Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Bir prosedür elektroansefalogram, elektromiyogram ve serebral laktat konsantrasyon takip edilir iken optogenetically kortikal piramidal nöronların etkinlik işlenmesi için tarif edilmektedir. Onlar kendiliğinden uyku / uyanıklık döngüsü geçmesi ise Deneysel kayıtları kablo-tethered fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Optogenetic cihaz laboratuar monte edilmiştir; kayıt ekipman ticari olarak temin edilebilmektedir.

Bu işlemin genel amacı, optogenetik stimülasyon sırasında EEG tanımlı uyku ve laktat konsantrasyonunu kesin stereotaksik koordinatlarda ölçmektir. Laktat sensörü ve fiber optik kablo için gerekli elektroensefalografik uçları ve kanülleri cerrahi olarak implante edin. Ardından fiber optik kabloyu ve önceden kalibre edilmiş laktat sensörünü hayvanın kafatasındaki kılavuz kanüllerine yerleştirin.

Ardından, istenen elektrofizyolojik yanıtı elde etmek için mavi ışık uyaran yoğunluğunu ayarlayın. Daha sonra, hayvanın kendiliğinden davranmasına ve/veya uyumasına izin verilirken elektroensefalografik, elektromiyografik ve laktat konsantrasyon verilerini toplamaya devam edin. EEG'nin farmakolojik çalışmaları gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu deneysel yaklaşım, nöronların aktivitesi saniyenin altında bir zaman ölçeğinde gerçek zamanlı olarak manipüle edilirken beyin biyokimyasını ve elektrofizyolojisini izleme avantajına sahiptir.

Bu nedenle, uyku araştırma alanı için yeni içgörüler sağlama potansiyeli yüksektir. Örneğin, yavaş dalga uykusunun metabolik ve elektrofizyolojik eşlikçileri tanımlanabilir. Bu tür bir deney, öğrenme ve hafıza, sinaptik plastisite veya nöbet bozuklukları gibi sinirbilimin diğer alanlarında da uygulanabilir.

Ameliyat tekniği teknik olarak zordur. Çok fazla el becerisi gerektirir, ancak bu pratik yaparak başarılabilir. Bu görsel gösterimde, yazılı açıklamayı tamamlayacak bazı karmaşık cerrahi prosedürlerin kritik adımlarını yineleyeceğim.

Bir hayvan ameliyattan kurtulduktan sonra, zorluk laktat sensörünü ve fiber optik kabloyu düzgün bir şekilde takmaktır. Jonathan ve ben, bu iki hassas ekipmanı yerleştirmek için hayvanı tutarken sağlam bir elin nasıl kullanılacağını göstereceğiz. Son olarak, uyaranın yoğunluğunu gerçek zamanlı olarak ayarlayarak EEG yanıtının nasıl optimize edileceğini göstereceğiz.

Bu deney için, mavi ışığa duyarlı katyon kanalını ifade eden transgenik fareler kullanın. Kanal, serebral kortikal nöronlarda ikiye ayrılır. İlk olarak, anesteziyi %3 flor, %97 oksijen ile sürdürürken indüksiyon için% 5 flor, % 95 oksijen kullanarak fareyi uyuşturun.

Kafatasının üst kısmında, gözlerin arasından kafatasının arkasına kadar medial bir kesi yapın. Kafatasını hidrojen peroksit ve steril tuzlu su ile temizleyin. Elektrot optogenetik uyaran konfigürasyonları için stereotaksik koordinatları belirlemek için B ve Lambda'yı bulun ve işaretleyin, vida deliklerini yüksek hızlı bir diş matkabı ile astarlayın, 0,5 milimetre bilyalı frez ucu ve ardından 0,7 milimetre bilyeli frez ucu.

Elektrot kelo gram vidalarını oluklu bir el tornavidasıyla deliklere yerleştirin. İstenilen derinliği elde etmek için bunları yaklaşık dört ila beş devirde sürün. Kılavuz kanülleri stereotaksik bir kanül ile yerinde tutun ve ardından bunları kafatasına ve akrilik çimento ile ankrajlara sabitleyin Açıklığı korumak için, her kılavuz kanül, ameliyat zamanından deney zamanına kadar sahte bir kanül veya stile içermelidir.

EEG'ler ve kılavuz kanüller kafatasına yerleştirildikten sonra, bunları ince bir diş akrilik çimentosu tabakası ile birbirine bağlayın. Çimento sertleştikten sonra, telin çimentoda yol açması durumunda, EEG uçlarından plastik konektör üzerindeki kontaklara çıkan tellerin uçlarında satılan plastik konektörü kurumuş çimento höyüğünün üzerine yerleştirin. Daha sonra elektromiyogram tellerini 21 gauge iğnenin namlusuna kaydırarak çekirdek kaslarından geçirin.

Kas bağı içinden delinmiş, bir çift cerrah düğümü, bu tellerin etrafında, kas dikişinden çıktıkları yerin hemen distalinde beş sıfırlı bir naylon sütür bağlayın, kas dokusuna erişmek için geri çekilen deri, ters kesme P üç iğne ve beş sıfır naylon sütür kullanılarak tek kesintili cerrah düğümleri ile birleştirilir. mc uyaran ünitesi programlandıktan sonra, beş voltluk ikili açma-kapama sinyali olarak bağımsız bir sinyal üreteci olarak çalıştırın. mc uyaran ünitesini BNC konektörlü lazerin TTL özellikli güç ünitesine bağlayın.

Lazer güç ünitesini bir şerit kablo ile lazere bağlayın. Ayrıca lazeri, kaynak fiber optik yama kablosundaki erkek FC konektörüne bağlayın. Kaynak fiber optik kabloyu döner bağlantıya bağlayın.

Komütatör Fiber optik döner mafsal, komütatör görevi görür. Hayvan kafesi etrafında hareket ederken, dönme torku nedeniyle fiber optik kabloların kırılmasını önlemek için döner mafsal döner. Plastik kablo bağları ile komütatörü, hayvanın barındırıldığı silindirik kafesin üzerine yerleştirilmiş metal bir standa sabitleyin.

Fareyi kapalı bir avucun altına sabitlemek için bir elinizi kullanarak fareyi kısıtlayın. Başınızı deneycinin orta ve işaret parmağı arasına yerleştirin. Şimdi steril bir 25 gauge iğne kullanarak kılavuz kanülü döküntülerden, döküntülerden temizleyin.

Ardından fiber optik kabloyu elle takın ve dişli bir vidalı kapakla fiber optik kılavuz Kanül'e sabitleyin. Fiber optik kablonun beyindeki giriş derinliğini, düz bölünmüş uçtan sabit bir mesafede fiber optik kabloya bağlanan bir dikiş düğümü ile kontrol edin. Sensör, fosfat tamponlu tuzlu su ile eşitlenir ve kademeli olarak üç konsantrasyonda L laktata maruz bırakılır.

Üretici protokollerine göre, önceden kalibre edilmiş sensörü, fiber optik kablo yerleştirme prosedürüyle aynı şekilde kafatasına monte laktat kılavuz kanülüne yerleştirin. Laktat sensörünü, bipolar fiş konektörlü pinnacle 8, 400 biyosensörünün ön amplifikatörüne bağlayın. Ardından bu ön amplifikatörü cerrahi olarak implante edilmiş kafa montajındaki sekiz pimli konektöre takın.

Veri toplamadan önce, optogenetik uyaranın yoğunluğunu ayarlamak için lazer yoğunluk kontrol düğmesini kullanın. EEG yanıtının genliği, sistematik olarak çalışılmamış faktörlere bağlı olarak hayvanlar arasında değişecektir. Bu nedenle, optogenetik uyaranın yoğunluğunu ayarlamak ve istenen yanıt elde edildiğinde EEG yanıtının yeterli olduğunu doğrulamak gerekir.

Nöro skoru ile Pinnacle 8, 400 sistemini kullanarak veri toplayın. Bir SEIA arayüzü, EEG ve EMG veri sürecinin görsel olarak incelenmesiyle uyku durumlarını sınıflandırır. EEG ve EMG'ye dayalı olarak uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi, uyku veya hızlı göz hareketi uykusu olarak on saniyelik dönemlerdeki veriler.

Bu biyosensör optogenetik uyaran konfigürasyonu, optogenetik stimülasyon için cerrahi olarak implante edilen EEG elektrotlarını, laktat sensörünü ve kanülü gösterir. Optogenetik stimülasyonun yokluğunda, bu fare spontan uykuya maruz kaldı. E-E-G-E-M-G ve serebral laktat konsantrasyonu sürekli izlenirken uyanıklık durumu geçişleri ve uykunun iki alt tipi oldu.

Hızlı göz hareketi ve hızlı olmayan göz hareketi, EEG ve EMG'ye göre tanımlanır. İlginç bir şekilde, laktat biyosensör akımı, düşük genlikli EEG'nin bir fonksiyonu olarak yükselir ve yüksek genlikli EEG'nin bir fonksiyonu olarak düşer. EEG'nin her iki kanalı da frontal kortekste verilen optogenetik uyaranlara duyarlıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, beyindeki elektroensefalogram, elektromiyogram ve laktat konsantrasyonunun eşzamanlı optogenetik manipülasyonu ve ölçümü için bir farenin cerrahi olarak nasıl implante edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu cerrahi teknik 90 ila 120 dakika içinde düzgün bir şekilde gerçekleştirilebilir. Anestezi derinliğinin bir göstergesi olarak hayvanın solunumunu sürekli olarak izlemeyi unutmayın.

Hayvan her dört ila beş saniyede bir defadan daha az nefes alıyorsa, anestezi çok derin olabilir. Hayvan her iki saniyede bir defadan daha sık nefes alıyorsa, anestezi çok hafif olabilir. Flor gazı, anestezik ajanı kullanırken uygun güvenlik önlemlerini almayı unutmayın.

Retinanızı optogenetik stimülasyon için kullanılan lazerden korumak için cerrahi süitte yeterli havalandırma sağlayın. Ya koruyucu gözlük takın ya da hayvanı ışık geçirmez bir dolaba koyun. Laktat biyosensörünü ve fiber optik kabloyu tamamen uyanık bir fareye implante etme alıştırması yapmak isteyeceksiniz.

Fareler bu prosedürlere uygun değildir ve hareketsiz hale getirilmelidir. Bununla birlikte, kısıtlama, hayvanı yaralayacak veya solunumu önleyecek kadar güçlü olamaz.