Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerini veya H PSC'lerini çok titreli bir plaka formatı kullanarak nöronlara ayırmaktır. Bu, H PSC'lerin tek hücreli bir süspansiyonunun V tabanı 96'ya hasat edilmesi ve kaplanmasıyla elde edilir. Gece boyunca embriyo cisimcikleri veya EBS oluşturmak için iyi plakalar.

Daha sonra, EBS, nöroektoderm oluşumunu indüklemek için farklılaşma ortamı içeren U şeklinde ultra düşük bağlantı plakalarına aktarılır. Daha sonra, EBS, nöronların büyümesini teşvik etmek için matrigel kaplı tabaklar üzerine kaplanır. İmmünofloresan ile sekizinci gün civarında tipik nöronal belirteçlerin varlığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Boyama İnsan pre-potent kök hücrelerini nöronlara ayırmak için protokoller genellikle karmaşık ve sıkıcıdır. Biraz yanlışlıkla. İnsan pre potent kök hücrelerinden nöron yapmak için çok basit bir prosedürle karşılaştık.

Teknik açıdan, mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, uygulanmasının kolay, hızlı ve uygun maliyetli olmasıdır. Aynı zamanda, prosedürü sunan laboratuvardan Dr MI Z olacaktır. Yazılı protokolde belirtildiği gibi EB oluşum ortamını ve farklılaşma ortamını hazırlayın.

H PSC'leri, matrigel kaplı plakalar üzerinde metamfetamin şartlandırılmış bir ortam gibi besleyici içermeyen koşullar altında veya alt birleşik aktif yetiştirme koşulları altında kimyasal olarak tanımlanmış kültür sistemleri kullanarak büyütün. Steril plastik pipet uçlu bir stereo mikroskop kullanarak, kendiliğinden farklılaşmış kolonileri mekanik olarak çıkarır. Kalan farklılaşmamış kolonileri PBS ile yıkayın ve tek hücrelere sindirmek için bir x kaya inhibitörü içeren Accutane kullanın.

Tek hücreleri iki dakika boyunca 200 G'de santrifüjleme ile pellet ve Resus küçük bir hacimde EB oluşum ortamında süspanse edin. Hücre titresini belirlemek için bir hemo sitometre kullanın. Mililitre başına 40.000 ila 80.000 hücre arasında bir titreye ulaşmak için kalan EB oluşum ortamına ek hücreler ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, oyuk başına 100 mikrolitreyi 96 V'luk bir alt plakaya aktarın, bu da başına 4.000 ila 8.000 hücre ile sonuçlanır. Kuyu. Kuyucukların dibindeki tüm hücreleri toplamak için plakayı bir dakika boyunca 400 G'de bir açılır plaka santrifüjünde döndürün. Hücreleri bir inkübatöre aktarın ve ertesi gün stereo mikroskop altında gece boyunca EBS'nin oluşmasına izin verin.

EBS'yi toplayın ve küçük bir hacimde iki mililitre farklılaşma içeren 3,5 santimetrelik bir bakteri kabına aktarın. Orta. Çanağı hafifçe döndürerek hücreleri yıkayın. Ultra düşük bir ataşman için her bir kuyucuğa 100 mikrolitre farklılaşma ortamı ekleyin.

Stereo mikroskop altında alt 96 kuyulu plaka. EBS'yi küçük hacimlerde yıkama kabından 96 U kuyucuğuna aktarın. Dördüncü günde nöroektoderm oluşumuna izin vermek için EBS'yi dört gün boyunca inkübe edin.

Hücreleri farklılaşma ortamında yıkayın ve bunları 12 oyuklu bir plaka gibi matrigel kaplı çok titreli bir plakanın kuyucuklarına birer birer tohumlayın. Nöronların rahatsız edilmeden büyümesine izin vermek için hücreler kuyucuklar içinde eşit olarak dağıtılmalıdır. EBS'nin oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca matrijele gevşek bir şekilde yapışmasına izin verin.

Ardından plakayı dikkatlice inkübatöre aktarın. Nöronlar, önümüzdeki dört gün içinde kaplanmış EBS'den radyal bir şekilde büyüyecek. Daha önce, diğer pek çok şeyle uyumlu olarak, H PSC'lerden EBS'nin, H HPC'lerin düşük bağlantılı kaplara rutin olarak bölünmesi üzerine agregaların yeniden kaplanmasıyla basitçe üretilebileceğini gösterdik.

Bu genellikle hücre boyutlarının geniş bir dağılımına neden olur. Diğer bir sorun, süspansiyonda tutulan EBS'nin birbiriyle toplanma eğiliminde olmasıdır, bu da bu tek H'yi atlatmak için daha yüksek boyut heterojenliğine yol açar, PSC'ler düşük bağlanma kuyularında savunuldu, bu da EB oluşumu ve hücre ölümü ile sonuçlanmadı. Bununla birlikte, hücre sağkalım molekülü Y2 7 6 3 2'nin, HSC'lerden EB oluşumunu arttırdığı gösterilen polivinil alkol ile birleştirilmesi, EBS'nin gece boyunca tek hücreli HESC süspansiyonlarından oluşmasına izin verdi.

Uygun bir şekilde, bu çok titreli plaka formatındaki EB boyutları, kuyu başına farklı sayıda hücrenin oturtulmasıyla sıkı bir şekilde kontrol edilebilir. Konvansiyonel tekniklerin kullanılmasının aksine, EBS'yi ultra düşük bağlantılı 96 U plakalara aktardıktan sonra, F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA iki ve BP SMA bir inhibitörlerinden oluşan küçük bir molekül kokteyli kullanılarak nöroektoderm oluşumu indüklendi, bu da hücrelerin nöronlara yol açmak için matrigel üzerine kaplanmasına izin verdi. Yaklaşık 8.000 hücreden EB oluşumunu başlatmak, kaplanmış ebs'den belirgin nöronal büyümeler ile karakterize edilen en iyi nöronal farklılaşma kapasitesini verdi.

Kaplamadan sonra azalmış nekrotik EB merkezleri ve B, rrn, üç A ve beta üç tübülin gibi duyusal ve pan nöronal belirteçlerin yüksek ekspresyonu. Genel nöronal farklılaşma verimlilikleri, şimdiye kadar hem HSC'ler hem de HI PSC'ler için geçerli olan orijinal prosedürle karşılaştırılabilir görünmektedir. Üç bağımsız HPSC hattı, HES ve HIPS hücreleri çok kuyulu prosedürde başarıyla test edilmiştir, oysa hücre hattına bağlı değişkenlik ve farklılaşma verimlilikleri genellikle göz ardı edilemez.

Bu şekil, tek hücreler olarak plakalanmış ve yaklaşık% 60 verimlilikle başarılı bir şekilde farklılaştırılmış, ayrışmış tek günlük dört nöroektodermal hücreyi göstermektedir EBS'yi çoklu baştankara platformunda kullanmak, başlangıçta biraz eğitim gerektirir, ancak bir süre sonra bunun oldukça kolay olduğunu göreceksiniz.