Name: Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Öğrenin, Danio rerio embriyolarında mitokondriyal fonksiyonu incelemek için metabolik profil analizi yöntemini. Bu teknik, genetik ve farmakolojik müdahalelerin etkilerini bütün organizma düzeyinde değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mükemmel sürekli hayvancılık bakım sağlamak için Deakin Üniversitesi Zebrafish Tesisi personeli teşekkür etmek istiyorum. YG Alfred Deakin Doktora Sonrası Araştırma Bursu ve Deakin Üniversitesi&#39;nde Merkez Araştırma Grant tarafından desteklenmektedir. SLM bir NHMRC Kariyer Geliştirme Bursu tarafından desteklenmektedir. ACW bir NHMRC etkinleştirilmesi Grant tarafından desteklenmektedir. Tüm yazarlar Deakin Üniversitesi&#39;nde Moleküler ve Tıbbi Araştırma Stratejik Araştırma Merkezi tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: Zebra balığı Embriyolar Kimyasal Arıtma <ol><li> Döllenmeden sonra zebrafish embriyolar toplayın. 28.5 inkübe 100 ° E3 orta C x 15 mm Petri kapları Not:. Için in situ hibridizasyon ya da yağ-kırmızı O boyama içinde, 0.2 mM nihai bir konsantrasyonda 1-fenil-2-tioüre (PTU) ilave edilir pigment oluşumu, 1 ama Seahorse analiz için gerekli değildir inhibe ederler. </li><li> . Farmakolojik çalışmalar için uygun bir araç sadece kontrol Not 26 civarında saat sonrası fertilizasyon (HPF) de zebrafish embriyo geliştirmek için uygun bir final konsantrasyonda gerekli kimyasal ekleyin: ışığa duyarlı farmakolojik inhibitörleri için, embriyo geliştirmek için izin verilebilir analiz karanlık öncesinde. </li></ol> Bölüm 2: Denizatı XF 24 Analizörü Kullanma Canlı Metabolik Profili <ol><li> Her çalışma öncesinde, Denizatı XF 24 Analizcisi kartuşu O 2 ve H evler olduğunu <skadar&gt; + floroforlar analizci tarafından yapılan otomatik bir işlem aracılığıyla kalibre edilir. </li><li> 24-kuyu XF 24 adacık plaka hazırlanması. Aşağıdaki deney sırası kullanılmaktadır: <ol><li> Oksijen tüketimi sıcaklık dalgalanmalarına karşı duyarlı olduğu için, dört kuyu plakası üzerinde olası sıcaklık değişimleri kontrol etmek için kullanılır. Bu kuyular embriyolar içermez, ancak E3 orta 700 ul (Şekil 2A) ile doldurulur. </li><li> Kalan 20 kuyu (bölüm 2.2 &#39;ye bakınız) E3 orta ve tek embriyo her (Şekil 2B) 700 ul ile doldurulur. </li><li> Her deney için, 10 embriyolar araç-sadece (kontrol) ve 10 kimyasal inhibitörü (tedavi) ile tedavi ile tedavi edilir. Kontrol ve tedavi embriyolar (:;: işlenmiş embriyo: sıra A4: Kontrol embriyo; sıra A5 tedavi embriyo, vb de A3 kontrolü embriyo sıra A2 gibi) alternated vardır. </li><li> Bir adacık yakalama ekranın üstüne eklenir. numune tahlil boyunca ölçüm bölmesine (Şekil 2B) kalmasını sağlamak için her bir kuyunun Not: kimyasal işlem görmüş embriyolar önceden Denizatı analizörü çalıştıran kimyasal yıkamak gerek kalmadan, tüm prosedür boyunca orijinal kimyasal solüsyonu ile devam programı. </li><li> Bittiği zaman, plaka Denizatı Analizörü yüklenir ve tahlil başlatılır. </li></ol></li><li> Numunelerin analizi. İki farklı testler rutin olarak yapılmaktadır. <ol><li> Bazal solunum / Maksimum solunum programı (süresi yak. ​​90 dk). Maksimal solunum patolojik ve fizyolojik hem de devletlerin bir dizi ile ilişkili bu parametrede toplam enerji üretim kapasitesi ve değişikliklerin bir ölçü ise bazal solunum değişiklikler, metabolik disfonksiyon destekleyecektir. Yedek solunum kapasitesi, ya da daha fazla ATP üretimi artırmak için sistem için kapasite, aynı zamanda hesaplanırmaksimal solunum gelen bazal çıkarma bu testi. Üç Her karışım tekrarlar (2 dak) / bekleme (1 dak) / ölçüm (2 dk) döngüsünün ilk bazal solunum kurmak için yapılır. Üçüncü çevrimi sonunda, FCCP 2.5 uM (mitokondrial protonophore / uncoupler) bir son konsantrasyon iyi maksimum solunum ölçümüne izin veren her eklenir. Ölçüm işlemi, daha sonra 5-8 kez (Şekil 3) tekrarlanır. </li><li> ATP ciro / Proton sızıntısı programı (süresi yak. ​​60 dk). Proton sızıntısı ya da bağlanmamış solunum bağlı solunum, ayrılmaz bazal solunum ve reaktif oksijen türlerinin oluşumunu içeren mitokondriyal işlev diğer parametreleri ile bağlantılı iken ATP devir bağlı solunum, ATP üretimi şeklinde mitokondri temel fonksiyonu temsil etmektedir. Nedeniyle ATP devir için solunum 25 uM oligomycin ve buna ek olarak (A inhibitörü aşağıdaki solunum arasındaki fark ile temsil edilirTP sentaz) bazal solunum ile karşılaştırıldığında. Bağlanmamış solunum ya da proton sızıntı nedeniyle solunum, 25 uM rotenon (bir kompleks I inhibitörü) ve buna ek olarak aşağıdaki oligomycin-aracılı, solunum ve solunum arasındaki farkı hesaplayarak belirlenir. Ölçüm döngüleri her mitokondriyal inhibitörü eklenmesinden sonra 8 kez tekrarlanır. </li></ol></li></ol> Ishal sonunda, 10 ve 10 kontrol kimyasal işlem görmüş embriyoların ortalama değerleri hesaplanır. Bölüm 3: Petrol-Kırmızı-O Boyama <ol><li> 50 hpf az Embriyolar 4 ° C gecede% 4 PFA ince forseps kullanarak dechorionated ve sabitlenmiştir </li><li> Daha önce (bkz. Şekil 4) 2 açıklandığı gibi Petrol-Kırmızı-O boyama, gerçekleştirilir. </li></ol>

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li>
<li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652(2011).</li>
<li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li>
<li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes%3A+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li>
<li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Endocrinol.+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li>
<li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li>
<li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Zebrafish embriyolar gen işlevi de kolayca bloke veya aktive edilebilir ise Zebra balığı, ileri (TRK mutagenez) ve ters (Tilling, çinko parmak nükleaz hedefli knock-out, morfolino demonte) genetik yaklaşımlar 3,4 hem de köklü bir genetik modeldir kodlanmış ürünler için özel seçici farmakolojik bileşiklerin kullanılması. Dış gelişimi ve küçük boyutları nedeniyle, zebrafish embriyolar metabolik analizi için özel olarak uygundur. Bununla birlikte, metabolik profil ve zebrafish embriyolar in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun sağlam ölçüm sadece bir ön tanımlama ile, elde 5 rapor edilmemiştir. Denizatı analizi aslında hücre tabanlı metabolik çalışmalar için dizayn edilmiştir ve doğru ve güvenilir sonuçlar 6 vermesi ispat edilmiştir. Zebrafish embriyolar bu yeni metodolojinin uygulama önemli ve metabolik çalışmalar için bu model daha geniş kullanımını artırmak için muhtemeldir. Bu çalışmada, bazal solunum, maksimal solunum, yedek solunum kapasitesi, ATP ciro ve proton kaçak dahil Denizatı Analizörü kullanılarak zebrafish embriyolar solunum parametreleri bir dizi ölçüm göstermektedir. Ayrıca, bu tür ölçümleri bu durumda lipid birikimi, ve bu test sisteminde kullanılan farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı diğer fizyolojik parametreler ile korele edilebilir bir örnek sağlamaktadır. Genetiği değiştirilmiş embriyoların kullanımı ile birlikte bu metabolizma üzerine etkileyen faktörleri anlamak için güçlü bir deneysel bir platform sağlar. Mitokondriyal işlev bozukluğu, diyabet mellitus, 7, 8 şişmanlık, multipl skleroz 9, Parkinson hastalıkları 10, Alzheimer hastalığı ve 11 kanserler 12 bir tür olarak pek çok insan hastalığı, karıştığı birlikte bu yeni yöntem için çeşitli uygulamalar vardır. Önemlisi, oböylece vivo solunum ve metabolik profilde önemli fizyolojik görünüm sağlayan, aktif - gibi sitokinler, kalkınma ile ilgili büyüme vb - ur tüm çalışmaları çevresel etkiler in vivo koşullarda gerçekleştirilir. Kimyasal ekranlarında ayrıca rutin vahşi tip ve etkisi solunum, mitokondri fonksiyonu veya metabolizma kolayca Denizatı analyzer kullanarak teşhis edilebileceğini mutant arka zebrafish embriyolar (Şekil 1), yeni ilaç yapılır gibi. Seahorse analizör kullanılarak oluşturulan sonuçlar ek bilgi sağlamak için başka deneyler ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu tür tür cebpα, Pparα gibi belirli adiposit belirteçleri için in situ hibridizasyon gibi Petrol-Kırmızı Boyama gibi fizyolojik analizi, veya moleküler analizi, PPARy, FAS vb içerebilir Bu yöntem için bazı sınırlamalar vardır kalır. Biz ve diğerleri ölçüm için oligomycin kullanmak mümkün olmasına rağmengenç embriyoların 60 hpf oligomycin tedavisi daha yaşlı embriyolar 5 (bkz. Şekil 3), üzerine ure ATP üretimi ve proton kaçak verimsiz. Biz yaşlı embriyolar oligomycin gibi kolayca yorumlamak sonuçları imkansız hale genç embriyoların daha yaygın olamaz inanıyoruz. Oligomycin sonuçlar ATP ciro ve bağlantısız solunum nedeniyle solunumun belirlenmesi için zorunlu olduğundan, şu anda eski embriyolar oligomycin yüksek konsantrasyonlarda araştırıyoruz. Bununla birlikte, bu gibi tedaviler antimycin bir bazal solunum, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi, büyük zebrafish embriyolar yapılabilir, en fazla 68 HPF (gösterilmemiştir) gibi diğer ölçümleri ile, daha uzun etkili olmaya devam etmektedir. Geçerli Denizatı Analizörü kurulumu kullanarak diğer sınırlılığı da zebrafish embriyolar ve genç larvalar için uygundur böyle de her adacık yakalama plaka içinde fiziksel alandır. Bu nedenle, metabolizma icrayetişkin balık diyete bağlı aşırı şişmanlık üzerinde ic çalışmalar, örneğin, henüz teknik olarak mümkün değildir. Ancak, bu çalışmada böylece olası analizleri kapsamında uzanan, özellikle çocuk ve yetişkin balık için tasarlanan plaka gelişimini teşvik edebilir.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> XF 24 ekstraselüler akı analizörü </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 100737-101 </td><td> 24 sıra biçiminde </td></tr><tr><td> Islet Yakalama mikroplak </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 101122-100 </td><td> 24 sıra biçiminde </td></tr><tr><td> XF kalibrant Çözüm </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF deney ortamı </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Petrol-Kırmızı-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tioüre (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (embriyonik orta) </td><td> Öz yapılan </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank"># wptohtml16 http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html</a> </td></tr><tr><td> 100X15 mm Petri kapları </td><td> Şahin </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycin </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyolar metabolik profil analizi

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolizma alanında büyüyen bir gol mitokondriyal fonksiyon farklı yönleri üzerine genetiğin etkisini belirlemektir. Bu ilişkileri anlamak, diyabet ve obezite gibi mitokondriyal disfonksiyon ile bağlantılı hastalıkların bir dizi için altta yatan neden anlamanıza yardımcı olacaktır. Enstrümantasyon son gelişmeler, hücre hatları veya doku eksplantlar mitokondriyal fonksiyon farklı parametrelerin izlenmesi sağladı. Burada Denizatı biyobilim XF 24 ekstraselüler akı analizörü kullanılarak zebrafish embriyonik gelişim sırasında in vivo mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin hızlı ve duyarlı bir analizi için bir yöntem mevcut. Bu protokol Islet Yakalama tek bir embriyo her bir kuyunun yer nerede, biyoenerjetik ölçümü sağlayan mikropleytin dahil kullanır: bazal solunum (i); ATP ciro nedeniyle (ii) bazal mitokondriyal solunum (iii) mitokondriyal solunum; (iv) mitokondriyal Kuplajsız solunum veya prOton sızıntı ve (iv) maksimum solunum. Bu yaklaşım, embriyonik zebrafish solunum parametreleri kullanarak yabani tip ve genetiği değiştirilmiş embriyolar (mutant gen aşırı ekspresyonu veya gen demonte) veya farmakolojik olarak manipüle olanlar arasında mukayese edilebilir. Bu protokol yayılması bu alakalı omurgalı hayvan modelinde in vivo metabolik bozuklukların genetik temeli analiz için yeni araçlar ile araştırmacılar sağlayacağı tahmin edilmektedir.

<html> Biz özellikle metabolizma, solunum hızı ve lipid metabolizması üzerine rolü belirli genleri anlamakla ilgilenen. Bu nedenle, bu gen tarafından kodlanan bir enzim, belirli bir farmakolojik inhibitör ile 26 hpf itibaren vahşi tip zebrafish embriyolar tedavi edildi. Yarım kalan% 4&#39;lük sabit iken 50 hpf, araç ve inhibitörü ile tedavi edilen embriyoların yarısı, mitokondriyal fonksiyon için Denizatı kullanılarak analiz edildi PFA 4 gecede ° C ve daha sonra Petrol-Kırmızı-O ile lipid birikimi için boyandı. Spesifik enzim inhibitörü ile tedavi özellikle telencephalon ve otik vezikül (Şekil 4B, C) ​​altında lipid birikimi bir artış ile ilişkili olduğu bazal solunum bir ~ 2 kat artış (Şekil 4A), açtı. pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Zebrafish embriyolar kimyasal arıtma şematik gösterimi. Yabani-tip, genetik manipüle veya farmakolojik tedavi zebrafish embriyo arka plan vardır. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Şekil 2. XF24 adacık plaka kurdu. (A) Dört kuyularının yalnızca sıcaklık kontrolü gibi embriyonik ortamı içeren (X ile işaretlenmiş) ve diğerleri / iyi bir embriyo içerir. (B) Close-up bir adacık yakalama ekranı (ok başı) kapsadığı araç (DMSO) ile tedavi edilen 50 hpf vahşi tip embriyo gösteren iyi bir (C6). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. Respiratvahşi tip 50 hpf zebrafish embriyolar için iyon parametreleri. (A) Her bir ölçüm için, 20 bireysel embriyoların ortalama sunulmuştur. Bazal solunum (ortalama: 299.7, SS: 75.7; SEM: 16.9), maksimal solunum (ortalama: 387,4; SD: 93.3; SEM: 20.9), Yedek Solunum Kapasitesi (ortalama: 87.7, SS: 72.0; SEM: 16.1). (B) her ölçüm için, 20 tek sonuçların ortalaması gösterilmiştir. Bazal mitokondrial solunum; mitokondriyal Kuplajsız solunum ve non-mitokondrial solunum; ATP ciro nedeniyle mitokondriyal solunum. Mt: mitokondrial; SRC: Yedek Solunum Kapasite; SD: Standart sapma, SEM: Ortalama Standart Hatası. Sonuçlar O 2 pmol sunulmuştur tüketilen / dak / embriyo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Reprebazal solunum ve lipid birikimi üzerine kimyasal maddelere maruz kalma temsilsici sonuçlar. lateral görünümde Petrol-Red O ile boyandı (A, B) 50 hpf embriyo. Selektif inhibitörü (B) ile inkübe embriyo bir araç-tedavi edilen kontrol embriyo ile karşılaştırıldığında telencephalon (ok başı) ve otik vezikül (ok) altında daha fazla yağ-Kırmızı-O boyama görüntüler. (C) Bazal solunum kimyasal tedavi embriyoların (grup başına n = 10 embriyo) bir ~ 2 kat artış gösterir. Sonuçlar O 2 / dak / embriyo pmol sunulmuştur.

Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde tarif<em&gt; In vivo</emBöylece bu organizmanın uygulanabilirliği artan genetik veya farmakolojik olarak manipüle embriyolar arasında farklı mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin karşılaştırılması sağlayan gelişmekte zebrafish&gt; metabolik profil,.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

Metabolizma alanında giderek artan bir hedef, genetiğin mitokondriyal fonksiyonun farklı yönleri üzerindeki etkisini belirlemektir. Bunları anlamak...

Aşağıdaki protokolün genel amacı, belirli genetik veya fizyolojik değişikliklere yanıt olarak zebra balığı embriyolarının metabolik profilini ölçmektir. Bu, öncelikle seçici bir farmakolojik bileşik kullanılarak belirli bir genetik veya fizyolojik yolun modüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, istenen gelişim aşamalarına ulaşıldığında, kontrol ve işlem görmüş embriyolarda bazal solunum seahorse XF 24 analizörü kullanılarak ölçülür.Ardından solunum parametreleri hesaplanır ve elde edilen veri sonuçları, metabolik profillerin gelişmekte olan zebra balıklarında in vivo olarak incelenebileceğini ve bu profillerin embriyonik gelişim sırasında belirli bir geni hedefleyerek modüle edilebileceğini ortaya koyar. Hücre tabanlı analiz veya solunumun dolaylı ölçümü gibi halihazırda mevcut tekniklere kıyasla cyte'ın temel avantajı, tüm organizmayla, yani bütün bir embriyo ile çalışıyor olmamızdır; bu da mitokondriyal solunumun tüm yönlerini incelememize olanak tanır. Bu teknik, tüm hayvan solunumunu ve mitokondriyal fonksiyonu ölçerek metabolizma ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Tedaviye başlamak için, in situ hibridizasyon veya Oil Red O boyaması için döllenme sonrası zebra balığı embriyolarını 0,2 mM 1-PHENYL-2-thiourea ile toplayın. Pigment oluşumunu önlemek için embriyoları yaklaşık 26 saat inkübe edin. İstenen kimyasalı, yalnızca taşıyıcı içeren bir kontrolle birlikte uygun son konsantrasyonda ekleyin; Seahorse XF24 analizörünü kullanmadan önce, 24 kuyucuklu XF24 islet plağını hazırlamak için oksijen ve hidrojen floresan sensörlerini içeren kalibrasyonu çalıştırın.Her bir kuyuya 700 µL E3 besiyeri ekleyerek başlayın. Ardından, örneğin ölçüm haznesinde kalmasını sağlamak için kuyulardan 20 tanesine birer embriyo ekleyin. Analiz boyunca, her kuyunun üst kısmına bir gözlet yakalama ekranı uygulayın.Kuyucukların 10 tanesi C ile belirtilen kontrol Embriyoları için ve 10 tanesi T ile belirtilen işlem görmüş embriyolar için kullanılır. Siyah kutular, plaka genelindeki sıcaklık dalgalanmalarını kontrol etmek için kullanılan embriyosuz kuyucukları göstermektedir. Şimdi plakayı seahorse analizörüne yerleştirin. Respirasyonu ölçmek için, bazal respirasyonu belirlemek amacıyla bazal respirasyon maksimum respirasyon programını kullanın.Bazal solunumu belirledikten sonra, her ölçüm arasında bir dakika bekleyerek, ikişer dakikalık üç ölçüm yapın; ardından 2,5 µM final konsantrasyonda mitokondriyal protonfor olan FCCP ekleyin. Ölçüm döngüsünü beş ila sekiz kez tekrarlayın. ATP turnover'ını ölçmek için, bir ATP sentaz inhibitörü olan 25 µM oligomisin içeren ATP turnover Proton leak programını kullanın ve ölçüm döngüsünü sekiz kez çalıştırın.Ardından, elde edilen solunum değerlerini kullanarak oligomisin aracılı solunum ile bazal solunum arasındaki farkı hesaplayın. Bu işlemi, kompleks I inhibitörü olan 25 µM rotenon ekleyerek tekrarlayın. Program tamamlandığında, oligomisin aracılı solunum ile rotenon eklemesi sonrası solunum arasındaki farkı hesaplayarak ayrık solunumu belirleyin.Seahorse analizörü, lipid birikimini analiz etmek amacıyla gerçekleştirilecek Oil Red O boyaması için 10 kontrol ve 10 kimyasal işlem görmüş embriyonun ortalama değerlerini hesaplar. İşlem görmüş ve işlem görmemiş embriyolar döllenme sonrası 50. saate ulaştığında, ince pensler kullanarak onları toplayın ve PBS içindeki %4 Paraformaldehit ile dört santigrat derecede gece boyunca sabitleyin.Embriyoları bir kez beş dakika boyunca PBT ile yıkayın, ardından bir saat boyunca %60 iki propanol içinde inkübe edin ve bunu iki saat boyunca %0,3 oil red O ve %60 iki propanol karışımında bekletin; embriyoları iki kez kısaca %60 iki propanol ile, ardından bir kez PBT ile durulayın; son olarak embriyoları, burada gösterildiği gibi fotoğraf çekimi için sırasıyla %30, %50 ve ardından %75 gliserole aktarın. Embriyoların spesifik bir enzim inhibitörü ile işlenmesi, solunumda yaklaşık iki katlık bir artışa yol açmış olup bu durum, özellikle sefalon bölgesinde ve otik vezikülün altında lipid birikimindeki artışla ilişkilendirilmiştir. Bu prosedür uygulanırken, aynı gelişim aşamasındaki embriyolarla çalışmak önemlidir.Bu durum, özellikle kontrol embriyosu ile gelişimi biraz gecikmiş olabilecek mutant veya farmakolojik olarak işlem görmüş bir embriyo arasındaki mitokondriyal respirasyonu karşılaştırırken geçerlidir. Dolayısıyla, bu tekniğin geliştirilmesi, metabolizma alanındaki araştırmacıların omurgalı bir model olarak zebra balıklarını kullanarak tüm hayvan respirasyonunu ve mitokondriyal fonksiyonu incelemelerine olanak sağlamıştır.

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Bu video, zebra balığı embriyolarındaki etanol konsantrasyonlarını belirlemek için üst boşluk gaz kromatografisinin kullanımını göstermektedir. Bu yöntem, uçucu organik bileşiklerin kalitatif ve kantitatif analizi için yararlı bir araç sağlar.

Headspace Gaz Kromatografisi: Zebra Balığı Embriyolarında Etanol Konsantrasyonunu Değerlendirme Tekniği

Burada canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi ölçmek için bir protokol bildiriyoruz. Bu prosedür, hem tüm embriyo dokularında hem de tek hücreli popülasyonlarda reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespitine izin verir. Bu protokol hem kalitatif hem de kantitatif analizleri gerçekleştirecektir.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Zebra balığı, enerji homeostazı çalışmaları için önemli bir model organizmadır.  NADH2'ye duyarlı bir redoks indikatörü olan alamar Blue'yu kullanarak, zebra balığı larvalarının metabolik hızını 96 oyuklu plaka formatında ölçen ve ilaç veya gen keşfine uygulanabilen bir test geliştirdik.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

Öğrenin, Danio rerio embriyolarında mitokondriyal fonksiyonu incelemek için metabolik profil analizi yöntemini. Bu teknik, genetik ve farmakolojik müdahalelerin etkilerini bütün organizma düzeyinde değerlendirmeyi sağlar.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

Daha fazla video keşfet