Name: Mürin Norovirüs için Plak Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin, mürin makrofajları kullanarak enfeksiyöz mürin norovirus partiküllerini plak testi ile nicelendirmeyi. Bu yöntem, viral bulaş ve enfeksiyon dinamikleri araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz eleştirel görüş ve önerileriniz için Wobus laboratuar üyelerine teşekkür. CEW ve laboratuvarda çalışma Michigan Üniversitesi, Biyo-Savunma Mükemmeliyet NIH / NIAID Bölgesel Merkezi ve Gelişmekte Olan Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma (RCE) Programı, Bölge V &#39;Büyük bir kariyer geliştirme hibe start-up fonları tarafından finanse edildi Göller RCE (NIH ödülü 1-U54-AI-057153) ve NIH R01 AI080611. MBG-H. Michigan Üniversitesi Deneysel İmmünoloji (NIH T32 A1007413-16) ve Mikrobiyal Patogenezinde Moleküler Mekanizmalar (NIH T32 A1007528) eğitim hibeleri tarafından finanse edildi. JBC Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel Superior (Pelerin), Brasilia, Brezilya tarafından finanse edildi.

1. 264.7 RAW Makrofaj Hücre Hattı ekimi <ol><li> % 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml) ile yüksek glikoz DMEM oluşur DMEM-10 ortamı içinde RAW 264.7 hücreleri (ATCC, katalog # TIB-71), 10 mM HEPES bakımı , 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. Hücreler tipik olarak şişesi başına ortam 35 ml içeren 175 cm2 doku kültürü şişeleri içinde muhafaza edilmekte ve 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde CO2. Ancak, herhangi bir boyut şişenin şişenin boyutu için uygun bir ortam hacmi ile de kullanılabilir. </li><li> Hücreleri ayırmak için: eski medya kapalı aspire hücrelere taze DMEM-10 ortamı 10 ml eklenir, sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin alt hücreler kazıma. Sonra, bir 10 ml pipet içine hücreleri çizerek homojen bir çözelti içine hücreleri tekrar süspansiyon ve zorla pipet pr hücreleri sıkmaşişenin dibine Essed. En az 3 kez hücreler artık yığın birlikte böylece bu işlemi tekrarlayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde edildiği ışık mikroskobu ile kontrol edin. Yeni bir 175 cm 2 şişesine hücre süspansiyonu 2 ml (1:5 seyreltme veya ~ 2x10 7 hücreleri), ve medya son hacim kadar getirmek - Sonra 1 ml (1:10 seyreltme veya ~ 1x10 7 hücreleri) aktarmak 35 ml. </li><li> Bölünmüş hücreleri (~ 1x10 8 hücreleri total/175 cm 2 matara) neredeyse konfluent zaman: 1:5 seyreltme ile başlayan eğer 1:10 seyreltme, ya da her iki gün ile başlayan üç günde eğer. Yarma hücreleri önce hücre morfolojisi kontrol etmek için ışık mikroskobu kullanın. Hücrelerin çoğu yuvarlak bakmak ve aktif olmamalıdır. Aktif hücreler cılız morfolojisi ekleri ile, granül ve / veya genişletilmiş var. Bu hücreleri genellikle plak yok gibi hücrelerin sarmak izin vermeyin. Geçit sayısı takip edin ve sık sık hücrelerin bir alt geçit kısım eritilmesi ile başlamak. (Biz bir cut-off olarak geçit 30 kullanın). </li></ol> 2. MNV İnokulum RAW 264.7 Hücreleri Infect <ol><li> Tohum RAW 264.7 1x10 6 canlı hücre / DMEM-10 ortamı içinde ml &#39;lik bir yoğunlukta 6 oyuklu plakalar (3.5 cm çapında) içine hücreleri, ve her bir kuyu için bu süspansiyon 2 ml ekleyin. Bu el en az 10 kat plakaları sallama ile ya da yaklaşık 10 dakika için bir sallanan tertibatım kullanarak ya da eşit bir şekilde kuyu hücrelere yaymak için önemlidir. Girdap plakaları bu kuyunun merkezinde küme hücreleri neden olur gibi yapmayın. Sıra plakalar bir doku kültürü kuluçka makinesi içine (37 ° C ve% 5 CO2). Hücreler 37 ° C de bir gece boyunca ya da en azından 4 saat için takmak için izin Hücreler 60 olmalı -% 80 plak tahlil için birleşik ve iyi boyunca eşit olarak dağıtılır. </li><li> Ertesi gün, doku kültüründe MNV-enfekte hücreleri veya MNV-enfekte farelerde Homojenize dokularda veya dışkı örneklerinden olabilir virüs inokulum hazırlamak. doku örnekleri kullanılarak, bezelye büyüklüğünde pidoku eces bir doku homojenleştirici (; Roche örneğin MagnaLyser) kullanılarak DMEM-10, 1 ml steril silis boncukları ihtiva eden 2 ml vidalı kapak tüp içinde homojenize edilir. Dışkı numuneleri için, en fazla 3 fare pislikleri 1 ml ortam içinde homojen hale getirilmelidir. Tüm numuneler sonra dondurulan (-80 ° C&#39;de) ve plak tahlil yapmadan önce bir kez çözdürülmelidir edilir. </li><li> DMEM / yüksek glukozlu,% 5 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 oluşan tam bir DMEM-5 ortam içinde virüs inokulum 10 kat dilüe U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. </li><li> On-kat seri seyreltiler, 24 oyuklu plakalar olarak hazırlanmıştır: Bir yükseltici pipet çoklu kuyu içine 1.35 ml ortam dağıtmak için kullanılır, 10 -1 seyreltme ortamı 1.35 ml, virüs ihtiva eden numune 0.15 mL karıştırılması ile yapılmıştır ve daha sonra 10 -1 seyreltme 0.15 mi 10 -2 dilutio etmek için ortam 1.35 ml ilave edilirn ve böyle devam eder. Bu ipuçları yeni bir seyreltme yapmak her zaman değiştirmek için önemlidir. Bir çok kanallı bir pipet kuyu başına 0,15 ml &#39;lik bir toplam hacim (Şekil 3A bakın) transfer eden bir 24-kuyulu plakanın iyi birine uygun iki uç ile aynı anda birden fazla numune seyreltmeler yapmak için kullanılabilir. </li><li> Doku homojenatlarında ve fekal içerik için tipik bir seyreltme aralığı 10 -1 10 -3 olduğunu. Bununla birlikte, bu örneklerden doku kültür plakları örnekleri ile karşılaştırıldığında daha küçük olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı durumlarda, dışkı örnekleri, 1:100 dilüsyon böylece plaklar saymak için engellemektedir, yeterli derecede tek tabakalı hücre bozabilir dışkı herhangi bir zehirli bileşenleri sulandırmak için gereklidir. Doku kültürü lizatları seyreltme aralığı virüs ömrü çevrimi esnasında ilgi zaman noktasına bağlıdır. 10 -9 kadar gitmek Dilüsyonlar enfeksiyon zirvesinde gerekli olabilir. </li><li> Seri dilüsyonları hazırlandıktan sonra, 6-well plakasındas örnek adını ve kaplama olmak dilüsyonları ile RAW 264.7 mono tabakaları (bölüm 2.1) içeren. Bir seferde bir tabak, dışarı Flicking veya aspire tüm ortamı çıkarın. Hemen ardından bir seyreltilmiş örnek 0,5 ml ekleyin, iyi, sonra bir sonraki seyreltme geçmeden önce, yinelenen bir de tekrarlayın. Tüm 3 dilüsyonları tüm hücreleriyle kaplanmış oylandı sağlamak için elle ileri geri bir plaka, eğim plaka eklenir sonra. Hücrelerin kurumasına olmayacak emin olmak için bir kerede bir tabak tutun. </li><li> Her bir kuyucuğa seyreltmeler ve 0,5 ml eklendikten sonra, dikey plakaları üst üste ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya onları. Hacim, her bir oyuğa ilave tamamen tek tabakalı karşılamak için yeterli olmadığı için, plakalar nazikçe yandan her 10-15 dakikada tarafından ileri geri hareket ettirildiğinde veya bir sallama cihazı (dakika başına ~ 18 salınım) üzerine yerleştirilmesi gerekir. Bu kurumasını hücrelerini engeller. </li></ol> 3. Düşük Erime Noktası Agaroz (SeaPlaque) Overlay Hazırlık <ol><li> 1 saat inkübasyon işlemi tamamlanmadan önce levha toplam hacim için gereken kaplama miktarını hesaplar. Gerekli hacim / de veya 12 ml/6-well plakası 2 ml. Agaroz (bkz. bölüm 3.2) ve ayrıca medya (bkz. bölüm 3.3) hazırlayın. </li><li> Agaroz hazırlamak için, bir cam şişe içinde, damıtılmış su (% 3 w / v) ve 100 ml &#39;lik bir toplam hacim içinde SeaPlaque agaroz 3 g askıya. 20-30 dakika süreyle otoklav. (Agaroz zaten mikrodalga yeniden erime agaroz-elden önce hazırlanan varsa.) Bu agaroz çok sıcak ise ° C Kullanmadan önce bir su banyosunda, bu hücreleri öldürecek çünkü 42 SeaPlaque agaroz dengelenmesi önemlidir. Su seviyesi istenmeyen katılaşma önlemek için agaroz düzeyine eşit veya üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Ortam hazırlamak için: oluşur 2x MEM medya, 100 ml olun2x MEM,% 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 4 mM L-glutamin. ° C su banyosunda 37 medya dengelenmesi. </li><li> Enfekte hücre mono tabakaları üzerine yayılmış hemen önce, bir 1:1 oranında SeaPlaque agaroz ve bir steril şişe içinde bir araya 2x MEM ortam hem de karıştırılır. Fazla 200 ml paylaşımı gerekiyorsa, bölünmüş çok sayıda şişe içine hacmi ve 37 tutmak ° C su banyosunda kullanıma hazır oluncaya kadar. </li><li> 1 saat inkübasyon (bölüm 2.7 &#39;e bakınız) sonunda her kuyunun inokulum kapalı aspire. Yavaş yavaş her çukurun duvarına pipet koyarak her bir kuyunun kenarına bindirme 2 ml ekleyin. En fazla 5 plakalarına hücrelerin kurumasına fırsat vermeden aynı anda işlenebilir. </li><li> Bindirme doku kültürü inkübatör içine dik plakaları koymadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika katılaşmasını bekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca levhalar inkübe edin. </li><li> Sonrakuluçka dönemi, plaklar çıplak gözle belli belirsiz görünür, bu yüzden plak varlığı için boyanmamış plakaları kontrol edin. Plak yok görünmüyorsa, ek 4 saat boyunca inkübe ve tekrar kontrol edin. Bununla birlikte, en fazla 72 saat inkübasyon süresi geçmemelidir. </li></ol> 4. Neutral Red Boyama tarafından Plaketlerinin Görselleştirme <ol><li> , - 1 x PBS, 97 ml (doku kültürü derecesi, Mg 2 + etmek; plaklar görselleştirmek için, nötr kırmızı boyama çözeltisi nötr kırmızı, 3 ml (Sigma, katalog # N2889 DPBS içinde% 0.33 w / v) ilave edilmesi ile hazırlanır Ca 2 + - ücretsiz; Gibco, katalog # 10010). 12 ml nötr kırmızı boyama çözeltisi her bir 6-plaka için gereklidir: deney için gerekli olan nötür kırmızı boyama çözeltisinin hacmi hesaplayın. Ardından, her bir kuyucuğa 2 ml ekleyin. Bazı plak tahlil protokolleri agaroz fişi kuyulardan çıkarılması gerektirmesine rağmen, bu protokolde nötral kırmızı boyama çözüm bindirme doğrudan eklenir. </li><li> Bir saat sonra birplaklar hala kuyularda nötral kırmızı boyama çözeltisi ile görünür durumdaysa 37 ° C&#39;de cubation, kontrol edin. Plaklar kolaylıkla görünür değil iseniz, boyama başka bir saat boyunca devam etmesine izin verin. Plaklar görebilir kadar kuluçka devam edin. (Not:. Fazla 3 saat boyunca Boyama optimal değildir ve hiçbir plaklar boyanma 3 saat sonra pozitif kontrol örneği görünür ise, plak tahlil düzgün çalışmadı) boyama tamamlandıktan sonra, nötral kırmızı boyama çözüm aspire , agaroz fiş sağlanması rahatsız ve sonra plaklar sayma devam edilmez. </li><li> Bir ışık kutusu üzerinde baş aşağı plakası yerleştirerek ve yinelenen sayar önlemek için sayılır plaklar üzerinde bir nokta işaretleyerek plaklar sayın. (Birlikte plaklar füzyon hiçbir görsel kanıtlar yani) plaklar açıkça ayrılır kuyularda plaklar saymak için seyreltme seçin. Eğer mümkünse, iki dilüsyonlarda plaklar sayılır. O plak boyutu MNV suşları, virüs inokulum arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir, ve bağlıdırplak tahlil sırasında RAW 264.7 hücreleri koşulu. </li><li> Plak yok, iyi görünür, her iki numune içinde mevcut herhangi bir virüs ya da virüs miktarı plak tahlil saptama sınırının altında olduğunu olsaydı. Bu durumda, diğer plaka kuyuları içeren kuyu olarak benzer bir kırmızı renk ile leke. Belirli bir seyrelti içinde mevcut çok sayıda viral partiküller olduğunda Alternatif olarak, plak yokluğunda da görülmektedir. Bu tüm monolayer parçalanma yol açar ve kuyular rengi sarı / turuncu görünür. </li><li> Viral titreleri hesaplayın. Tek bir dilüsyon kuyularda hem plakların sayısını ekleyin ve seyreltme faktörü (yani 1 ml 2 kuyu 0,5 ml ile enfekte olup olmadığını) ile çarpın. Bu 1 ml sizin inokülum hacminin plak oluşturan birim miktarı (PFU) verecektir. Örneğin, 10 -2 seyreltme de Şekil 4 &#39;, iyi bir (&quot;II&quot; işaretli) 14 plaklar vardır ve diğer iyi (&quot;V&quot; işaretli) 17 plaklar vardır. Böylece, viral titresi 14 olacakx10 17x10 2 + 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bulaşıcı MNV-1 parçacıklar Şekil 1 &#39;de şematik olarak belirtildiği gibi bir plak deneyi kullanılarak ölçülebilir. Şekil 2A hemen önce enfeksiyon, RAW 264.7 hücreleri, bir tek tabaka ile iyi göstermektedir, Şekil 2B, I, II, roman numaraları ile gösterilen üç görünür plaklar gösterirken Bir kuyu içinde ve III. Testin bireysel adımları Şekil tasvir edilmektedir F. Şekil 3A ile 3A, bir virüs içeren bir örnek, 10-kat inceltilmiş serileri hazırlanması gösterilmektedir. Şekil 3B, bir 6-kuyulu plakanın kuyularının çoğaltmak için dilüsyonları transferi gösterir. Şekil 3C 1 saat için oda sıcaklığında inokulum ile RAW 264.7 hücreleri inkübe etmek için kullanılan cihaz sallanan gösteren Şekil 3B hücreleri SeaPlaque ile kaplanmış olan gösterir:. MEMŞekil 3F hücreler daha sonra bir% 0.01 nötral kırmızı solüsyon 48 saat ile boyanmış olan gösterirken, bir karışım. Şekil 3E, kaplama katılaşmasını sağlamak için oda sıcaklığında bir plaka göstermektedir. 1-3 saat boyunca boyanan hücrelerin ve nötral kırmızı boyama çözüm aspire sonra, plaklar görebilir ve (Şekil 4) sayılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Şekil 1. MNV plak tahlil protokolü şematik. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Şekil 2. Enfeksiyon öncesi ve plak oluşumundan sonra bir tek tabakalı bir iyi Temsilcisi görüntüler. A) RAW 264.7 hücreleri 20x büyütmede ışık mikroskobu altında geceleme ve görüntülü kültüre edildi. B) Hücreler 48 saat sonra 0,01% nötral kırmızı çözeltisi ile boyandıenfeksiyon r ve 4x büyütmede ışık mikroskobu altında görüntülendi. Romen rakamları I, II ve III üç görünür plaklar göstermektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Şekil 3. Farklı plak tahlil adımlar Temsilcisi görüntüler. A) MNV-1 inokulum 10-kat dilüsyonu hazırlanır. B) Aşı, yinelenen bir kuyu içinde hücre mono tabakaları eklenir. C) hücreleri ile inokulum, oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan ile inkübe edilir. D) hücreler SeaPlaque agaroz ve 2x MEM ortam bir 1:1 karışımı ile üst üste. E) Levhalar kaplama katılaştırmak için izin vermek üzere oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı. Nötral kırmızı boyama çözüm 48 saat sonrası enfeksiyon hücrelerin F) Boyama. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Hücre monol Şekil 4. MNV-1 formları plaklarayers. Burada gösterilenler inkübasyon 1 saat sonra nötral kırmızı boyama çözüm lekeli plaklar gösteren, 48 saat sonrası enfeksiyon temsili bir plak tahlil plakadır. Plakası üç 10 kat dilüsyonlarının yinelenen kuyuları gösterir. I ve IV 10-1 seyreltme karşılık roman numaraları ile etiketlenmiş Wells, II ve V 10-2 seyreltme karşılıktır; III ve VI 10-3 seyreltme karşılık gelir. Numunenin viral titresi (hesaplama ayrıntıları için bakınız Bölüm 4.5) aşağıda belirtilmiştir.

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
<li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196(2009).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan MNV-1 için plak metodu bulaşıcı MNV parçacıkların miktarının bir yoludur. Şekil 3&#39;de gösterilen tahlil adımı takip ederek, tekrar üretilebilir bir viral titreler elde edebilir. Testin tespit limiti kullanılan başlangıç ​​seyreltme bağlıdır. Yukarıda açıklandığı gibi örnek bir 1:10 seyreltme ile başlarken, plak testin saptama sınırının 10 pfu (yani, 10 -1 seyreltme görülebilir 1 plak) &#39;dir. Her bir plak tek bir virüs temsil ettiği için, plak deneyi, izole plaklar çekme ve bunları daha önce tarif 1 yayarak MNV klonal popülasyonları saflaştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, plak saflandırma da karışık virüs popülasyonlarının tek başına bir virüs popülasyonunun ayırmak için de kullanılabilir. MNV enfeksiyonun tespiti için bir plak tahlil kullanarak bir sınırlaması tüm MNV suşların plaklar 4 oluştururlar olmasıdır. Bununla birlikte, inabili üstesinden gelmek mümkündürseri doku kültürü 7 bu virüsler pasajlanmasını tarafından plak oluşturan hayvanlardan izole edilen bazı suşları MNV, ve ty. Plak tahlil alternatif TCID 50 tekniği 3, 4 ile bulaşıcı partikülleri ölçmektir. Bu tahlil, uç nokta seyreltmeleri ile MNV 4-tamamlanması 1 hafta sürer aşağıdaki aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarı miktarını belirler. Bir plak deneyi daha yavaş olmasına ek olarak, TCID 50 tahlil ayrıca şu şekilde duyarlı değildir (tespit limiti = 200 TCID 50 / ml), RAW 264.7 hücreleri, 4 doku örneklerinin toksisite nedeniyle. Protokolü içerisindeki kritik adımlar protokol boyunca tarif edilmiş olmasına rağmen, aşağıdaki bölümde sorun giderme kolaylaştırmak için bir özet sunar. Protokolde en kritik adım RAW 264.7 hücreleri virüs çoğaltması desteklemek için test boyunca canlı kalmasını sağlamaktır. Bu canışık mikroskobu ile testin her aşamasında izlenecektir. Hücre canlılığı, iki yolla sağlanır. Birincisi, bakım plakaları tutarken hücrelerin kurumasına izin vermeyin alınmalıdır. Böylece, plakaları, bir defada bir aşılanmış enfeksiyon döneminde sarsan ve onlar ele edilmemesi zaman kalır kapalı olmalıdır edilmektedir. İkinci olarak, çözeltiler hücrelerin üzerine ilave ~ 37 ° C &#39;ye dengelenmiş olmalıdır Bundan başka, hücrelerin aktivasyonu sınırlayan düşük endotoksin serum (&lt;10 EU / ml) içeren ortam içinde bakımı için de RAW 264.7 hücreleri genel sağlığı için hayati önem taşır. Pasaj 30 ya da daha yüksek bir ikinci hücreleri kullanılarak Buna ek olarak, plak deneyi daha yüksek bir başarısızlık oranı gözlemledik. Bu büyük olasılıkla laboratuvardan laboratuvara değişir rağmen, yüksek geçit RAW 264.7 hücreleri kullanarak, özellikle tekrarlanabilir titreleri sağlamak için (örneğin, bilinen bir viral titreye sahip bir örnek) bir pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Yüksek geçit hücrelerin kullanımını sınırlamak için, erken passa şişeleri dondurmak tavsiye edilirRAW 264.7 hücrelerin alınması ve sıklıkla dondurulmuş flakonlarından yeni bir kültür başlamak üzerine ge hücreleri. Hücreleri değişmiş gibi, hücre morfolojisi değişiklikler uymak (örneğin yuvarlak çırpı ve yaymak) başarısızlık gibi özellikler, veya mikoplazma kirlenme tespit edildiğinde sergilemek zaman düşük geçişi hücre kültürleri üzerinde başlayarak da yararlı olacaktır. Dikkat etmek önemli bir nokta da pipet uçları örnekleri arasında ve dilüsyonları sırasında değiştirilen sağlamaktır. Bu doğru seri dilüsyonları sağlamak ve örnekler arasında çapraz bulaşmayı önlemek olacaktır. Aynı örnek seri dilüsyonları kuyucuklara ilave edilmesi ile aynı pipet ucu tekrar kullanılabilir protokol içinde bir adımdır. Bu durumda, bir çok seyreltilmiş inokulum den az başlar ve yeni bir seyreltme çizerken şiddetle aşağı yukarı pipetle etmelidir. Plak tahlil protokolü bazı modifikasyonlar iyileştirilebilir. T yapılabilir bir modifikasyonuburada iki kopya halinde kuyu inokülasyon için yeterli hücre olmayan her bir seyreltme için sadece tek bir iyi aşılamak için. Inokulum hacmi 0.5 ml olan Bununla beraber, plaklar sayı daha sonra pfu / ml &#39;ye normalleştirmek için 2 faktör ile çarpılır gerekmektedir. Plak tahlil da MNV replikasyon desteklemek mümkün olan herhangi bir diğer yapışık hücre hattı ile kullanım için adapte edilebilir, ve bu fare mikroglial BV-2 hücre dizisi 8 için tarif edilmiştir. Uygulanabilir diğer değişiklikler diğer virüsler için geliştirilen plak tahlil protokolleri için tarif edilmiştir uyarlamalar vardır. MNV halinde, aşağıdaki modifikasyonlar önceden başarılı bir şekilde uygulanmıştır; metil yerine Deniz Plak selüloz agaroz 9, ve kristal mor ya da yerine nötr kırmızı 10, 11 ve metilen mavisi ile boyanması hücrelerin kullanımı. Diğer plak oluşturan virüs ölçmek için gerekli ya da oth için kullanılır Genel olarak, bu protokol kolayca adapte edilebilirgenel olarak bulaşıcı viral parçacıkların ölçmek için yararlı bir araç yapma, RAW 264.7 hücrelerinde litik enfeksiyonlara neden er virüsler.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM / Yüksek glukoz </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x Penisilin ve streptomisin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM olmayan esansiyel amino asitler </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Deniz Plak Agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Nötr Kırmızı 0.33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirkonya / Silika boncuk </td><td> BioSpec Ürünler </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Model 35 Hız Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Enstrüman </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Ham 264.7 hücre hattı </td><td> ATCC </td><td> TİB-71 </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatör </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

mürin norovirüs için plak testi

Plaque Assay for Murine Norovirus

Mürin norovirusa (MNV) verimli doku kültürü 1, 2 yetişir Norovirüs cinsinin tek üyesidir. Hücre parçalama ve sitopatik etki (CPE) fare dendritik hücreler veya makrofajlar 1 MNV-1 enfeksiyonu sırasında görülür. MNV-1 Bu özellik, bir plak deneyi 1 gerçekleştirerek, belirli bir örnek içinde bulaşıcı maddelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Plak tahlil olmuş akyuvarlar ve plaklar 3 olarak adlandırılan bir birleşik hücre monolayer, delik oluşturmak için MNV-1 yatmaktadır. Birden çok doku kültürü teknikleri, hasat edilmiş doku, klinik, çevre örneklerde viral enfeksiyonların tespit etmek için kullanılır, fakat hepsi değil ölçü bulaşıcı parçacıklar (örn. qRT-PCR). Edilebilir Bulaşıcı virüs parçacıkları ölçmek için bir yolu, aşağıda daha detaylı olarak tarif edilecektir bir plak deneyi 3, gerçekleştirilmesidir. MNV plak tahlil bir varyasyonu flor olduğunuMNV antijen hücre mono tabakaları 4 immunohistokimyasal edilir escent odak tahlil. Viral antijen ekspresyonu plak oluşumu önündeki tarihi Bu testte, daha hızlı olabilir. Aynı zamanda, plak oluşturan yapamaz virüs titrasyonu için yararlıdır. Ancak, floresan odak tahlil gibi antikorlar ve odak oluşturan birim saymak için bir mikroskop gibi plak testin ötesinde ek kaynaklar gerektirir. Bulaşıcı MNV ayrıca% 50 Doku Kültürü Enfektif Doz (TCID 50) 3 belirlenerek ölçülebilir. Bu tahlil, uç 5 ile titrasyon aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarını ölçer. Ancak, algılama sınırına bir plak tahlil 4 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir. Bu yazıda, etkili biyolojik ya da çevresel numuneler 1, 4, 6 mevcut bulaşıcı MNV parçacıkların sayısını belirlemek için kullanılabilecek bir plak tahlil protokol açıklar. Bu yöntem olup baizin veren hücreler (RAW 264.7 mürin makrofaj hücreleri) bir tek tabaka aşılamak için kullanılır MNV ihtiva eden numuneler, 10-kat seri seyreltiler hazırlanması sed. Virüs zaman belirli bir süre için hücre mono tabakasında bağlanmasına izin verilir ve daha sonra agaroz ve hücre kültür ortamı bir karışımı hücreleri kapsayan önce aspire edilir. Soğuk bir şekilde yer alan hücrelere yaymak sınırlandırarak agar komşu hücreler, viral soy yayılmasını sağlar. Sonuç olarak, enfekte olmuş hücreler lize ve mono tabakasında deliklerin şekil plaklar olarak bilinir. Virüsün yeterli yayılması üzerine, plaklar nötr kırmızı, metilen mavisi veya kristal viyole gibi boyalar ile hücrelerin görünür aşağıdaki boyama olur. Düşük dilüsyonları, her plak komşu hücrelere yayılmış tek bir bulaşıcı viral partikül ve döl, kaynaklanır. Böylece, plakların sayısını sayma biri seyreltilmemiş numune 3 mevcut plak oluşturan birim (PFU) hesaplamak için izin verir.

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Murine norovirüs (MNV), Norovirüs cinsinin doku kültüründe verimli bir şekilde çoğalabilen tek üyesidir 1, 2. Hücre lizisi ve sitopatik etki (CPE) ...

Bu prosedürün genel amacı, enfeksiyöz nöron norovirüs partiküllerini nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle virüs inokülümünün on katlı seyreltilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, virüs inokülümü seyreltilerinin ham 2 6 4 0.7 monokatmanına transfer edilmesi ve plakların oda sıcaklığında bir saat boyunca sallanarak inkübe edilmesidir.Ardından, inokülumu aspire edin ve bir bir oranında C plak agar ve iki bir XMEM ile üzerini kaplayıp plakları bir doku kültürü inkübatöründe 48 saat boyunca inkübe edin. Son adım, nötral kırmızı boyama çözeltisi ile üzerini kaplamak ve plakları bir doku kültürü inkübatöründe bir ila üç saat boyunca inkübe etmektir. Son olarak, agar kaplama kaldırılmadan nötral kırmızı boyama çözeltisi dikkatlice aspire edilir ve plaklar bir ışık kutusu kullanılarak sayılır.Enfeksiyöz viral partiküllerin miktarının belirlenmesine yönelik bu yöntem, dışkıda atılan enfeksiyöz partikül miktarı veya hangi dokuların enfeksiyonu desteklediği gibi norovirüs alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, analiz boyunca sağlıklı ve canlı hücreleri korumakta zorlanırlar. Ayna nörovirüsü için plak analizi, önceden deneyimi olmayan kişiler için kavranması zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Bu analizinin başarıyla tamamlanması, plakların kolayca gözlemlenebilmesi için uygun hücre miktarı, doğru sıcaklık ve hassas uygulama gerektiren bir dizi birikimli adımdan oluşur. İlk olarak, hücrelerin morfolojisini kontrol etmek için hücre monokatmanını bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Hücrelerin çoğunluğu yuvarlak görünmelidir.Hücrelerin aşırı büyümesine izin vermeyin, çünkü genellikle plak oluşturmayacaklardır. Murn neurovirus plak testi için yaklaşık konfluen hale gelmiş 175 santimetrekarelik bir doku kültürü flakonundaki raw 2 6 4 0.7 hücreleri için flakondaki medyumu aspire edin ve hücrelere 10 mililitre taze DMEM 10 ekleyin. Ardından, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile flakonun dibinden kazıyın ve hücre süspansiyonunu aspire edip tekrar flakonun dibine püskürtmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre kümelerini parçalamak için bu işlemi en az üç kez tekrarlayın.Stok flaskına uygun hale getirmek için. Bir ila iki mililitre hücre süspansiyonu alın ve bunu 33 ila 34 mililitre DMEM 10 içeren yeni bir 175 santimetrekare flaskına aktarın. Flaskı bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C ve %5 karbondioksit altında iki ila üç gün inkübe edin ve tekrar pasajlayın.Analiz plakalarını ekmek için kompleman hazır olduğunda, hücre süspansiyonunun yoğunluğunu DMEM 10 içerisinde mililitre başına 1x10⁶ canlı hücre olacak şekilde ayarlayın ve bu süspansiyondan 2 mL'yi 3,5 cm çapındaki altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna ekleyin; plağın kapağını kapatın. Ardından, hücrelerin kuyucuklara eşit şekilde dağılması için plağı hemen elinizle 10 kez sallayın.Hücrelerin kuyucuğun merkezinde kümelenmesine neden olacağı için plakayı sallamayın. Ardından, hücrelerin yapışması için plağı en az dört saat veya ideal olarak gece boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin; virüs inokülumu, MNV enfekte homojenize dokulardan veya MNV enfekte farelerin dışkı örneklerinden elde edilebilir. Doku örnekleri kullanılıyorsa, bezelye büyüklüğünde bir doku parçası steril silika boncuklar ve 1 mL DMEM 10 içeren iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe yerleştirin ve burada homojenize edin.Bir magnetize edici 6,000 RPM hızında bir dakika boyunca kullanılır. Dışkı örnekleri kullanılıyorsa, en fazla üç dışkı peleti aynı şekilde homojenize edin, homojenize edilmiş örnekleri -80 °C'de dondurun ve inokulumu plak assay gününde çözdürün. Bir 24 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 1.35 ml DMEM five dağıtmak için tekrarlayıcı pipet kullanın, ardından plakanın birinci kuyucuğuna 0.15 ml üçüncü virüs inokulumu pipetleyin.İlk 10⁻¹ seyreltisinden 0,15 mililitre aspire ederek plakanın ikinci kuyusuna aktarıp 10⁻² seyreltisini hazırlayarak on katlı seri seyreltme işlemini gerçekleştirin. Ardından, 10⁻³ seyreltisi için aynı işlemi ikinci kuyudaki seyrelti ile tekrarlayın. Numuneye bağlı olarak 10⁻⁹'a kadar daha fazla seyreltme yapılması gerekebileceğini unutmayın.Seri dilüsyonlar hazırlandıktan sonra, %60 ila %80 konfluens düzeyindeki plakaları örnek isimleri ve kullanılan dilüsyon oranları ile etiketleyin. Ardından, plakalardan birindeki tüm medyumu aspire ederek veya boşaltarak uzaklaştırın ve bir kuyucuğa 0,5 milliliters dilüye edilmiş örnek ekleyin. İşlemi paralel bir kuyucukla tekrarlayın ve ardından bir sonraki daha düşük dilüsyonla devam edin.Üç dilüsyonun tamamı bir plakaya çift örneklik olacak şekilde eklendikten sonra, tüm hücrelerin kaplandığından emin olmak için plakayı ileri geri eğiniz. İşlemi bir sonraki hücre plağı ile tekrarlayınız. Tüm plakalar işleme tabi tutulduğunda, plakaları oda sıcaklığında, dakikada yaklaşık 18 salınım şeklinde ayarlanmış bir sallayıcı düzeneğe bir saat süreyle yerleştiriniz; önceden hazırlanmış ve/veya otoklavlanmış agar şişesini eriyene kadar mikrodalga fırında ısıtınız.Ardından, sıcaklık dengelenmesi için eritilmiş agarı 42 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, eritilmiş agarı steril bir şişede steril iki XMEM besiyeri ile bir bire bir oranda karıştırın. Bu kaplama çözeltisini içeren şişeyi, kullanılmaya hazır olana kadar 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin.Bir saatlik inkübasyonun sonunda, her kuyucuktaki inokülümü aspire edin ve pipet ucunun her kuyucuğun duvarına dayalı olduğundan emin olarak, her kuyucuğa iki mililitre overlay çözeltisi yavaşça ekleyin. Hücrelerin yerinden oynamasını önlemek için plakların üzerini kapatın ve overlay tabakasının oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. Ardından plakları 48 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne aktarın.İnkübasyon süresinin ardından, plaklarda plak oluşumu olup olmadığını kontrol edin. Eğer görünür plaks yoksa, plakları inkübatöre geri yerleştirin ve dört saat sonra tekrar kontrol edin. Gerekirse prosedürü tekrarlayın, ancak inkübasyon süresi 72 saati aşmamalıdır.İlk olarak, nötral kırmızı boyama çözeltisini hazırlayın. Ardından, bu protokol için her bir kuyuya iki mililitre nötral kırmızı çözeltisi ekleyin; aros tıkanın çıkarılmasına gerek yoktur. Plakaları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon süresi dolduktan sonra, kuyucuklardaki nötr kırmızı çözeltiyi muhafaza ederek plaklarda plakların oluşup oluşmadığını kontrol edin. Eğer herhangi bir boyanma görülmüyorsa, plakları maksimum üç saate kadar bir saat daha inkübe edin. Plaklar görünür hale geldiğinde, agar tıpasına zarar vermemeye dikkat ederek nötr kırmızı çözeltiyi aspire edin ve ardından plakları sayma işlemine geçin.Plakaları inceleyin ve plakların net bir şekilde ayrıldığı dilüsyonu bulun. Plakayı bir ışıklı tablo üzerine yerleştirin ve sayılan plakların üzerine bir nokta koyarak plakları sayın. Bu işlem, mükerrer sayımları önlemek içindir.Ardından, virüsün farklı bir dilüsyonuna sahip olan bir kuyucukta sayımı tekrarlayın ve mililitredeki plak oluşturan birim cinsinden viral titreyi hesaplayın. Yazılı protokoldeki talimatlara göre, bu temsili görüntü enfeksiyon öncesindeki bir monoton tabakayı göstermektedir. Ham 2 6 4 0.7 hücreleri gece boyunca kültüre edilmiş ve ışık mikroskobunda 20 kat büyütme ile görüntülenmiştir.Bu görüntü, plaklar oluştuktan sonraki aynı tek katmanlı hücre tabakasını göstermektedir. Hücreler, enfeksiyondan 48 saat sonra %0,01'lik nötral kırmızı çözeltisi ile boyanmış ve dört kat büyütmeli bir ışık mikroskobu altında görüntülenmiştir. Roma rakamlarıyla belirtilen bir, iki ve üç, görünen üç plağı göstermektedir.Bu görüntü, plaka sayım yöntemi protokolünün sonunda, Roma rakamlarıyla etiketlenmiş üç farklı on katlı dilüsyonun çift kuyucuklarını içeren bir plakayı göstermektedir. Bir ve dört numaralı kuyucuklar 10⁻¹ dilüsyonuna, iki ve beş numaralı kuyucuklar 10⁻² dilüsyonuna ve üç ile altı numaralı kuyucuklar 10⁻³ dilüsyonuna karşılık gelmektedir.Numunenin viral titresi aşağıda belirtilmiştir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için dilüsyonlar arasında pipet uçlarını değiştirmeyi, solüsyonları doğru sıcaklığa getirmeyi ve hücre monokatmanlarının kurumasını önlemeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, plak analizinin nasıl yapılacağı ve mi neurovirus enfeksiyöz partiküllerinin nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Mira Norovirüs ile bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve önlük giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini ve atıkların yerel biyogüvenlik komiteniz tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak uygun şekilde imha edilmesi gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

Bu video, insan bağırsak bakterilerine bağlanan insan norovirüs virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) miktarını belirlemek için bir testi göstermektedir. Bakteriyel süspansiyonlar VLP'lerle karıştırılır ve VLP-bakteri komplekslerinin oluşumuna izin vermek için inkübe edilir. Kompleksler daha sonra florofor etiketli VLP'ye özgü antikorlarla etiketlenir, ardından VLP'ye bağlı bakterilerin yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi tabanlı görselleştirme ve miktar tayini yapılır.

İnsan Norovirüs VLP'lerinin Bağırsak Bakterilerine Bağlanmasını Ölçmek İçin Bir Test

Plak tahlilleri, viral titreleri belirlemek için konakçı hücresel tek tabakalar üzerinde tuzak kaplamaları kullanan viral miktar tayini için altın standarttır. Geleneksel olarak çeşitli yarı katı kaplamalar kullanılmış olsa da, burada yarı katı kaplamaları çeşitli virüs aileleri arasında yeni bir sıvı mikrokristalin selülozla karşılaştıran plak tekniklerini gösteriyoruz.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Çevresel sert yüzeylerde norovirüsün tespiti ve miktarının belirlenmesi için makro köpük tabanlı bir örnekleme metodolojisi geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Burada belirli büyüme oranı ve diğer Rotavirüs plak tahlil ve RT-qPCR kullanarak hücre bağlama yeteneği ölçmek için iki protokol mevcut. Bu protokoller fenotipleri farklılıkları Rotavirüs suşları arasında teyit için kullanılabilir.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Öğrenin, mürin makrofajları kullanarak enfeksiyöz mürin norovirus partiküllerini plak testi ile nicelendirmeyi. Bu yöntem, viral bulaş ve enfeksiyon dinamikleri araştırmalarına katkı sağlar.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Daha fazla video keşfet