Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Bu videoda, Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'ndeki HIV Aşı Denemeleri Ağı tarafından geliştirilen ve merkezi bir laboratuvar tarafından analiz edilecek çok merkezli klinik çalışmalarda taze tam kanın boyanması için geliştirilen prosedür açıklanmaktadır. Prosedür, Becton Dickenson biosciences tarafından yapılan ve her biri bilinen sayıda floresan boncuk salmak için numune hazırlama sırasında çözünen liyofilize bir pelet içeren gerçek sayım tüplerini kullanır. Floresan antikorlar, farklı hücre popülasyonlarına özgü yüzey belirteçlerini boyamak için kullanılır.

Bu farklı popülasyonlardaki hücre sayısı, akış sitometrisi analizi sırasında floresan boncukların sayısı ile karşılaştırılabilir ve tam kandaki farklı lökosit popülasyonlarının mutlak konsantrasyonları, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde izlenebilir. Merhaba, benim adım Erica Anderson Nissan ve HIV Aşı Denemeleri Ağı'nda çalışan bir bilim insanıyım. Birazdan izleyeceğiniz prosedür, çok merkezli klinik deneylerimizde kullanılmak üzere geliştirdiğimiz bir prosedürdür.

Bu denemelerde, kan işleme laboratuvarı teknisyenleri taze delikli kan örnekleri alır, bunları floresan etiketli antikorlarla boyar ve daha sonra örnekleri akış üzerinde analiz edebilen merkezi bir laboratuvara gönderir. Sitometre taze delik kanı, maliyet ve fizibilite sorunları nedeniyle genellikle klinik araştırma ortamları bağlamında analiz edilmez, ancak periferik kandaki ana lökosit popülasyonlarını tanımlayabilen tek bir antikor boyama paneli geliştirdik ve bu popülasyonlar için boyama 45 dakikadan az sürer ve bu da HVTN'deki klinik çalışmalarda kullanım için uygun hale getirir, Bu paneli, aday HIV aşıları ile aşılamadan sonra meydana gelen erken olayları anlamak için kullanıyoruz, ancak bu PI paneli, bireysel araştırmacının ilgilendiği hücre tiplerine odaklanmak için daha da değiştirilebilir. İzlediğiniz için çok teşekkür ederiz ve bunun gelecekte sizin için faydalı olacağını umuyoruz.

Tablo Bir, periferik kandaki ana lökosit popülasyonlarını fenotiplemek ve numaralandırmak için geliştirilmiş 11 renkli bir antikor boyama panelini göstermektedir. Antikor kokteyli, merkezi tahlil laboratuvarı tarafından yapılır ve bölgeler arasında tutarlılığı sağlamak ve kokteyllerin deneme örneklerini lekelemek için kullanılmadan önce bir kontrol kanı alımında test edilmesine izin vermek için işleme laboratuvarlarına gönderilir. Her floresan konjuge antikor ayrı ayrı titre edilir ve daha sonra antikorlar, uygun titreler kullanılarak% 2 ısıya sahip delcos PBS ve aktive edilmiş fetal sığır serumu içeren akış yıkama tamponu ile tek bir karışımda birleştirilir.

Antikor kokteyli, bir parti numarası ve son kullanma tarihi ile etiketlenir ve nakliye sırasında dört santigrat derece sıcaklığı koruyan bir paketleme sistemi kullanılarak merkezi tahlil laboratuvarından işleme laboratuvarlarına gönderilir. Bir kez alındıktan sonra, antikor boyama paneli karanlıkta dört santigrat derecede sekiz haftaya kadar saklanabilir. BD faks dilimleme solüsyonu, boyamadan sonra kırmızı kan hücrelerini bitlemek ve lökositleri korurken antikor lekelerini düzeltmek için kullanılır.

Çözelti, üreticiden 10 x konsantrasyonda alınır ve merkezi tahlil laboratuvarı tarafından deiyonize su ile bir ila 10 oranında seyreltilir. Seyreltilmiş çözelti daha sonra bir lot numarası ve son kullanma tarihi ile etiketlenir ve alındıktan sonra ortam sıcaklığında işleme laboratuvarlarına gönderilir. Faks bağlama çözeltisi, kan alınmadan önce 15 ila 30 santigrat derece arasındaki oda sıcaklığında saklanır Gerçek sayım boyama için.

İşleme laboratuvarı, tüm uygun reaktiflerin merkezi tahlil laboratuvarından elde edildiğinden emin olmalıdır. Bunlar arasında BD TRU sayım tüpleri, kombine antikor boyama paneli ve bir x faks lisanslama çözümü bulunur. HVTN, her numune için ilgili tüm bilgileri kaydetmek için bir laboratuvar veri yönetim sistemi kullanır.

Gerçek sayım tüpüne yerleştirilen bir etikete benzersiz bir tanımlayıcı kod basılmıştır. Numuneyi süreç boyunca takip etmek için, lekelenen numuneyi tanımlamak için bir kriyo şişesini etiketleyin. Bu genellikle bir hasta veya gönüllü tanımlayıcısı, Bir ziyaret tanımlayıcısı ve aseptik teknik kullanılarak etiketli kriyo şişesine gerekli miktarda kanı içeren kan alma tarihini içerecektir.

Boyama için kullanılan kan miktarı, kullanılan boyama paneline bağlıdır, ancak genellikle panel başına 50 veya 100 mikrolitredir. Kriyo şişesi daha sonra boyamadan önce oda sıcaklığında dört saate kadar bir kenara bırakılabilir. Kalan kan üzerinde bir kez daha hassas işlemler yapılır.

Tüpün dibinde sağlam bir boncuk peleti olduğunu doğrulayın ve tru sayım tüpünü etiketleyin. İlgili numune bilgileri ile tüm reaktiflerin lot numaralarını ve son kullanma tarihlerini kaydedin. Çalışma sayfaları, bir klinik araştırma boyunca bu bilgileri izlemek için kullanışlıdır.

Gerçek sayım tüpü boncuk sayım numarası ve lot numarası, gerçek sayım tüplerinin torbasının ön tarafında bulunabilir. Gerçek Count boyama işlemine başlamaya hazır olduğunuzda, biyolojik güvenlik kabininde tüm malzemelerin ve reaktiflerin kullanıma hazır olduğundan emin olun. Bunlar arasında tru sayım tüpü kombine antikor boyama paneli tüpü, bir x faks bağlama solüsyonu, 200 mikrolitre ve 1000 mikrolitre mikro pipetler ve pipet uçları, folyo ağartıcı, laboratuvar filmi ve boyamadan sonra bir zamanlayıcı bulunur.

Ayrıca lekeli bir numune kutusuna da ihtiyacınız olacak, ancak bunun kaputun içinde olması gerekmez. Kullanılacak kan ve antikor miktarı, panel tarafından hangi hücrelerin ayırt edildiğine ve uygun analiz için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak değişir. Her panel, boyama için en uygun kan miktarını belirlemek için kontrol numuneleri üzerinde test edilir ve kullanılan antikor miktarı, bu videoda gösterilen panel için kullanılan kan miktarına eşittir.

Pipetleme öncesi 100 mikrolitre kan ve 100 mikrolitre antikor kullanılacaktır. Tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirerek kanı karıştırın ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Kanın iyi karıştığından emin olmak için.

Ardından, tam kanı alikottan metal tutucunun hemen üzerindeki gerçek sayım tüpüne doğru bir şekilde pipetlemek için ters pipetleme kullanın. Tüpün yan tarafına kan bulaştırmaktan kaçının. Pipet ucunu her bir tru sayım tüpü arasına yerleştirin.

Şimdi pipetlemeden önce kanı antikor boyama paneli ile lekeleme zamanı. Boyama panelini birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Gerçek sayım tüpündeki kana 100 mikrolitre antikor karışımı ekleyin.

Değerli reaktifi boşa harcayacağı için bu adımda pipeti ters çevirmeyin. Tüpü kapatın ve karıştırmak için yaklaşık 15 saniye düşük hızda girdap yapın. Boncuk peletinin tamamen çözüldüğünden emin olun.

Tüpü folyo ile örtün ve kanı 15 dakika boyunca lekelemek için bir zamanlayıcı ayarlayın. İhtiyaç duyulan bir x faks dilimleme çözeltisinin miktarı, tahlilde kullanılan kan miktarının dokuz katıdır, bu nedenle bu örnekte, 900 mikrolitre bir x faks dilimleme çözeltisi kullanılmıştır. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, lekeyi düzeltmek ve kırmızı kan hücrelerini bitlemek için leke kanına 900 mikrolitre bir x faks dilimleme solüsyonu ekleyin.

Bu adımda ters pipetleme gerekli değildir. Tüpü kapatın ve karıştırmak için yaklaşık 15 saniye düşük hızda girdap yapın. Kapağı sıkıca aşağı iterek kilitleme konumuna getirin ve kapatın.

Laboratuvar filmi ile. Tüpleri karanlık bir kutuda saklayın veya eksi 65 ila eksi 95 santigrat derece arasında tamamen folyoya sarın, ta ki merkezi tahlil laboratuvarına gönderilene kadar. Bugüne kadar yapılan testler, Numunelerin bu sıcaklıkta dört haftaya kadar stabil olduğunu göstermiştir, leke numuneleri, Uluslararası Hava ve Ulaştırma Birliği veya I ATA'yı takiben kategori B biyolojik maddeler olarak gönderilmelidir.

HVTN numunelerindeki düzenlemeler, bu gereksinimleri karşılamak için özel olarak tasarlanmış güvenlik paketi mürekkebinden yalıtılmış bir nakliye sistemi kullanılarak işleme laboratuvarlarından merkezi tahlil laboratuvarına haftalık olarak gönderilir. Bu sistemi kullanırken, iç kahverengi kutuyu strafor sandığın içine yerleştirin ve kaymayı önlemek için girintiye sabitleyin. Göğsü tamamen kuru buzla doldurun ve kutunun soğuması için beş ila 10 dakika bekleyin.

Numuneleri nakliyeye hazırlamak için, her bir tüpü ve folyoyu tamamen sarın ve lekeli numune kutusuna yerleştirin. Emici malzemeyi, lekeli numune kutusuyla birlikte sızdırmaz bir poli torbaya yerleştirin. Torbadaki fazla havayı alın ve sıkıca kapatın.

Sızdırmaz poli çantayı bir Tyvek çantanın içine yerleştirin. Yine, tavandan önce torbadaki tüm havayı boşaltın. Numune paketini iç kahverengi kutunun içine yerleştirin ve kapağı strafor sandığın üzerine sıkıca yerleştirin.

Nakliye kutusunu güvenli bir şekilde bantlayın ve uygun kuru buz işaretleriyle biyolojik madde kategorisi B olarak gönderin. Çok merkezli klinik çalışmalarda I ATA PI six 50 talimatlarını izleyin. Numuneleri kısa süreli depolama, nakliye ve uzun süreli depolama aşamaları boyunca takip etmek önemlidir.

HVTN tarafından kullanılan veri yönetim sistemi, numunelerin depolanacağı ve analiz edileceği merkezi tahlil laboratuvarındaki numune veritabanına aktarılabilen bir sevkiyat manifestosunun oluşturulmasına olanak tanır. Bu, numunelerin ne zaman sevk edildiğine ve alındığına, terminal olarak nerede saklandıklarına ve ne zaman çıkarıldıklarına dair bir kayıt oluşturur. Analiz için, oda sıcaklığını karanlık bir kutuda çözmek için leke örneğini Dondurucudan çıkarın.

Akış sitometresinde toplamadan en fazla bir saat önce. Birden fazla numune hakkında veri toplanıyorsa, tüpler bir saatten fazla oda sıcaklığında oturmayacak şekilde kademeli çözdürme işlemi yapılırsa, her bir numune, BD LSR iki gibi uygun filtrelerle donatılmış dört lazerli bir sitometre kullanılarak alınmalıdır, cihaz tarafından gerekiyorsa veri toplama için standart sitometre kalibrasyonu ve floresan telafi yöntemleri. Bir eşik ayarlamak için, akışa yüklenmeden önce beş saniye boyunca mümkün olan en düşük camgöbeği kanal eşiğini girdap, numune tüpüdür.

Sitometre tru sayım boncukları birçok kanalda yüksek oranda floresan yayılır. Toplama sırasında boncukları, yüksek oranda çift pozitif olan popülasyonu bularak kapılayın. PE SCI beş ve bir PC için, boncukları hücrelerden en kolay ayırt eden iki rengin enstrümantasyona bağlı olarak değişebileceğini unutmayın.

Durdurma kapınız olarak tru sayım boncuk kapısını seçin ve en az 20.000 boncuk elde edilene kadar verileri kaydedin. FlowJo gibi uygun yazılımları kullanarak verileri analiz edin. Şimdi, temsili bir kontrol kan alımından elde edilen verileri kullanarak ana lökosit popülasyonlarının analizi için kullanılan geçit şemasını inceleyeceğiz.

NKT hücreleri veya nötrofiller gibi panel kullanılarak daha spesifik hücre alt kümeleri de ayırt edilebilir, ancak bunlar bu örnekte gösterilmeyecektir. İlk olarak, gerçek sayım boncuklarının etrafına bir inklüzyon kapısı ve dışlama kapısı çizilir ve boncukları saymak için almak ve boncukları hücresel analizden çıkarmak için biri üst üste yerleştirilir. Daha sonra, boncuklar hariç hücresel veriler, ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma yüksekliği kullanılarak yalnızca tek hücreleri içerecek şekilde kapılanır.

Bu kapı aynı zamanda küçük döküntüleri de içermez. CD 45 pozitif hücreler daha sonra geçitlenir ve granülositleri yan saçılma kullanılarak lenfositlerden ve monositlerden ayırır. Lenfositler ve monositler daha sonra CD 14 ve yan saçılma kullanılarak üç ayrı gruba ayrılır.

Bunlar arasında CD 14 negatif lenfositler, tüm CD 14 negatif hücreler ve CD 14 negatif lenfosit kapısı hücrelerinden non lenfositler önce üç gruba ayrılır, CD üç pozitif CD 19 negatif, CD üç negatif CD 19 pozitif ve CD üç negatif CD 19 negatif T hücresi CD'den üç pozitif CD 19 negatif yürüyüşe ayrılır. CD 56 pozitif ve CD 16 pozitif hücreler hariç tutulduktan sonra CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücresi ayırt edilebilir. B hücreleri, CD 56 pozitif ve CD 16 pozitif hücreler dışlandıktan sonra üç negatif CD 19 pozitif yürüyüşten ve NK hücreleri CD üç negatif CD 19 negatif yürüyüşten kapılıdır.

CD 11 C ve CD dört kullanılarak olası kontamine monositler dışlandıktan sonra, NK hücreleri CD 56 brite, CD 56 DM ve CD 56 negatif popülasyonlara ayrılır. Dendritik hücre popülasyonunu ayırt etmek için, tüm CD 14 negatif hücreler, CD üç pozitif, CD 19 pozitif, CD 56 pozitif ve CD 16 pozitif hücreleri dışlayacak şekilde kapılanır. Oradan, HL A DR pozitif hücreler kapılıdır ve miyeloid dendritik hücreler ve plazmositoid dendritik hücreler, CD 11 C ve CD 1 23 ekspresyonu ile ayırt edilebilir.

Son olarak, lenfosit olmayan yürüyüşten, olası kontamine CD 56 pozitif, CD üç pozitif ve CD 19 pozitif hücreler dışlandıktan sonra monosit alt kümeleri kapılanır. Klasik olmayan, orta ve klasik monositler, CD 16 ve CD 14 ifadelerine göre ayırt edilir. İlgilenilen popülasyonlar kapılı hale getirildikten sonra, konsantrasyonlar hesaplanabilir.

Boncuk kapısındaki olayların sayısını, orijinal olarak tüpte bulunan toplam boncuk sayısıyla karşılaştırmak, toplanan numunenin oranını belirlemenize olanak tanır ve bu daha sonra mutlak konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir. Her popülasyon için mikrolitre başına hücrelerimiz. Burada gösterilen denklem bu Amaç için kullanılabilir.

Bu videoda, kan işleme laboratuvarı teknisyenleri tarafından taze tam kan üzerinde boyama yapmak için kullanılan prosedürü ve bu leke örneklerini merkezi bir tahlil laboratuvarında analiz etme adımlarını gösterdik. Çok merkezli bir klinik çalışma bağlamında, tahlilin basit ve nispeten kısaltılmış bir süre olduğunu gösterdik, bu da kan işleme laboratuvarı teknisyenlerinin bunu gerçekleştirmesini ve numuneleri dondurup analiz için temel tahlil laboratuvarına kaydırmasını mümkün kıldı. Doğru ve tutarlı sonuçlar elde etmenin anahtarı, protokoldeki kritik adımları dikkatli bir şekilde standartlaştırmak ve keşfedilen herhangi bir anormalliğin havanın kaynağına kadar izlenebilmesi için tüm adımları takip eden bir dokümantasyon sistemi kullanmaktır.

Bu boyama panelinden üretilen veriler, zaman içinde lökosit konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve ilgilenilen belirli hücre tiplerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca daha da geliştirilebilir.