Name: Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon Manduca Sexta Larva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin Manduca sexta larvalarında bakteri enjeksiyonu ile patojenite değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, bakteri virülansını ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Goodrich-Blair laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard ve Youngjin Park bu protokolün gelişmesine katkılarından dolayı. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0950873 ve Sağlık NRSA dostluk FAI084441Z Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.

1. Böcek Yumurta Sterilizasyon ve Yetiştirilmesi <ol><li> 900-1,000 ml H 2 O içinde sağlanan agar ilk otoklavlanarak 15 g diyet hazırlayın Hemen sonra iyi bir laboratuvar blender 166 gr buğday tohumu diyet ve harmanı ile otoklav, karıştırın. 4 de alüminyum folyo için diyet aktarmak, ardından serinlemek için bir tabak (veya yemekleri) dökün, sıkıca sarın ve mağaza ° C </li><li> Girişte, M. sterilize ara sıra karıştırarak, 90 mm ​​filtre kağıdı ile bir cam filtre tutucu ve termos aparat, 2-3 dakika süreyle% 0.6 çamaşır suyu çözeltisi 250 ml Sexta yumurta. </li><li> Yıkama başına 250 ml steril distile H 2 O ile çamaşır suyu çözeltisi ve yıkama yumurta 3-4 kez tahliye için vakum açın. </li><li> Bir Petri plaka kapağı yerleştirilmiş taze 90 mm filtre kağıdı yumurta aktarın ve onları kurutun kadar birlikte artık sopa (20-30 dk.) </li><li> Her kabı yaklaşık 40 yumurta koyarak, böcek diyet ile plastik kaplar altına yumurta aktarın(Şekil 1A). Yumurta nem kaynaklı fungal kontaminasyonu önlemek için diyet ayrılır. 8 saat karanlık fotoperiyodun: 16 saat ışık ile 26 yumurta ° C koruyun. Enkübasyon öncesinde sarı-beyaz renk hafifletir. </li><li> Kuluçka tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde alt (Şekil 1B) üzerinde bir diyet ile yeni konteyner yaklaşık 25 larvası her bir aktarın. Bu onların kırılgan erken gelişim aşamalarında onlara zarar vermemek için forseps kullanarak uzun siyah boynuz tarafından her larva almak için önemlidir. Yukarıdaki gibi 2 gün için inkübe edin. Larva ölüm bu aşamada alışılmadık olsa da, bazı ölü ya da daha büyük olasılıkla, gelişimsel bodur larva görülebilir. Bu tür böcekler fazla çalışma dışı ve donma sonucu feda edilmelidir. </li><li> Yamyamlık davranışları, yemek küçük parçalar (Şekil 1C) ile bireysel kaplara transferi larva önlemek ve yukarıdaki gibi inkübe etmek. Böcek gelişimini izlemek, yemek yerine ve temizlik dışkı ouher gün konteyner t onlar üçüncü larva dökücü (genellikle 6-9 gün yumurtadan sonra) geçmesi kadar. Bu böcek gövdesi (Şekil 1D) boyunca çizgili her proleg ve artan önem üzerinde siyah kanca benzeri Kroşe ve görünümü ile karakterize, 4. evre larva aşamasında olduğunu. Larva boyutu önemli ölçüde değişebilir, ancak genellikle 4. evre evre girdikten 0.15-0.4 gr ağırlığındadır. Benzer boyuttaki larvaları enjeksiyon için seçilmelidir. </li></ol> 2. Enjeksiyon için Bakteri hazırlanması <ol><li> Eğer test etmek isteyen büyüme fazı için standart prosedürlere uygun olarak, test edilecek olan bakteri suşu (ler) büyütün. </li><li> Her bir bakteri suşunun Pelet 500 ul, oda sıcaklığında 13,000 rpm&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 2 dakika için eğirme ile test edilmelidir. </li><li> 1 ml steril 1x fosfat süspanse hücreleri yukarıdaki gibi tekrar tamponlu salin (PBS) ve pelet. </li><li> 0.5 ml steril 1x PBS ve mea içinde süspanse edin hücrelerisüspansiyon emin optik yoğunluk (OD). Gerekirse, aynı OD her süspansiyonlar seyreltilir. İstenirse, steril büyüme ortamı aynı zamanda, 1 x PBS yerine hücre yeniden süspansiyon ve seyreltme için kullanılabilir. </li></ol> 3. 4. evre larvalar Enjeksiyon <ol><li> Her bir seyreltme için yeni bir pipet ucu kullanılarak steril PBS içerisinde 1 x 96-kuyu mikrotiter plaka 6 kuyu içinde ilk olarak bakteri suşunun seri 10-kat dilüsyonu, (Şekil 2A) hazırlayın. Her bir kuyudaki hücre süspansiyonu nihai hacimli enjeksiyon (böcek başına 10 ul) artı plaka için 20 ul inokulum (adım 3.2 ve 3.7 &#39;ye bakınız) için gerekli hacim aşmalıdır. </li><li> Uygun bir büyüme ortamı içeren bir Petri plaka üst kısmındaki 5 dilüsyonları (10 -6 ile 10 -2) için spot 10 ul her. Noktalar merkezi (Şekil 2B) yayılmış böylece kompaktörü yatırın. </li><li> Buz üzerinde kaplarda böcek diyet ve dışkı ve yerde böcekler kaldıryaklaşık 5 dk. </li><li> 3 kez% 70-100 etanol, 2 tüplerin her biri, steril H2O (Şekil 2C) bir tüp ardından durulama yoluyla şırınga iğnesi sterilize edin. Sıvı hacmi batırmak iğne için yeterli olmalıdır. </li><li> Hemasitometre kullanarak bir mikroskop altında seyreltik hücre süspansiyonları quantitate. İstenen inokulum bağlı olarak, iyi bir uygun mikro-titer (Şekil 2B) 10 ul çizin. </li><li> Svab böcek% 95 etanol ile yüzey ve karın prolegs biri arkasından (45 ° &#39;den daha az), bir açıyla böcek içine 10 ml hücre süspansiyonu enjekte edilir. Ponksiyon gut vermemeye özen ve sadece epidermal tabakasında (Şekil 2E) altında içeriğini enjekte. Hemolimf bazı kaybı (berrak, yeşil-mavi sıvı) normal olsa da, enjeksiyon yerinde çıkan partikül madde ve sarı sıvı bağırsak delinmesi göstergesidir. Bu durum oluşursa, böcek kurban ve yeniden yeni bir larva eldeyerleştirin. </li><li> İlk enjeksiyon grubunda kalan her böcek için adım 3.6 tekrarlayın. İğne sterilizasyon kirlenme meydana gelmedikçe bakteri suşu ile aynı seyreltme ile enjekte edilen her bir böcek arasında gerekli değildir. Alternatif olarak, tekrar eden dağıtıcı örnekleri arasında enjeksiyon hacmi daha fazla tutarlılık için kullanılabilir. </li><li> Bakteri suşu ile birinci her böcek enjekte edildikten sonra, bu süre plakasının ortasında, hücre süspansiyonları lekelenme ve alt kısmından başlayarak akış (Şekil 2F) sağlayarak, aşama 3.2 &#39;tekrarlayın. Uygun sıcaklıkta inkübe plakaları ve inokulum Numaralandırılacak kolonileri saymayın. Bu ikinci adım, bu kaplama, birinci ve ikinci kaplamalar arasında farklı koloni sayısı neden olacaktır gibi örnekleri, enjeksiyon işlemi sırasında kontamine olmadığını doğrulamak için kullanılır. </li><li> Tekrar denemeye bakteri her bir suş için 3.8 ile 3.1 adım. Son olarak, bir ster kullanarak steril 1x PBS ile 3-5 böcekler enjekteBir negatif kontrol grubu olarak Ile iğne. 8 saat karanlık fotoperiyodun: 16 saat ışık ile 26 ° C&#39;de inkübe böcekler. </li><li> Enjeksiyonundan sonra zamanla böcek hayatta izleyin. Böcek ölümü stimülasyonu üzerine istemli hareket eksikliği olarak karakterize edilir. Böcekler genellikle Ölmeden önce enfeksiyon sırasında iştah kaybı, ishal (sulu, sarı dışkı), ve / veya su kaybı (&quot;terleme&quot;) sergilerler; bu özelliklerin yanı sıra kayda değer olabilir. </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
<li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li>
<li>Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li>
<li>Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li>
<li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+histidine+kinase%2C+EnvZ%2C+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li>
<li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li>
<li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li>
<li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li>
<li>Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project">http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project</a> (2012).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li>
<li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li>
<li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li>
<li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li>
<li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism%2C+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li>
<li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modulation+of+immunity%3A+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li>
<li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

M. direkt enjeksiyon Burada açıklandığı gibi entomopatojen bakterilerle Sexta larva, bakteriyel virulans analiz için basit ve etkili bir araç olarak hizmet vermektedir. Yöntemi farklı deneysel konularda ve / veya koşullara göre aynı zamanda son derece uyarlanabilir. Bakteriler enjeksiyon öncesinde çeşitli şekillerde hazırlanabilir. X&#39;in durumda nematophila, orta-günlük faz besin açısından zengin Luria-Bertani (LB) ortamda yetişen yabani türü hücre enjeksiyonu izleyen 30 saat içind...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 90 mm filtre kağıdı </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Cam filtre tutucusu </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca Sexta yumurta </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Gypsy Moth Diyet + agar </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 oz. Plastik kaplar ve kapakları </td><td> Yalnız Kupası Şirketi </td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz. Plastik kaplar ve kapakları </td><td> DART Konteyner A.Ş. </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM 2 Na HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 &#39; </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> 30 gauge, 0.375 &quot;uzunluğunda, gelin tarzı 2 </td></tr></tbody></table>

ve yetiştirme ve enjeksiyon<em&gt; manduca sexta</embakteriyel virülans değerlendirememesi&gt; larva

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Yaygın olarak bilinen bir tütün hornworm Manduca Sexta, domates ve tütün içeren solanaceous bitkilerle beslenen, önemli bir tarımsal zararlıların olarak kabul edilir. M. duyarlılık entomopatojenik bakteri türleri 1-5, hem de böcek bağışıklık sistemi 6-8 ile ilgili olarak mevcut olan bilgi birikimini çeşitli Sexta larva ve beklemede olan genom sekansı 9 bu konak-mikrop etkileşimleri araştırılmasında kullanım için iyi bir model organizma yapmak patogenezi sırasında. Buna ek olarak, M. Sexta larvaları diğer duyarlı böcek türüne laboratuar göreli olarak işlemek ve sürdürmek için nispeten büyük ve kolay. Onların büyük boyutu da enfeksiyona konak yanıtının analizi için etkili doku / hemolimf ekstraksiyon kolaylaştırır. Burada sunulan yöntem M. hemocoel içine bakterilerin direkt enjeksiyon (kan boşluğu) açıklar Sexta larva. Bu yaklaşımsadece enjeksiyonundan sonra böcek ölüme zaman izleyerek, çeşitli bakteri türleri, suşları, ya da mutantlarının virülans özelliklerini incelemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem genellikle böcek girmesinden kazanmak için bir araç olarak nematod vektörleri ile ilişkilendirmek Xenorhabdus ve Photorhabdus türlerin patojenite incelemek için geliştirilmiştir. Entomopatojen nematodlar genellikle doğal sindirim veya solunum açıklıklar yoluyla larva enfekte ve böcek hemolimf (kan) kısa bir süre sonra 10 içine onların simbiyotik bakteri içeriğini yayınlayacak. Burada açıklanan yöntem ve böylece enjeksiyon böcek üzerinde bakteri ve nematod etkileri ayrılmasının bir nematod vektör için ihtiyaç atlar. Bu yöntem, nickleme 11 ve oral toksisite deneyleri 12 de dahil olmak üzere, entomopathogenesis analiz etmek için var olan diğer yöntemler kullanılarak mümkün değildir inokulum, içinde bulaşıcı malzemenin doğru sayımı (hücre ya da protein) için olanak sağlar <edirekt enjeksiyon yöntemi tam hücreli inokulum virülans adresleri ise m&gt;. Ayrıca, oral toksisite testleri, larvaların sindirim sistemine girmiş salgılanan toksinler virülans ele. Burada açıklandığı gibi direkt enjeksiyon yöntemi programı Böcek ölümleri takip ederek bakteriyel patogenez analiz etmektir. Bununla birlikte, bu metod M. üzerindeki enfeksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak kullanılmak üzere genişletilebilir Sexta bağışıklık sistemi. Böcek humoral ve hücresel yanıtları hem yoluyla enfeksiyona yanıt verir. Beden irinterine ait tepki ile ilişkili bakteri desen ve tanıma farklı antimikrobiyal peptitler daha sonraki üretim 7 içerir; bu peptitlerin kodlayan genlerin ekspresyonu RNA ekstraksiyonu ve PCR kantitatif 13 aracılığıyla doğrudan enfeksiyonu takiben izlenebilir. Enfeksiyon hücresel yanıt nodülasyon, kapsülleme ve hemocytes 6 Enfeksiyöz ajanlar fagositozu içerir </sup&gt;. Bu tepkileri analiz etmek için, enjekte böcekler disseke ve mikroskopi 13, 14 tarafından görüntülenebilir.

Böcek ölümleri bir tahlil temsili bir örneği Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. Bu deneyde, böcekler ya da vahşi tip (ATCC19061) veya orta-log fazı (zorlanma başına n = 6 böcekler) için yetiştirilen Xenorhabdus nematophila bir zayıflatılmış mutant suşu (LRP 13) yaklaşık 50 koloni oluşturan birim (CFU) enjekte edildi. Böcekler yaklaşık olarak 72 saat süre ile izlenir ve her bir timepoint hâlâ hayatta enjekte edilen böceklerin yüzde kaydedildi. Bu durumda, zayıflatılmış gerginli...

Yöntemin hemocoel içine entomopatojenik bakteri doğrudan enjeksiyon kullanır burada açıklanan<em&gt; Manduca Sexta</em&gt; Böcek larvaları.<em&gt; M. Sexta</em&gt; Piyasada bulunan ve iyi çalışılmış böcek türüdür. Bu nedenle, bu yöntem, bir veya her iki ortağın perspektifinden konak-bakteri etkileşimleri analiz için basit bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Yaygın olarak tütün tırtılı olarak bilinen Manduca sexta, tütün ve ... dahil olmak üzere solanaceous bitkilerle beslenen önemli bir tarımsal zararlı olarak kabul edilmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, model organizma olarak manduka seca kullanarak bakteriyel patojeniteyi böcek larvaları üzerinde değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle böcek larvalarının sterilize edilmiş yumurtalardan gelişimlerinin dördüncü instara kadar yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, bakteriyel örnekler enjeksiyon için hazırlanır.Ardından, bakteriler dördüncü instar manduka seca larvalarına enjekte edilir. Son adımda, enjeksiyondan sonraki zaman içerisinde böceklerin ölümleri izlenir. Son olarak, böceklerin ölüm süresi kaydedilir ve bakteriyel virulansı değerlendirmek için kullanılır.Bu yöntem, yeni böcek patojenlerinin keşfi ve bakteriyel türler veya suşlar arasındaki virülans farklılıklarının belirlenmesi dahil olmak üzere, simbiyoz alanındaki temel konuların ele alınmasına yardımcı olabilir. İlk olarak 15 gram agarın 900 ila 1000 mililitre su içinde otoklavlanmasıyla başlayın. Otoklavlama işleminden hemen sonra.Helezonu 166 gram buğday ruşeymi diyeti ile karıştırın. Laboratuvar tipi bir blenderda, harmanlanmış böcek diyetini bir kaba dökün. Soğuduğunda, diyeti kaptan bir alüminyum folyo parçasına aktarın.Sıkıca sarın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Vardığında, M cinsiyetindeki yumurtaları 90 milimetrelik filtre kağıdı içeren bir cam filtre tutucu ve vakum düzeneği içerisine yerleştirin. Ardından, yumurtaların üzerine 250 mililitre %0,6'lık çamaşır suyu çözeltisi dökün ve ara ara karıştırarak iki ila üç dakika bekletin.Şimdi, çamaşır suyu çözeltisini boşaltmak için vakumu açın ve ardından sterilize edilmiş yumurtaları, her yıkamada 250 mililitre steril distile su kullanarak üç ila dört kez yıkayın. Ardından, bir Petri kabı kapağına taze 90 milimetrelik bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve yumurtaların birbirine yapışmayacak kadar kurumaları için onları bir laminer akış kabininde filtre kağıdına aktarın. Şimdi, birkaç plastik kaba sabitlenmiş bir kauçuk tıpa üzerine yeni hazırlanmış böcek diyetini yerleştirin ve nem kaynaklı fungal kontaminasyonu önlemek için yumurtaları diyetten ayırarak her kaba yaklaşık 40 yumurta aktarın.Yumurtaları, 16 saat ışık ve sekiz saat karanlık şeklinde bir fotoperiyot ile 26 °C'de tutun. Yumurtalar, çıkış tamamlanmadan önce sarı-beyaz bir renge açılacaktır. Her bir larvayı uzun siyah boynuzundan pens yardımıyla tutarak, tabanında besiyeri bulunan yeni kaplara yaklaşık olarak her birine 25 larva gelecek şekilde dikkatlice aktarın.Larvaları yumurtalarla aynı koşullarda iki gün boyunca inkübe edin; bu aşamada larval ölümler nadir görülse de, bazı ölü veya daha yüksek ihtimalle gelişimsel olarak gerilemiş larvalar gözlemlenebilir. Ardından, kanibalistik davranışları önlemek için larvaları küçük miktarlarda yiyecek içeren ayrı kaplara aktarın ve tekrar inkübe edin. Böcekler üçüncü larval tüy dökme aşamasına geçene kadar gün aşırı yiyecekleri yenileyin ve kaplardaki dışkıları temizleyin.Üçüncü larval deri değişimi, her proleg üzerinde siyah kanca benzeri kroşetlerin görülmesi ve böcek gövdesi boyunca uzanan çizgilerin daha belirgin hale gelmesiyle karakterize edilen dördüncü instar larval evredir. Test edilecek istenen bakteri suşları üretildikten sonra, her bir bakteri suşunun 500 µL'sini oda sıcaklığında, 17,000 ×g hızında bir mikro santrifüjle iki dakika boyunca çöktürün. Ardından, pelletleri aynı koşullar altında bir mL steril PBS ile yıkayın.Hücreleri yarım mililitre daha steril PBS içinde yeniden süspanse ettikten sonra, enjeksiyonlara başlamadan önce süspansiyonların optik yoğunluğunu ölçün; her dilüsyon için yeni bir pipet ucu kullanarak, ilk bakteri suşunun steril PBS içinde 96 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasına altı seri on katlı dilüsyonunu hazırlayın. Şimdi, uygun besi ortamı içeren bir Petri plağının üst kısmına, 10⁻² ile 10⁻⁶ arasındaki dilüsyonların her birinden 10 µL damlatın. Ardından, damlaların merkeze doğru yayılması için plağı eğik tutun.Ardından, böcek diyeti ve dışkısı uzaklaştırıldıktan sonra, böcekler soğumaları için böcek kaplarını yaklaşık beş dakika boyunca buza yerleştirin. Bir şırınga iğnesini, %70 ila %100 etanol içeren iki tüpün her birinde üçer kez, ardından bir tüp steril su ile durulayın. Daha sonra, mikroskop altında seyreltilmiş hücre süspansiyonlarını miktar belirlemek için bir hemositometre kullanın.İstenen inokulüme bağlı olarak, uygun mikrotitre kuyucuğundan 10 µL çekin. Ardından, enjekte edilecek böceğin yüzeyini %95 etanol ile silin. İğneyi yönetirken ve aynı zamanda böcek bağırsağını delmemeye dikkat ederken, böceği enjeksiyon için uygun konumda tutmak en zorlayıcı kısımdır.Ayrıca, böcekten enjeksiyon için tutarken ısınmaması ve kıvranmaya başlamaması için hızlı çalışmaya dikkat edin. 10 µL hücre süspansiyonunu, abdominal pro bacaklardan birinin arkasından 45 derecenin altında bir açıyla böceğe enjekte edin. Bağırsakları delmemeye dikkat ederek, içeriği sadece epidermal tabakanın hemen altına enjekte edin.Her bir böceğe ilk bakteri suşu enjekte edildikten sonra, 10⁻² ile 10⁻⁶ arasındaki dilüsyonları bu kez plağın ortasına ekleyin. Dilüsyonların plağın altına doğru yayılmasına izin verin. Ardından plakları uygun sıcaklıkta inkübe edin ve inokulumu saymak için kolonileri sayın.Her bir bakteri suşu için seyreltme, ekim ve enjeksiyon işlemi tekrarlandıktan sonra, negatif kontrol grubu için üç ila beş böceğe steril PBS enjekte edin. Ardından, tüm böcekleri 26 °C'de, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyodunda inkübe edin. Son olarak, enjeksiyonların ardından böceklerin zaman içindeki sağkalımını izleyin; böcekler enfeksiyon sırasında ölümden önce genellikle iştah kaybı, sulu, sarı ishal, dışkılama ve/veya su kaybı belirtileri gösterir.Böcek ölümü, uyarılma üzerine gönüllü hareketlerin yokluğu şeklinde tanımlanır. Bu analizde, böceklere orta log fazına kadar büyütülmüş vahşi tip veya atenüe mutant bir Xer Haus NLA suşundan yaklaşık 50 koloni oluşturan birim enjekte edilmiştir. Böcekler yaklaşık 72 saat boyunca gözlemlenmiş ve her zaman noktasında enjekte edilen böceklerin hala hayatta olan yüzdesi kaydedilmiştir.Bu deneyde, atenüye edilmiş suş böcekleri öldürmede belirgin bir gecikme sergilerken; vahşi tip suş, mutant enfekte larvaların herhangi biri ölmeden önce, enjeksiyondan sonraki 30 saat içinde altı larvanın tamamını öldürmüştür. Veriler, bu prosedürün ardından istatistiksel olarak belirgin farklar göstermektedir. Bakterinin böcek bağışıklık yanıtını manipüle edip edemediğini belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak için RNA ekstraksiyonu ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Büyük bal mumu güvesi larvalarının Ağız ve intra haemocolic...

Böcek<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bakteriyel Patogenez İnceleyecek Güçlü Enfeksiyon Model olarak

Kaynak: Bernut, A. ve ark., Zebrafish embriyolarında Mycobacterium abscessus'un Patogenezi ve Kordonlanmasının Çözülmesi ve Görüntülemesi. J. Vis. Deneyim (2015).Bu video, enfekte bir zebrafish embriyosundan Mycobacterium abscessus'u izole etmek ve nicelik ölçmek için bir protokolü göstermektedir. Bu işlem, embriyo ötenazisi, doku lizizasyonu ve homojenizasyonu ile bakterilerin serbest bırakılmasını, ardından santrifüj ve yüzeyaktif bir tamponda yeniden süspansiyonu içerir. Son olarak,...

Zebrafish embriyolarından bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilişi enfeksiyon yükünü değerlendirmek için

Bu videoda, büyük balmumu güvesi Galleria mellonella'nın larvalarında bir Mycobacterium bovis enfeksiyon modeli oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Mycobacterium bovis BCG'nin bir biyolüminesan suşu, enfeksiyon oluşturmak için larvaların hemolenfine enjekte edilir ve enfeksiyonun ilerlemesini incelemek için biyolüminesans önceden tanımlanmış aralıklarla ölçülür.

Böcek Larvalarında Bakteriyel Enfeksiyon Modeli Oluşturma Tekniği

Bu video, Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux ile enfekte böcek larvaları kullanılarak yapılan in vivo bakteri yükü ölçümünü göstermektedir. İşlem, larva homojenizasyonunu, bir lusiferaz substratı ile muameleyi ve bakteri yükü ile ilişkili nispi ışık birimlerini belirlemek için biyolüminesans ölçümünü içerir.

Bir Böcek Larvasında Lusiferaz İfade Eden Bakterilerin İn Vivo Yükünün Ölçümü

Burada, biz Galleria mellonella larva kullanarak bir sözlü yönetim modeli için detaylı bir protokol sağlar ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı nasıl karakterize indüklenen. Bu iletişim kuralını kullanan, pratik deneyimi olmayan araştırmacılar G. mellonella yöntemi kuvvet kullanmak mümkün olacak.

Bir Galleria mellonella Oral yönetim modeli için Study Commensal-Induced doğuştan gelen bağışıklık yanıtı

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Bu makalede, izole ve sivrisinek midgut kültlenebilir mikropların belirlenmesi, sivrisinek bağırsak bakterilerin antibiyotik tükenmesi de dahil olmak üzere bireysel sivrisinek bağırsak bakterilerin etkisini araştırmak için bir protokol sunuyor ve belirli bir bakteri türleri yeniden tanıtmak.

Antibiyotik Tedavi Sivrisinekler ile Bakteriyel Oral Beslenme Tsay

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Drosophila melanogaster yetişkin sinekleri, konakçı antimikrobiyal doğuştan gelen immün yanıtların ve mikrobiyal enfeksiyon stratejilerinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. D. melanogaster larva aşamasını ek veya alternatif bir model sistem olarak tanıtmak için, bir larva enjeksiyon tekniği tanımlanmıştır.

Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü

Öğrenin Manduca sexta larvalarında bakteri enjeksiyonu ile patojenite değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, bakteri virülansını ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon

Daha fazla video keşfet