications arasındaki buz üzerinde örnek tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 13,000 rpm&#39;de santrifüje Süpernatant tutun. (Süpernatant deterjan-Ayıklanan kromatin protein fractio olduğunun ve -80 ° C) sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Geri kalan topak az olmalıdır, ve atılabilir. </li><li> % 10 fetal bovin serumu (FBS) ile Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 1 insülin kültür ardından enzimatik sindirimi ile doğumdan hemen sonra yavruların sıçan bir gün neonatal fare ventriküler miyositlerde izolat yerine bütün izole edilmiş kalp miyositleri kullanılıyorsa transferrine sodyum selenit (ITS), ve% 1 penisilin. 24 saat sonra, serum serbest medya (yukarıdaki gibi aynı, ama FBS eksik) transfer. Hasat lizis tamponu hücreleri (1.1 listelenen), ve adım 1.3 nükleer fraksiyon başlar. </li></ol> 3. Asit-ekstraksiyon Fraksiyonu - DNA-bağlı protein Zenginleştirme Histon gibi sıkıca DNA&#39;ya bağlı proteinler için ayrı bir fraksiyon zenginleştirir. <ol><li> Adımları 1,1-2,4 tekrarlayın. </li><li> 0,4 N sülfürik asit 400 ul kromatin pelet Karışım. Kümeleri kaldırmak için Vortex. </li><li> 30 dk ya da overn için 4 ° C sıcaklıkta inkübeight dönerken. </li><li> 4, 10 dakika için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin ° C Nükleer tortularını çıkarmak üzere. </li><li> Taze bir tüp supernatant aktarın. </li><li> Trikloroasetik asit 132 ul süpernatanına açılan akıllıca ekleyin. Birkaç kez Invert. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin </li><li> Süpernatantı atın. Yavaşça buz aseton ile pelet durulayın. (Bu histon pelet olduğunu.) </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin </li><li> Yıkama tekrarlayın, 3,8-3,9 adımları. </li><li> Hava kuru pelet. </li><li> Tris, SDS, EDTA tamponu ve 100 ul içinde pellet yeniden süspanse edin. 1 M Tris ilave edilerek pH 8 ayarlayın. (PH ayarlı olmayan bir 1 M Tris stoğu kullanın.) </li><li> 15 dakika süreyle su banyosunda sonikasyon. Su banyosu, buz ekleyerek aşırı ısınmayı önleyin. (Bu asit-Ayıklanan fraksiyonu ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir) </li></ol> 4. Saflık Fiyatları Western blot ve elektron mikroskobuçekirdekleri ve diğer organellerin tükenmesi başarılı zenginleştirme onaylayın. Aşağıdaki kalite kontrol testleri için tüm tipik sonuçlarını görmek için, bizim önceki yayın bakın. 18 <ol><li> Western blot analizi gerçekleştirin. Histon H2A veya nucleoporin P62 (zenginleştirme doğrulamak için nükleer işaretleri gibi) ve adenin nükleotid taşıyıcı, bip ve tubulin (mitokondriyal bir işaretleyici, endoplazmik retikulum işaretleyici ve sırasıyla saflığını doğrulamak için sitoskeletal belirteç olarak) her fraksiyonu içeren Prob membran. Histon H3 veya fibrillarin (deterjan ve asit-Ayıklanan kromatin ve bozulmamış çekirdeği) ve SNRP70 veya E2F (çekirdek plazması) için çekirdekler, prob başarılı subfractionation doğrulamak için. Retinoblastom veya hipoksi indüklenebilir faktör-1 (asit-Ayıklanan fraksiyonu üzerinde deterjan-ekstre kromatin zenginleştirilmiş) için prob. HeLa hücre lizat ve bütün kalbi lizat Ek kontrol örnekleri de aynı jel çalıştırmak olabilir: Tris, SDS, ED ekleyerek HeLa hücre lizat kumandayı hazırlayınKültür çanak ve örnek toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak TA tamponu. Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak örnek santrifüj. 2 ml tampon (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,% 1 Triton X-100, 2.5 mM sodyum pirofosfat, deiyonize su içinde 1 mM gliserofosfat olarak kalp homojenleştirici tarafından bütün kalp lisatı kontrol hazırlanması Proteaz ve fosfataz inhibitörü karışımı ile). Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak santrifüj. SDS-PAGE protein örneklerinin hazırlanması için adım 5&#39;e bakınız. </li><li> Elektron Mikroskopi:% 2 gluteraldehit içeren lizis tamponu adım 1.6 çekirdekler pelletini tekrar ve 4 örnek düzeltmek ° C Osmik asit örnekleri durulayın, kurutmak ve epoksi reçine gömün. Bir Reichert ULTRACUT ultramicrotome kullanılarak 70 nm dilimleri kesin. JEOL 100CX Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak uranil asetat ve kurşun ve görüntü örnekleri Leke. Görüntülü malzemenin toplam alana karşı sağlam çekirdeklerin alanı ölçerek zenginleştirme ölçmek. Biz çekirdeklerin% 60-80 bulabilirsinizsağlam olması. 14. </li></ol> Çekirdekler zenginleştirici karşı arındırıcı için önemli hususlar. Bu protokol hastalık sırasında genel gen düzenleme süreçlerine eğitim amacıyla kardiyak kromatin proteomik analizler için geliştirilmiştir. Bütün-proteom kütle spektrometresi deneyler tasarlama önemli bir bileşeni dinamik aralık ve düşük bolluk proteinleri tanımlamak ve karakterize etmek edememek konudur. Çekirdeklerin daha subfractionation yaptığı gibi nükleer proteom için zenginleştiren, nükleer ve kromatin özgü biyolojisi hakkında bilgi sağlama temel amacı ek olarak, bu düşük bolluk proteinleri tespit ihtimali artar. Tartışıldığı gibi Bununla birlikte, yetişkin kardiyomiyosit nükleer membran bağlanmış bir yoğun sitoskeletal bileşeni vardır. Biz tamamen bu diğer hücresel bileşenler çekirdekler saflaştırılmış olduğunu inanmıyorum. Ancak, çekirdeklerin sadece zenginleştirerek, biz elde vared analiz türlerini etkinleştirmek için kabul edilebilir eşik nitelendirdi. Özellikle, bizim ham çekirdekler pelet saflığını değerlendirmek için EM kullanılmaktadır ve bozulmamış kabaca% 10 mitokondri çekirdeklerinin ve dinlenme enkaz olmak fraksiyonu% 60-80 bulduk. Ayrıca, sağlam çekirdeklerin nüfus önceki çalışmamızda, tanıdığımız birçok kas lifçikleriyle bu protokolün bazı proteinler (calsarcin-1) zenginleştirilmiş (Batı ile ölçülen tübülin ve aktin dahil), gerçek bir biyolojik nüfus önererek zenginleştirilmiş değil ise kardiyak çekirdeklerin bu proteinler. 19. Buna ek olarak, bu gen ontoloji göre, bu proteinlerin tahmin rolleri, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonunda mevcut olduğu bulunmuştur proteinleri karşılaştırılmaktadır. Önemlisi, bu gen ontoloji analiz hesabı farklı proteinlerin göreceli bolluk (bizim Western blot verileri gibi) dikkate almaz değil, tespit edilen tüm proteinleri (zenginleştirmek sayareşit olarak ed veya değil) ortak yollar ve hücresel bölümlerin belirlenmesi. Bu yolların ve hücresel bölümlerin analizi bizim daha önceki yayınlarda bulunabilir. 18,20 En önemlisi, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonu içinde zenginleştirme başarısı bize erişkin fare histon miyosit 54 varyantlarının varlığı, 18 tespit izin birçoğu belirlenmesi için bir benzersiz peptid dayanıyordu ve bu zenginleştirme protokol toplam kardiyomiyosit proteom muazzam karmaşıklığı verilen olmadan böylece olasılıkla saptanabilir olmazdı. Bu, kardiyak atom çekirdeklerinden gelen tespit 1.048 proteinleri, n = 56 (% 5.3) nükleozom parçası (ilgi çekirdek bir bileşeni) olarak analiz GO açıklamalı edildi. Bütün kalp bakarak başka bir çalışmada, sadece 11 proteinler (% 0.18) nükleozom 21 parçası olmak için açıklamalı almış olup, 6.180 proteinler tanımlanmıştır. Bu, daha ileri meaningfu için protokol gücünü tariflly nükleer proteinler için zenginleştirmektedir. 5. Protein Jel ve Enzimatik Protein Digest Proteinler kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak için sindirilmiş tek boyutlu SDS-PAGE ve tripsin ile ayrılır. <ol><li> Buz üzerinde örnekleri çözülme ve bicinchoninic asit (BCA) protein deneyi kullanılarak her numune için protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Tek boyutlu SDS-PAGE için -20 ° C &#39;de 10 dakika ve saklamak için 5x Laemmli tampon, kaynatma ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir. İki-boyutlu jeller için -20 ° C &#39;de üre ekstraksiyon tamponu ve depo ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir. </li><li> Her kulvarda protein eşit miktarda yükleme seçim jel çalıştırın. Protein Western blotting (adımda olduğu gibi 4.1 &#39;de kontrol grubu) ya da şeritler kütle spektrometri analizi için kesilmiş olabilir için kullanılmak üzere bir nitroselüloz zarına transfer edilebilir; aşağıdaki adımları bkz. </li><li> Temiz bir kaba aktarmak için deiyonize su kullanılarak cihazdan jel çıkarın.Oriole jel leke ve ışık engellemek için alüminyum folyo ile sarın konteyner örtün. Jel en az 90 dakika süreyle bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> UV ışığı, ve bantlar görüntü üzerinde kesilecek işareti kullanarak Görüntü Oriole lekeli jel (Şekil 3). Biz toplam proteom ölçüm çalışmaları için yaklaşık 25 2 mm bantlar halinde her kulvarın kesti. </li><li> Temiz bir yüzeye jel yerleştirin. Mühürlü tutulmuştur veya keratin kontaminasyonu engellemek için etanol ile püskürtülür sadece malzeme kullanın. Her band Kes, ve daha fazla 3 eşit parçaya dilimleyin. Kendi etiketli 1,5 ml tüp içine birlikte her grubun her üç parçalarını yerleştirin. Jel adet birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Enzimatik sindirim için jel fişler hazırlayın. Özet jel parçalar 37 ° C&#39;da gece boyunca tripsin kullanarak. Detaylı jel örneği protokolü için bizim önceki yayın bkz. 22. Sen tripsin yerine kimotripsin ile düşük molekül ağırlıklı bantları sindirebilir,histon kuyruklarının tripsin kapsamlı bölünme ortadan kaldırmak için. </li></ol> 6. Kütle Spektrometresi ve Veri Analizi Örnekleri LC üzerinde ayrılır ve MS / MS ile analiz edilmiştir. Spektrumu protein tespiti için bir protein veri tabanı karşısında aranır. <ol><li> LC / MS / MS ile her bir örnek 10 ul çalıştırın. Biz 75 mikron ters faz kolon ile nano-akış Eskigent LC kullanın. Protein ve peptidlerin bir dizi için optimize LC işletilen kullanın. Mobil faz bir doğrusal gradyan çalıştırmak A (% 0.1 formik asit,% 2 su içinde asetonitril [ACN]), mobil faz B (% 0.1 formik asit, ACN içinde% 20 su):% 5 mobil fazB 50-60 dakika % B, daha sonra en az% 50, B% 95 B, 15 dakika% 95 ve sabit b, son olarak 10 dakika 200 nl / dak &#39;lık bir akış hızı kullanın. Bir veri bağımlı modunda kütle spektrometresi verileri edinin. Biz iyi 6 en bol ebeveyn iyonları parçaladı bir Thermo Orbitrap kullanın. </li><li> Tekrar en az üç biyolojik için çalışır ve iki teknik çoğaltır. (Recommended) </li><li> Bir arama algoritması (örneğin SEQUEST veya MASCOT gibi) aracılığı ile tercih Uniprot veritabanı karşı spektrumları aramak için; (kamuya açık seçenekleri Prowl dahil, X Tandem, SpectraST! Piyasada mevcut seçenekleri BioWorks ve Xcalibur dahil) yazılımını kullanın. </li><li> Sistein carbamidomethylation ve metionin oksidasyonu, örnek işleme sırasında oluşturulan iki genel değişiklikler için izin vermek için arama parametrelerini değiştirerek düşünün. </li><li> Ters veritabanı arama kullanarak bir yalancı pozitiflik oranı hesaplayınız. </li><li> Bir eşik güven maçlar sadece kabul etmek için protein kimlik filtreleyin. Biz başlatmak için aşağıdaki parametreleri de tavsiye: Xcorr&gt; 3 (+2),&gt; 4 (+3),&gt; 5 (+4); deltaCN&gt; 0.1, uzlaşma skoru ≥ 20, ebeveyn iyon kütle toleransı 2 Da, kütle toleransı ürün iyon 0.5 Da, en az 2 benzersiz başına protein peptitleri ve en fazla 3 bölünmelere kaçırdı. </li></ol> 7. Etiket serbest Kantifikasyonu Deteetiketsiz miktarının (Şekil 4) kullanılarak protein nispi bolluk rmine. <ol><li> Yazılım programları bir dizi sayımı (Prof. Yates grubu), 23 Elucidator (Microsoft), 24 elek (Thermo Scientific), 25 İskele (Proteome Software) dahil olmak üzere, kütle spektrometrisi verileri etiketsiz miktarının belirlenmesi için yayım ya da ticari olarak temin edilebilir. 26 Bu programlar, bozulmamış peptidler ya da iki ya da daha fazla durum arasında nispi bir protein miktarları ile peptid sıralama olayların sayısı, kütle spektrometrik sinyalin korelasyon amaçlamaktadır. </li><li> Her bir program benzer bir analiz boru hattı içeriyor olsa da, bazı programları veri gerçekleştirilebilir spesifik analiz tipleri ile sınırlıdır. Başlangıçta, farklı ishal veri hizalanır, sinyal yoğunluğu normalize edilir ve peptid zirveleri analizi için seçilir. </li><li> En yaygın iki yöntem spektral sayma veya LC-MS pik alanı esas miktar vardır. Bollukoranları farklı gruplar arasında peptit bereket değişiklikleri belirlemek için hesaplanır. </li><li> Bu programlar protein tanımlama miktar bilgileri ilişkilendirmek için proteomik arama algoritmaları (Maskot, Sequest, X! Tandem) ile arabirim olabilir. </li><li> Hem biyolojik (farklı deney örnekleri) ve teknik (kütle spektrometresi üzerinde birden çok kez aynı örnek çalışan) dahil etmek önemlidir verilerin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için kitle spec veri çoğaltır. </li><li> Ve deneysel koşullar arasında peptit bolluk değişimi ANOVA ile değerlendirildi ve PCA (Şekil 5) ile çizilebilir. </li></ol> Etiket serbest ölçümü için önemli noktalar. Etiketi içermeyen niceliklendirme yaparken, özel önem her numune işleme ve ayrı ayrı analiz edilmelidir tutarlı örnek hazırlama, sindirim süresi ve LC-MS/MS koşulları sağlamak için verilmelidir. Met aksine(etiketleme eksikliği onları bir arada çalışan olasılığı ortadan kaldırır çünkü) abolic etiketleme yaklaşımlar, etiket içermeyen deneylerde karşılaştırmalar böylece (numune hazırlık yani, numune analizleri tüm yönleriyle yüksek tekrarlanabilirlik gerektiren, farklı kütle spektrometresi çalışan veri yapılır LC ve MS adım) ve yüksek kütle doğruluğu kütle spektrometre kullanımı. Numune hazırlama ve analiz bilinen bir standart olarak küçük değişiklikler dikkate almak için verilerin normalleştirilmesi yardımcı olmak için her bir örnek için ilave edilebilir. Ayrıca, çoğu yazılım programları enjeksiyon, iyonizasyon ve parçalanma farklılıkları hesaba katmak için veri toplama sonra sinyal şiddetleri arasında normalleşme (arka plan gürültü veya bilinen bol analit ayarlayarak gibi) izin verir. Hizalama algoritması peptid elüsyon profilleri farklılıkları düzeltmek yardımcı yukarıda referans olarak yazılım programları çoğu bulunmaktadır. Biyolojik ve teknik çoğaltır kullanımı olup essenBu istatistiksel analizler protein bolluk içinde gözlenen değişikliklerin tekrarlanabilirlik ve tutarlılığını doğrulamak için izin vermesi, çalışmanın bu tip uzaysal.

<ol><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Rumyantsev, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelations+of+the+proliferation+and+differentiation+processes+during+cardiact+myogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration.</a> Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).</li>
<li>Olson, E. N., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+heart%3A+development+redux+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Sizing up the heart: development redux in disease.</a> Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).</li>
<li>Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+signaling+pathways+that+regulate+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy.</a> Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).</li>
<li>Fishman, M. C., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fashioning+the+vertebrate+heart%3A+earliest+embryonic+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions.</a> Development. 124, 2099-2117 (1997).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+proteins+with+potential+disease+links+found+by+subtractive+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics.</a> Science. 301, 1380-1382 (2003).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Malik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+lamin-dependent+targeting+of+novel+transmembrane+proteins+in+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).</li>
<li>Chu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chromatin+proteomics+identifies+evolutionarily+conserved+fertility+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors.</a> Nature. 443, 101-105 (2006).</li>
<li>Uchiyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+human+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of human metaphase chromosomes.</a> J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Moore, D. H., Ruska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+mammalian+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells.</a> J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).</li>
<li>Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cardiac+hypertrophy%3A+a+quantitative+ultrastructural+study+in+the+compensatory+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
<li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).</li>
<li>Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+software+tool+for+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).</li>
<li>Kamleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+using+Orbitrap+Fourier+transform+mass+spectrometry+with+hydrophilic+interaction+chromatography%3A+a+method+with+wide+applicability+to+analysis+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).</li>
<li>Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%3A+a+bioinformatic+tool+for+validating+MS%2FMS-based+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies.</a> Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).</li>
<li>Murray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Proteins+of+Cell+Nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Basic Proteins of Cell Nuclei.</a> Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).</li>
<li>Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fractionations+of+arginine-rich+histones+from+calf+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus.</a> Biochem. J. 77, 631-636 (1960).</li>
<li>Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+methods+for+purification+of+histones+from+cultured+mammalian+cells+with+the+preservation+of+their+native+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications.</a> Nucleic Acids Res. 37, e81(2009).</li>
<li>Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+high-mobility-group+proteins+in+the+nucleus+and+cytoplasm+of+several+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues.</a> J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).</li>
<li>Gronow, M., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+separation+of+the+non-histone+proteins+of+rat+liver+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei.</a> FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).</li>
<li>Mischke, B. G., Ward, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+tissue+specificity+of+chromatin-associated+proteins+in+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba.</a> Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+proteomic+analysis+of+the+human+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed proteomic analysis of the human nucleolus.</a> Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).</li>
<li>Zhao, Y., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+strategies+for+characterization+of+post-translational+modifications+using+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques.</a> Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).</li>
<li>Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+identification+of+modified+proteins+using+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS.</a> Proteomics. 10, 671-686 (2010).</li>
<li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Nükleer izolasyonu için iki temel yolu önceden gözden geçirilmiştir: 27 tek bir sulu sakaroz / tuz çözeltisi içinde doku homojenleştirici bir sulu olmayan çözücü içinde liyofilize doku homojenleştirici arasında Behrens teknik ve ikinci olarak, burada kullanımı olan bir değişiklik, bir izlenen diferansiyel veya yoğunluk gradiyenti santrifüj yoluyla. Doku örnekleri asit ekstraksiyon ile çekirdeklerin Subfractionation histon analiz olmanın orijinal amacı ile 1960, 28 beri ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Dulbeco Modifiye Kartal Orta </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Proteaz pelet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 mikron süzgeçli </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> ULTRACUT ultramicrotome </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX Transmisyon Elektron Mikroskop </td><td> JEOL USA, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Sarıasma kuşu </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Histon H2A antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin P62 antikor </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenin Nucleogelgit taşıyıcı antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> Bip antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubulin antikoru </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Histon H3 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarin antikor </td><td> Hücre Sinyal </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 antikoru </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastom antikor </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Hipoksi indüklenebilir faktör-1 antikoru </td><td> Novus Biyolojik </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA protein tayini </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Faz kolon Ters </td><td> Yeni Objuygulamada etkili </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorks Tarayıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

hastalığında kromatin proteomlar kantitatif analiz

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Çekirdeğin içinde olan fonksiyonlar en yakından gen regülasyonu ile bağlantılı proteomlarda bulunur. Erişkin memeli kardiyomiyosit çekirdeklerinin nükleuslu hücrelerin oranı yüksek, 1 DNA ağırlıklı heterokromatik durumu nedeniyle benzersizdir ve geliştirme sırasında interfaz kalıcı bir devlet yetişkin çekirdekleri işler kardiyomiyosit-olmayan bölünmesi doğası. 2 Transkripsiyonal düzenleme ve Hastalığın sıra bu proteinlerin hastalığı sırasında meydana transkripsiyonel programları değişiklikleri kontrol nasıl bu organ, 3-5 okudu ama ne nispeten keşfedilmemiş kalır DNA paketlenmesi ve ifade sorumlu nükleer proteinler oynadığı rol ve oylandı. 6 geliştirilen yılında dünya, kalp hastalığı erkekler hem de kadınlar için ölüm bir numaralı nedenidir. nükleer proteinleri bu hastalığın ilerlemesini düzenleyen işbirliği nasıl 7 Insight güncel tedavi o ilerleyen için kritikeçenekler. Kütle spektrometresi bu hastalıkla nasıl bu proteinlerin bolluğu değişiklikler için nükleer proteom ve göreli kantifikasyon tarafsız bir açıklama sağlayan bu soruların iletilebileceği ideal bir araçtır. Son zamanlara kadar memeli nükleer protein kompleksleri, 8-13 için çeşitli proteomik çalışmalar varken 14 kardiyak nükleer proteom inceleyen sadece bir çalışma olmuştur ve oldukça nükleer alt bölmeleri düzeyinde proteom keşfetmek yerine, tüm çekirdek olarak kabul . Büyük bir kısmı 15, bu iş sıkıntısı kardiyak çekirdeklerin tecrit zorluk kaynaklanmaktadır. Kardiyak çekirdekler miyosit daralma değiştiren kendi genel şekli. 16 Ayrıca, kardiyomiyositlerde hacmi 17 ile% 40 mitokondri olduğu ölçüde, onlar endoplazmik retikulum birden uzantıları aracılığıyla bağlı bir katı ve yoğun aktin-miyozin aygıtı içinde ortaya çıktığı Necessitadiğer organeller dışında çekirdeğin zenginleştirme tes. Burada biyolojik ilgili bölmeye kardiyak nükleer zenginleştirme ve daha fazla fraksiyonasyon için bir protokol açıklar. Ayrıca, metabolik etiketleme mümkün değildir çeşitli hayvan modelleri ve organ sistemleri in vivo deneyler için mükellef bu fraksiyonların-teknikleri etiketi ücretsiz kantitatif kütle spektroskopisi diseksiyon için detaylı yöntemleri.

Şekil 4 Göreceli ölçüm bu formun programı vurgular. Sol paneldeki Gösterildi protein HMGB1 (veritabanı araması yoluyla tanımlanır) ait olarak atanmış tek tek izotoplu peptid zirveleri (farklı fareler bindirilmiş) vardır. Her bir tepe noktası, aslında belirli peptit için bir ekstre iyon kromatografisi, farklı bir fare gelir. Üç biyolojik her grup için tekrarlı, bazal, kardiyak hipertrofi ve kalp yetmezliği: grup üç farklı fizyolojik durumları temsil eder. Eğrinin altında kalan alan entegre edilmesiyle, b...

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca uygulanabilir<em&gt; In vivo</em&gt; Insan hastalık modelleri.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Çekirdekte, işlevleri gen regülasyonu ile en yakından ilişkili olan proteomlar bulunur. Erişkin memeli kardiyomiyosit çekirdekleri, ... nedeniyle benzersizdir.

Bu prosedürün genel amacı, fare kalbinden kromatine bağlı proteinleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle kalbin homojenize edilmesi ve ardından kardiyak çekirdeklerin sükroz yoğunluk gradyenti ile izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nükleoplazma kromatin fraksiyonundan ayrılır.Ardından, DNA'ya gevşekçe bağlanmış proteinleri zenginleştirmek için kromatin peletinden proteinler ekstre edilir. Son olarak, DNA'ya sıkıca bağlanmış proteinleri zenginleştirmek için farklı bir kromatin peletinden proteinler ekstre edilir. Nihayetinde, kantitatif etiketsiz kütle spektrometrik analiz yoluyla farklı fizyolojik koşullar altında nükleer proteomun özelliklerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, kromatin yeniden şekillenmesinin kardiyak hipertrofiye ve yetmezliğe nasıl katkıda bulunduğu gibi kardiyak alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yetişkin bir fare kurban edilip kalp çıkarıldıktan sonra, kalp buz soğukluğunda PBS ile durulanır. Ardından, kalp, proteaz ve fosfataz inhibitör karışımı içeren iki mililitre lizis tamponu ile bir cam havan içine yerleştirilir ve homojenize edilir.Lizatları 100 mikronluk bir süzgeçten geçirin ve süzüntüyü 1,5 mililitrelik bir tüpe toplayın; aksi belirtilmedikçe, bu noktadan itibaren örneği buz üzerinde tutun. Örneği 4 °C'de, 4.000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Sitozolu içeren süpernatantı toplayın ve -80 °C'de saklayın.Pellet 200 µL lizis tamponu ile yeniden süspande edilir. Yeni bir tüpe 1 mL sükroz tamponu ekleyin ve yeniden süspande edilen pelleti bir transfer pipeti kullanarak sükroz yastığının üzerine nazikçe yerleştirin; 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 RPM'de santrifüjleyin. Üstteki ince filmi ve membran içeren sükroz yastığını uzaklaştırın.Çekirdekleri içeren kalan peleti 200 µL buz gibi soğuk P-B-S-E-D-T-A ile yıkayın, çekirdek içeren peleti 200 µL deterjan ekstraksiyon tamponuna alın ve numuneyi iki kez, her biri 10 saniye olacak şekilde vorteksleyin. Numuneyi 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve ardından 4 °C'de, 13.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Nükleoplazma proteinlerini içeren süpernatantı uzaklaştırın ve -80 °C'de saklayın.Pelletleri buz gibi soğuk P-B-S-E-D-T-A ile durulayın ve 300 µL Tris, S-D-S-E-D-T-A tamponu içinde yeniden süspande edin. Örneği, her biri 10 saniye sürecek şekilde üç ila altı kez sonike edin. DNA'yı parçalamak için, sonikasyonlar arasında örneği buz üzerinde tutarak, 4 °C'de beş dakika boyunca 13.000 RPM'de santrifüjleyin.Histonlar gibi DNA'ya sıkıca bağlı proteinleri zenginleştirmek için, izole proteini içeren süpernatantı saklayın ve -80 °C'de depolayın. İzole edilmiş yetişkin sıçan kalbi veya kardiomyositleri kullanarak kromozomu izole etmek için ayrı bir fraksiyona başlayın. Kromatin peletini 400 µL 0,4 N sülfürik asit içinde tritüre edin ve vorteksleyin. Topakları gidermek için örneği 4 °C'de 30 dakika veya gece boyu döndürün; inkübasyondan sonra, nükleer kalıntıları 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g'de santrifüj ederek uzaklaştırın.Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve örneğe damla damla 132 µL trikloroasetik asit ekleyin. Tüpü birkaç kez altüst edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Santrifüjden sonra süpernatantı atın ve histon içeren peleti nazikçe durulamak için buz gibi soğuk aseton kullanıp tekrar santrifüjleyin.Yeniden süspande etmeden önce pelleti tekrar aseton ile yıkayın ve havada kurutun. 100 µL Triss S-D-S-E-D-T-A tamponu kullanın. pH değerini sekize ayarlamak için 1 M triss kullanın.Numuneyi bir su banyosunda 15 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Numuneyi -80 °C'de saklayın. Saflığı belirlemek ve burada gösterilen proteinleri tanımlamak için analizleri gerçekleştirmek amacıyla kütle spektrometrisi kullanın.HMGB1 proteinine eşlenmiş tek bir peptit için üst üste bindirilmiş ekstre iyon kromatogramları. Her kromatogram farklı bir kromatin örneğinden elde edilmiştir ve örneğin alındığı farenin fizyolojik durumunu temsil edecek şekilde renklerle kodlanmıştır. Bazal kardiyak hipertrofi ve kalp yetmezliği fizyolojik koşullarının her biri için üç biyolojik tekrar analiz edilmiş ve her örnek iki kez analiz edilerek toplam 18 kromatogram elde edilmiştir.Eğri altındaki alan entegre edilerek, her tekerrür için göreceli bolluk belirlenebilir. Bu panelde, genel bolluk değerlerini elde etmek için üç fizyolojik durumun her biri için altı tekerrürün ortalaması alınmıştır. Bu analizden, burada görüldüğü üzere, HGB one bolluğunun hastalığın seyri sırasında değiştiği açıkça anlaşılmaktadır.Bu peptid için elde edilen fragmantasyon spektrumu, amino asit dizilimini doğrulamakta ve onun HMGB1 proteinine eşlenmesini sağlamaktadır. Buna karşılık, histon H4 proteininden farklı bir peptidin miktarsal analizi, bolluğunun hastalıkla birlikte değişmediğini göstermektedir. Farklı fizyolojik durumlar arasında gözlemlediğimiz peptid bolluğu değişimlerinin tekrarlanabilirliğini istatistiksel analizler kullanarak inceleyebiliriz.İlk olarak, her tekrarda tanımlanan tüm peptidlerin bolluğu ANOVA'ya, ardından temel bileşen analizine (PCA) tabi tutulur. Bu grafikte hem teknik hem de biyolojik tekrarların kümelenmesi, kütle spektrometresi ile tespit edilen bolluk değişimlerinin farklı hastalık durumları arasında tutarlı ve tekrarlanabilir olduğunu doğrular. Mavi renkte bazal, kırmızıda hipertrofi ve yeşilde yetmezlik durumları belirtilmiştir; sonuçların nicelendirilmesi ve tekrarlanabilirliği kadar önemli olan bir diğer husus, nükleer alt fraksiyonlama sayesinde nükleer proteom kapsamının artırılmış olmasıdır.Bu şekil, yalnızca tüm çekirdeğin analiz edilmesinin, ayrı bölmelerden gelen bireysel analizlerin birleştirilmesiyle tanımlanan çekirdek proteinlerinin çoğunu bile ortaya çıkarmada yetersiz kaldığını göstermektedir. Ayrıca, farklı fraksiyonlar arasındaki orta düzeydeki örtüşme, çekirdek fonksiyonu ve gen regülasyonu hakkında ek bilgi edinmek için bu bölmeleri ayrı ayrı değerlendirmenin biyolojik önemini kanıtlamaktadır. Son olarak, asitle ekstrakte edilmiş veya deterjanla ekstrakte edilmiş kromozomların spesifik olarak fraksiyone edilebilme yeteneği, histonlar gibi temel kromatin yapısal proteinlerini zenginleştirerek, her bir varyant ve izoform için spesifik antikorlara ihtiyaç duymadan bir protein grubu üzerinde daha odaklanmış kütle spektrometrik analiz yapılmasına olanak tanır. Bu prosedürü uygularken, kütle spektrometresinde analiz edilecek tüm numunelerin keratin kontaminasyonundan arındırılmış olarak tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu durum, protein izolasyonunu takip eden sonraki aşamalarda özellikle önemlidir.

quantitative-analysis-of-chromatin-proteomes-in-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Bu roman proteinler DNA etkileşim belirli hedef loci, çapraz kromatin sonraki proteomik analizleri için yakalanması fingerprinting dayanarak, tanımlamak için bir yöntemdir. Potansiyel proteinler, ne de hücre değişiklikleri hakkında hiçbir ön bilgi gerekli. Başlangıçta Maya için geliştirilen, teknoloji şimdi memeli hücreleri için adapte edilmiştir.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) tarafından tanımlanan kodlamayan varyantların işlevsel etkilerini üç boyutlu kromatin etkileşimleri kullanarak belirlemek için bir protokol sayılmiyoruz.

Kromatin Konfigürasyonunun Hesaplamalı Analizini Kullanarak Alzheimer Hastalığı Varyantlarının Hedef Genlerine Haritalanması

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Öğrenin, fare kalp dokusundan kromatin bağlı proteinleri izole etme yöntemini. Kantitatif etiketsiz kitle spektrometrisi ile nükleer proteomun özelliklerini analiz edin ve kalp hastalığı mekanizmalarını anlayın.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Daha fazla video keşfet