Akustik Damlacık buharlaşması ve Bubble-gelişmiş Ultrason aracılı Ablasyon için dar Boyut Dağılımları ile Faz-shift Nanoemulsions sentezi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, buharlaşma yoluyla akustik olarak oluşturulan lipid kaplı nano emülsiyon kabarcıklarının ultrason aracılı ablasyon üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu, öncelikle lipid kaplı nano emülsiyonların albümin yüklü poliakrilamid hidrojellerine dağıtılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, odaklanmış bir transdüser hidrojele kısa ve yüksek genlikli darbeler göndererek nano emülsiyonları odak noktasında yerel olarak buharlaştırır; ardından ortaya çıkan kabarcıklar ultrasonla sürekli olarak sürülür ve kabarcıklar tarafından yayılan akustik enerji hidrojel tarafından hızla absorbe edilerek ultrason aracılı ısıtma hızını artırır.

Sonuçlar, kabarcıkların varlığının, hidrojeli protein denatürasyonu için eşik sıcaklığın üzerine ısıtmak için gereken zaman ve enerjiyi önemli ölçüde azalttığını, bunun da daha hızlı ve daha etkili ultrason destekli ablasyonla sonuçlandığını göstermektedir. Faz kaymalı nano emülsiyonun boyutu, basınç eşiğinde kritik bir belirleyici faktördür. Akustik buharlaşma için, dar boyut dağılımlı ve iyi tanımlanmış buharlaşma eşiklerine sahip stabil faz kaymalı nano emülsiyonlar üretmek için bir protokolün yanı sıra, ultrason destekli medya ablasyonu üzerindeki etkiyi değerlendirmek için bir in vitro sistem geliştirdik.

In vitro bir sistem tanımlanmış olsa da, nano emülsiyonlar, akustik olarak buharlaşabilen partiküller aracılığıyla damar dışı dokuları ve solid tümörleri görüntülemek üzere tasarlanmıştır. Oluşan kabarcıklar daha sonra kanser yönetimindeki tanısal veya terapötik uygulamalar için kullanılabilir. Bir faz değişim nano emülsiyonu veya PSNE hazırlama prosedürüne başlamak için önce lipidleri birlikte karıştırın; 11 mg DPPC ve 1,7 mg DSPE çözün.

Kloroform içindeki Peg 2000, cam yuvarlak tabanlı bir erlene konur. Yuvarlak tabanlı erlen, kimyasal çeker ocak içindeki 50 °C'lik bir su banyosuna yerleştirilir ve organik solventi uçurmak için Argon gazı akışı kullanılır. Kuru bir lipid film oluşturmak için erlen bir desikatöre yerleştirilir ve lipid filmin kurutulması için gece boyunca vakum altında bırakılır.

Lipid filmini 5,5 mililitre PBS ile rehidre edin. Lipid film çözülene kadar çözeltiyi 45 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Lipid çözeltisini periyodik olarak yedi mililitrelik bir viyale aktarın ve ardından bir prob sonikatör ile %20 genlikte iki dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Çözeltiyi, her biri 2,5 mililitre olacak şekilde iki tüpe bölün. Geriye kalan 0,5 mililitre atılır. Her tüpe 2,5 mililitre PBS ekleyin ve ardından her iki tüpü sıfır derece Celsius'luk bir buzlu su banyosuna yerleştirin.

Her bir dosyaya 50 µL dodekafloropentan veya DDFP ekleyin. DDFP lipid karışımının son aşamasıdır. Buzlu su banyosunda tutmak, bu prosedürün en kritik kısmıdır.

Buzlu su banyosu, sıvı perflurokarbonun buharlaşmasını önlemek için kullanılır. Bu işlem sırasında, her bir tüpü buzlu su banyosu içerisinde %25 genlikli darbeli modda ve toplam 60 saniye boyunca sonike edin. Sonikasyondan sonra, PSNE çözeltisini 20 mililitrelik sintilasyon tüplerine, her tüpe 5 mililitre PBS gelecek şekilde aktararak tüp başına 10 mililitrelik bir nihai hacim elde edin.

Ekstrüderi hazırlamak için üretici talimatlarını izleyerek ekstrüderi monte edin. Üst numune portuna 10 millilitersy deiyonize su pipetleyin. Açıklığı kapatın ve tahliye valfini sıkın.

Basıncı artırmak için nitrojen gaz hattını yavaşça açarak numuneyi membranlardan geçmeye zorlayın. Numuneyi çıkış borusundan toplayın ve dar bir boyut dağılımı elde etmek için PSNE'yi 100 nanometre veya 200 nanometre bir filtreden 16 kez geçirin. Bu prosedüre PSNE içeren bir poliakrilamid hidrojeli hazırlayarak başlayın.

İlk olarak, 2,4 gram BSA tozunu 10 mililitre deiyonize su içerisinde çözerek %24'lük bovine serum albumin veya BSA çözeltisi hazırlayın. Ardından, bir gram PS tozunu 10 mililitre deiyonize su ile seyrelterek %10'luk ammonium per sulfate veya PS çözeltisi hazırlayın; bu reaktifleri plastik bir kalıba şu sırayla ekleyerek karıştırın: 2,1 mililitre akrilamid çözeltisi, 1,2 mililitre tris tamponu, 0,1 mililitre %10'luk PS, 4,5 mililitre %24'lük BSA çözeltisi ve 3,6 mililitre deiyonize su. Çözeltiyi bir su banyosunda 40 °C'ye ısıtın ve ardından sıvının gazını gidermek için bir saat boyunca vakum altına yerleştirin.

Bu işlem, bir saat sonra hidrojel içerisinde istenmeyen kabarcık oluşumunu önlemek için gereklidir. Vakumdan çıkarın, 480 µL PSNE süspansiyonu ekleyin ve plastik hazneyi nazikçe çalkalayarak iyice karıştırın. Kimyasal çeker ocakta, akrilamidi polimerize etmek için 12 µL tetraetilen diamin veya TEMED ekleyin ve hazneyi iki saat boyunca 12 °C'lik su banyosuna yerleştirin.

Polimerizasyon ekzotermiktir, bu nedenle polimerizasyon sırasında PSE buharlaşmasını önlemek için soğuk bir banyo gereklidir. Akrilamid polimerize olduktan sonra, görüntüleme düzlemi transdüser odak hacmiyle örtüşecek şekilde, DGAs deiyonize su ile doldurulmuş akrilik bir tank içinde odaklanmış bir güç transdüseri ve görüntüleme probu konumlandırın. Ardından, PSNE yüklü poliakrilamid hidrojeli güç transdüserinin odağına yerleştirin; hidrojel içindeki PSNE'yi kısa akustik darbelerle buharlaştırın ve ardından kabarcık destekli ablasyon için 15 saniyelik sürekli dalga maruziyeti uygulayın.

BSA denatüre oldukça, tanısal bir ultrason tarayıcı ile monitör buharlaşması ve kabarcık oluşumu sırasında ultrasonun emilmesi ve ısı üretimi nedeniyle hidrojel opaklaşır. Bu örnek görüntüde ok, PSNE buharlaşmasıyla bir kabarcık bulutunun oluştuğu odak bölgesini göstermektedir. PSNE miktarını artırmadan, ablasyon süresini ve hacmini karşılaştırmak için hidrojelde yeni bir konumda akustik maruziyeti tekrarlayın.

Bu protokol, dar bir boyut dağılımına sahip lipid kaplı perflurokarbon damlacıklarıyla sonuçlanır. Dinamik ışık saçılımı ile ölçülen boyut dağılımı, burada 100 ve 200 nanometre filtreler kullanılarak ekstrüde edilen PSNE'ler için gösterilmiştir. Ordinat eksenlerinin birimleri, belirli bir boyuttaki parçacıklardan saçılan ışığın yoğunluğunun, numuneden gelen toplam saçılan ışık yoğunluğuna oranına dayanmaktadır.

PSNE'nin 100 ve 200 nanometre filtrelerle ekstrüzyondan bir ve yedi gün sonraki ortalama çapı ve standart sapması dinamik ışık saçılımı kullanılarak ölçüldüğünde, sonuçlar PSNE'lerin en az bir hafta boyunca stabil olduğunu göstermektedir. Bu şekil, buharlaşma öncesi ve sonrası PSNE'lerin B mod görüntülerine yer vermektedir. Bir poliakrilamid hidrojelde, ok, PSNE buharlaşmasıyla bir kabarcık bulutunun oluştuğu odak bölgesini göstermektedir.

Bunlar, albumin ve PSNE içeren bir poliakrilamid hidrojelin buharlaşma ve yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason veya Hy Fu ile sonikasyon öncesi ve sonrası görüntüleridir. 15 saniyelik Hy Fu aracılı ısıtma ile bir lezyon oluşturulmuştur. Lezyonun asimetrik şekli, ultrason yolundaki kabarcık bulutunun varlığı nedeniyle meydana gelen odak öncesi ısıtmanın bir sonucudur. Kabarcıklardan kaynaklanan saçılmaya bağlı odak öncesi ısıtma ve lezyon oluşumu, gelişimi sonrası iletilen akustik gücün azaltılmasıyla minimize edilebilir.

Stabil faz kayması nanoemülsiyonlarının üretimine yönelik bu yöntem, ultrason destekli tedavi alanındaki araştırmacıların katı tümörlerde kabarcık destekli HIFU ablasyonunu incelemelerinin önünü açacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, dar boyut dağılımına sahip stabil faz kayması nanoemülsiyonlarının nasıl üretileceği ile kabarcık nükleasyonu ve geliştirilmiş ultrason destekli ablasyonun nasıl inceleneceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.