Mürin Norovirüs için Plak Testi

Bu prosedürün genel amacı, enfeksiyöz nöron norovirüs partiküllerini nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle virüs inokülümünün on katlı seyreltilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, virüs inokülümü seyreltilerinin ham 2 6 4 0.7 monokatmanına transfer edilmesi ve plakların oda sıcaklığında bir saat boyunca sallanarak inkübe edilmesidir.

Ardından, inokülumu aspire edin ve bir bir oranında C plak agar ve iki bir XMEM ile üzerini kaplayıp plakları bir doku kültürü inkübatöründe 48 saat boyunca inkübe edin. Son adım, nötral kırmızı boyama çözeltisi ile üzerini kaplamak ve plakları bir doku kültürü inkübatöründe bir ila üç saat boyunca inkübe etmektir. Son olarak, agar kaplama kaldırılmadan nötral kırmızı boyama çözeltisi dikkatlice aspire edilir ve plaklar bir ışık kutusu kullanılarak sayılır.

Enfeksiyöz viral partiküllerin miktarının belirlenmesine yönelik bu yöntem, dışkıda atılan enfeksiyöz partikül miktarı veya hangi dokuların enfeksiyonu desteklediği gibi norovirüs alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, analiz boyunca sağlıklı ve canlı hücreleri korumakta zorlanırlar. Ayna nörovirüsü için plak analizi, önceden deneyimi olmayan kişiler için kavranması zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Bu analizinin başarıyla tamamlanması, plakların kolayca gözlemlenebilmesi için uygun hücre miktarı, doğru sıcaklık ve hassas uygulama gerektiren bir dizi birikimli adımdan oluşur. İlk olarak, hücrelerin morfolojisini kontrol etmek için hücre monokatmanını bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Hücrelerin çoğunluğu yuvarlak görünmelidir.

Hücrelerin aşırı büyümesine izin vermeyin, çünkü genellikle plak oluşturmayacaklardır. Murn neurovirus plak testi için yaklaşık konfluen hale gelmiş 175 santimetrekarelik bir doku kültürü flakonundaki raw 2 6 4 0.7 hücreleri için flakondaki medyumu aspire edin ve hücrelere 10 mililitre taze DMEM 10 ekleyin. Ardından, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile flakonun dibinden kazıyın ve hücre süspansiyonunu aspire edip tekrar flakonun dibine püskürtmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre kümelerini parçalamak için bu işlemi en az üç kez tekrarlayın.

Stok flaskına uygun hale getirmek için. Bir ila iki mililitre hücre süspansiyonu alın ve bunu 33 ila 34 mililitre DMEM 10 içeren yeni bir 175 santimetrekare flaskına aktarın. Flaskı bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C ve %5 karbondioksit altında iki ila üç gün inkübe edin ve tekrar pasajlayın.

Analiz plakalarını ekmek için kompleman hazır olduğunda, hücre süspansiyonunun yoğunluğunu DMEM 10 içerisinde mililitre başına 1x10⁶ canlı hücre olacak şekilde ayarlayın ve bu süspansiyondan 2 mL'yi 3,5 cm çapındaki altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna ekleyin; plağın kapağını kapatın. Ardından, hücrelerin kuyucuklara eşit şekilde dağılması için plağı hemen elinizle 10 kez sallayın.

Hücrelerin kuyucuğun merkezinde kümelenmesine neden olacağı için plakayı sallamayın. Ardından, hücrelerin yapışması için plağı en az dört saat veya ideal olarak gece boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin; virüs inokülumu, MNV enfekte homojenize dokulardan veya MNV enfekte farelerin dışkı örneklerinden elde edilebilir. Doku örnekleri kullanılıyorsa, bezelye büyüklüğünde bir doku parçası steril silika boncuklar ve 1 mL DMEM 10 içeren iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe yerleştirin ve burada homojenize edin.

Bir magnetize edici 6,000 RPM hızında bir dakika boyunca kullanılır. Dışkı örnekleri kullanılıyorsa, en fazla üç dışkı peleti aynı şekilde homojenize edin, homojenize edilmiş örnekleri -80 °C'de dondurun ve inokulumu plak assay gününde çözdürün. Bir 24 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 1.35 ml DMEM five dağıtmak için tekrarlayıcı pipet kullanın, ardından plakanın birinci kuyucuğuna 0.15 ml üçüncü virüs inokulumu pipetleyin.

İlk 10⁻¹ seyreltisinden 0,15 mililitre aspire ederek plakanın ikinci kuyusuna aktarıp 10⁻² seyreltisini hazırlayarak on katlı seri seyreltme işlemini gerçekleştirin. Ardından, 10⁻³ seyreltisi için aynı işlemi ikinci kuyudaki seyrelti ile tekrarlayın. Numuneye bağlı olarak 10⁻⁹'a kadar daha fazla seyreltme yapılması gerekebileceğini unutmayın.

Seri dilüsyonlar hazırlandıktan sonra, %60 ila %80 konfluens düzeyindeki plakaları örnek isimleri ve kullanılan dilüsyon oranları ile etiketleyin. Ardından, plakalardan birindeki tüm medyumu aspire ederek veya boşaltarak uzaklaştırın ve bir kuyucuğa 0,5 milliliters dilüye edilmiş örnek ekleyin. İşlemi paralel bir kuyucukla tekrarlayın ve ardından bir sonraki daha düşük dilüsyonla devam edin.

Üç dilüsyonun tamamı bir plakaya çift örneklik olacak şekilde eklendikten sonra, tüm hücrelerin kaplandığından emin olmak için plakayı ileri geri eğiniz. İşlemi bir sonraki hücre plağı ile tekrarlayınız. Tüm plakalar işleme tabi tutulduğunda, plakaları oda sıcaklığında, dakikada yaklaşık 18 salınım şeklinde ayarlanmış bir sallayıcı düzeneğe bir saat süreyle yerleştiriniz; önceden hazırlanmış ve/veya otoklavlanmış agar şişesini eriyene kadar mikrodalga fırında ısıtınız.

Ardından, sıcaklık dengelenmesi için eritilmiş agarı 42 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, eritilmiş agarı steril bir şişede steril iki XMEM besiyeri ile bir bire bir oranda karıştırın. Bu kaplama çözeltisini içeren şişeyi, kullanılmaya hazır olana kadar 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin.

Bir saatlik inkübasyonun sonunda, her kuyucuktaki inokülümü aspire edin ve pipet ucunun her kuyucuğun duvarına dayalı olduğundan emin olarak, her kuyucuğa iki mililitre overlay çözeltisi yavaşça ekleyin. Hücrelerin yerinden oynamasını önlemek için plakların üzerini kapatın ve overlay tabakasının oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. Ardından plakları 48 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne aktarın.

İnkübasyon süresinin ardından, plaklarda plak oluşumu olup olmadığını kontrol edin. Eğer görünür plaks yoksa, plakları inkübatöre geri yerleştirin ve dört saat sonra tekrar kontrol edin. Gerekirse prosedürü tekrarlayın, ancak inkübasyon süresi 72 saati aşmamalıdır.

İlk olarak, nötral kırmızı boyama çözeltisini hazırlayın. Ardından, bu protokol için her bir kuyuya iki mililitre nötral kırmızı çözeltisi ekleyin; aros tıkanın çıkarılmasına gerek yoktur. Plakaları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresi dolduktan sonra, kuyucuklardaki nötr kırmızı çözeltiyi muhafaza ederek plaklarda plakların oluşup oluşmadığını kontrol edin. Eğer herhangi bir boyanma görülmüyorsa, plakları maksimum üç saate kadar bir saat daha inkübe edin. Plaklar görünür hale geldiğinde, agar tıpasına zarar vermemeye dikkat ederek nötr kırmızı çözeltiyi aspire edin ve ardından plakları sayma işlemine geçin.

Plakaları inceleyin ve plakların net bir şekilde ayrıldığı dilüsyonu bulun. Plakayı bir ışıklı tablo üzerine yerleştirin ve sayılan plakların üzerine bir nokta koyarak plakları sayın. Bu işlem, mükerrer sayımları önlemek içindir.

Ardından, virüsün farklı bir dilüsyonuna sahip olan bir kuyucukta sayımı tekrarlayın ve mililitredeki plak oluşturan birim cinsinden viral titreyi hesaplayın. Yazılı protokoldeki talimatlara göre, bu temsili görüntü enfeksiyon öncesindeki bir monoton tabakayı göstermektedir. Ham 2 6 4 0.7 hücreleri gece boyunca kültüre edilmiş ve ışık mikroskobunda 20 kat büyütme ile görüntülenmiştir.

Bu görüntü, plaklar oluştuktan sonraki aynı tek katmanlı hücre tabakasını göstermektedir. Hücreler, enfeksiyondan 48 saat sonra %0,01'lik nötral kırmızı çözeltisi ile boyanmış ve dört kat büyütmeli bir ışık mikroskobu altında görüntülenmiştir. Roma rakamlarıyla belirtilen bir, iki ve üç, görünen üç plağı göstermektedir.

Bu görüntü, plaka sayım yöntemi protokolünün sonunda, Roma rakamlarıyla etiketlenmiş üç farklı on katlı dilüsyonun çift kuyucuklarını içeren bir plakayı göstermektedir. Bir ve dört numaralı kuyucuklar 10⁻¹ dilüsyonuna, iki ve beş numaralı kuyucuklar 10⁻² dilüsyonuna ve üç ile altı numaralı kuyucuklar 10⁻³ dilüsyonuna karşılık gelmektedir.

Numunenin viral titresi aşağıda belirtilmiştir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için dilüsyonlar arasında pipet uçlarını değiştirmeyi, solüsyonları doğru sıcaklığa getirmeyi ve hücre monokatmanlarının kurumasını önlemeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, plak analizinin nasıl yapılacağı ve mi neurovirus enfeksiyöz partiküllerinin nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Mira Norovirüs ile bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve önlük giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini ve atıkların yerel biyogüvenlik komiteniz tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak uygun şekilde imha edilmesi gerektiğini unutmayın.