Name: Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Keşfedin saç folikülü oluşumunda hücreler arası sinyal yollarını hızlı greft tekniğiyle. Yenidoğan farelerden izole edilen hücrelerde gen manipülasyonu yaparak saç rejenerasyonunu inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ve NIH hibe AR052785 ve AR046786 (AEO ve W.-MW) tarafından desteklenmiştir.

1. Cilt Diseksiyon için 0 ila 2 gün Eski Yenidoğan Fare hazırlayın <ol><li> En az 20 dakika süreyle bir CO 2 odalarını kullanarak fare yavrular Euthanize. Kadar diseksiyonu kadar bir saat için buz üzerinde yavrular bırakın. P0-P2 fareler oldukça eski fareden hazırlanan hücreler olarak tavsiye edilir progenitör kapasitesi düşmüş düşük greft verimleri sonuçlar. % 70 etanol bir tabak (adım 1.3) ve yıkama solüsyonu üç yemekler (adım 3) hazırlayın cildin diseksiyon yapmaya hazır. Dispase Çözüm çözülme ve 4 bırakın ° C Servikal ötanazi sağlamak için CO 2 aşırı maruz kalma sonrasında yavruların yerinden. </li><li> Buz ve steril bir akış kaputu transferi bir kültür çanak ötenazi yavrular yerleştirin. </li><li> Kısaca steril kültür çanağı üzerine% 70 etanol ve yerde daldırarak yavrular yıkayın. </li></ol> 2. Fare Cilt teşrih <ol><li> Steril makas ile gövde tabanına her uzuv ve kuyruk kesiniz. </li><li> Cu çifti arasında sıkıca vücut tutunSVEd forseps ve baş yatan fasya nüfuz etmeden bir neşter kullanılarak kuyruk dorsal cilt boyunca bir kesi yapmak. </li><li> Dikkatlice uzakta fare orta hattan cilt soyma. </li><li> Kavisli bir forseps uzun kenarı ile sıkıca maruz fare tutun ve fare posterior sonunda deri altında kavisli bir forseps bir çift ekleyin ve hafifçe fare ventral yarısında doğru kalça üzerine deri çekin. </li><li> Dikkatle tek bir hareketle tamamen fare kapalı cilt soyma ve karkas atın. </li></ol> 3. Dispase Çözüm Cilt ve İnkübasyon yıkayın <ol><li> Dermis yüzü yıkama solüsyonunun ilk çanak cildin aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Cilt Dağılın ve forseps ile karıştırılır. Sonraki kaplamayı diseksiyon ise yıkama solüsyonunun ilk çanak cilt bırakın. </li><li> Yıkama çözeltisinde ilk çanak içinde bir sonraki parçalara deri yerleştirdikten sonra, yıkama çözeltisi, ikinci çanak için önce deri aktarın. Inci derileri tutune ikinci yıkama solüsyonu bütün derilerden toplanana kadar. Nihai yıkama derileri tüm transfer, kısaca ajitasyon. </li><li> Steril bir 10 cm kültür çanak için 10 ml buz soğuk dispase ekleyin. Dispase Çözüm için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. </li><li> 4 de 8-16 saat boyunca cildi Float ° C (alternatif seçenek: 1 saat 37 ° C&#39;de). </li></ol> 4. Ayrı Dermis ve epidermis <ol><li> Yeni bir steril kültür çanak için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. Bir neşteri ile bir köşeden dermis dikkatlice basılı tutun. </li><li> Forseps ile epidermis kavrayın ve yavaşça sıyırın dermis. Epidermis uzakta tek parça olarak soyma gerekir. Epidermis beyaz ve ince olacak ve dermis, kahverengimsi kalın ve jelatinimsi olmalıdır. </li><li> Ayrı steril kültür kaplarına iki dokular ayırın. <ol class="lalpha"><li> Bir dermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, dermis almak ve t ile çok küçük parçalar halinde doğrayınwo neşter. Epidermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte cilt hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş epidermal hücreler hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. </li><li> Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, 6 içine her epidermisin dilim - 8 küçük parçalar. Dermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte epidermal hücreleri ile birleştirmek için taze, işlenmemiş deri hücrelerini hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. </li></ol></li></ol> 5. Kıyılmış Doku Primer Fare Dermal Hücreleri (MDCS) ayrışır <ol><li> 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de taze collagenase Çözelti, dermal parçalar inkübe edilerek MDCS ayrışır. Yavru fare başına kollajenaz Çözüm 10 ml kullanın. </li><li> Yavaşça solüsyon içeren dermis her 10 dk karıştırın. Bir mikroskop altında ayrışma derecesini kontrol edin; sindirilmiş hücre süspansiyonu çoğunlukla tek hücre olmalıdır. Çözüm açık itibaren bulutlu değiştirmek gerekirdermal hücrelerin dermis uzaklaşılmış. </li><li> Kollajenaz aktivitesini azaltmak için% 10 nihai hacmi dermis içeren Kollajenaz Çözüm FBS ekleyin. </li><li> Sindirilmemiş iri küme ve bütün köklerinin kaldırmak için yeni bir 50 ml tüp içine bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirir. 30 ml başına DMEM/10% FBS 10 ml ekleyin akan daha kollajenaz sulandırmak için. </li><li> Santrifüj tüpleri daha bütün köklerinin kaldırmak için 5 dakika süreyle bir masa santrifüj 30 xg&#39;de sindirilmiş dermis içeren. </li><li> Yeni bir 50 ml tüp süpernatantı dikkatle aktarın. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> DMEM/10% FBS ile hücrelerin (yavru başına 1 ml) süspanse edin ve hücreleri saymak. Enfeksiyonu için Amniomax C-100 medya (adım 7) Levha hücreleri veya (adım 9) greft lentivirüs-enfekte KC ile birleştirmek. Tipik verim yavru başına 20 x 10 6 hücre olduğunu. </li></ol> 6. Birincil Keratinosit çözerlerKıyılmış Doku dan s (KC) <ol><li> 15 dakika boyunca 37 ° C &#39;de taze çözülmüş% 0.05 tripsin-EDTA ile epidermal parçalar inkübe edilerek KC ayrışır. Pup fare başına Tripsin-EDTA 7 ml kullanımı. </li><li> Epidermis her 5 dk içeren yavaşça girdap çözüm. </li><li> Tripsin aktivitesini azaltmak için tripsin-EDTA içeren epidermis Nötralleştirme Çözüm eşit hacmi ekleyin. </li><li> 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. Kalan sindirilmemiş dokusu üstünde yüzer olmalıdır. </li><li> Dikkatlice sindirilmemiş doku ile süpernatant çoğu kapalı dökün. Rahatsız edici hücre pelletini olmadan bir 10 ml pipet ile kalan Süpernatantı. PBS ile hücre pelletini tekrar. Durumda KCS tamamen pelet değil, süpernatant çoğu kapalı dökün ve en hücrelerin peletlenmiş kadar santrifüj tekrarlayın. </li><li> Kalan doku veya kümeleri kaldırmak için yeni bir tüpe 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu süzün. </li><li> Santrifüj Pelet hücreleri5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg. </li><li> CnT-07 ortamı ya da PBS (PUP başına 1 ml) ve sayım hücrelerde yeniden süspanse hücreler. Enfeksiyonu için kaplama hücreleri (adım 7) CnT-07 kullanın (adım 9) greft lentivirüs-enfekte MDCS ile birleştirmek PBS kullanın. Tipik verim yavru başına 3-10 x 10 6 hücre olduğunu. </li></ol> 7. ShRNA veya cDNA içerenler Lentivirus ile Primer Hücre Infect Enfeksiyon gününde (adım 9) aşılama günü virüsle enfekte olan hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş primer KCS veya MDCS hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. <ol><li><ol class="lalpha"><li> MDCS için plaka 4 x 10 37 AmnioMAX-C100 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 MDCS ° C,% 50 hücre yoğunluğu ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. MDCS genellikle 3-4 plakaları bir aşı üretmek için kullanılır, ve plakalar 10-12 toplam bir deneyde, üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. Alternatif olarak, MDCS eklemek izin ve f yayıldıya da 37 az 2 saat, en az ° C ±% 5 CO2 ve enfeksiyon hücre kaplama aynı gün yerine getirir. MDCS fibroblast benzeri morfolojiye sahip olacaktır. </li><li> KC için, plaka 12 x 10 37 CnT-07 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 KC ° C ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. Alternatif olarak, KC 37 az 2 saat en az takın ve yaymak izin ° C +% 5 CO 2 ve aynı gün enfeksiyonu gerçekleştirin. KC Genellikle 3-4 tabak bir greft oluşturmak için kullanılır. 10-12 plakaları toplam bir deney için üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. KCS arnavut morfolojisi sahip olacaktır. </li></ol></li><li> 37, 8 ug / ml Polybrene Çözelti ° C ±% 5 CO2 ile 5-10 dakika için hücreler Preincubate. </li><li> Değişim medya ve lentivirüs eklemek + 8 mg / ml Polybrene Çözüm. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon öncesi tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. </li><li> 32, 1 saat boyunca bir masa üstü santrifüjü 200 x g&#39;de santrifüjleyin ° plakaları; Lentivirüs ile hücreleri enfekte etme C. </li><li> Lentivirüs içeren ortamları çıkarın ve taze medya ekleyin. KC için, taze medya geri eklemeden önce bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. Genellikle enfekte hücreleri kurtarmak 37 gecede ° C +% 5 CO 2. Alternatif olarak, 37 iyileşme en az iki saat izin ° C aşı için hücreler tripsinize önce +% 5 CO2. Temsilcisi Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi enfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için kültür bulaşmış hücrelerin küçük bir kısmı için devam edin. </li></ol> 8. Aşılama için Enfekte Hücreler hazırlayın <ol><li> 4-6 arasındaki adımları kullanarak cilt taze primer MDCS veya KCS ayırın. Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak. </li><li><ol class="lalpha"><li> Dermal spesifik gen devirme / ekspresyonu için aşı, 8 dk için 37 ° C sıcaklıkta% 0.05 tripsin-EDTA ile plakalar enfekte MDCS ayrışır. </li><li> Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft için plakalar USI enfekte KC ayırmak37 ng% 0.125 Tripsin-EDTA ° C de 15 dakika. </li></ol></li><li> DMEM +% 10 FBS (MDCS) veya Nötralleştirme Çözüm (KC) kullanarak tripsin aktivitesini nötralize. 50 ml&#39;lik bir tüpe hücreler tripsinize aktarın. </li><li> 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak. </li><li> Taze hazırlanmış işlenmemiş mevkidaşı ile hücre tipi virüsle enfekte olan hücreleri birleştirin. Bir greft için, 4 ° C&#39;de buz soğuk steril PBS ve pelet bir masaüstü santrifüj hücre bulamaç 7-10 x 10 6 KCS ile 7-10 x 10 6 MDCS birleştirmek 50 -100 ul buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Nu / nu fare odaları hazır olana kadar buz üzerinde hücreleri tutun. </li></ol> 9. Nu / nu Fare Back üzerine Yara Yatak ve Fix Odası Oluştur Greftleme bir gün önce% 70 etanol içinde iliklerine tarafından otoklav ve steril silikon odaları ile cerrahi aletleri sterilize edin. 70% etha değiştirinodaları kullanmadan önce steril PBS ile nol. <ol><li> Anestetize nu / nu fare (7-12 haftalık dişi) intraperitoneal (100 μl/10 g vücut ağırlığı) ya da başka bir tercih edilen yöntemi yolu ile ketamin (8 mg / ml) / ksilazin (1.6 mg / ml) kullanarak. Göz yağlayıcı. Farenin altındaki Sıra ısıtma pedi. </li><li> Iyot ile çıplak fare geri deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin. </li><li> 1-3 topikal kesi site% 0.25 bupivakain düşer ekleyin. Forseps ile boyun tabanındaki çıplak fare geri cilt sıkıştırın. </li><li> Steril makasla sıkışmak deride küçük dairesel delik (çapı ~ 1 cm) kesin. </li><li> Yara yatağı üzerine steril odasına yerleştirin ve cilt çevreleyen odaya kenarlarını kaplayacak. </li><li> Şekil 2A gösterildiği gibi kamara kenarlarında dikiş (kamara başına 6 dikiş) ile yerine Güvenli odası. </li><li> odaları hazır, yavaşça girdap hücre çamur ve 1 ml enjektöre bağlanmış 23 gauge iğne içine çekmek. Hücre bulamaç yavaşça alt yoğunlaşmış iseiğne içine çizmeden önce 1 ml pipet ucu ile tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Delinme iğne ile oda ve yavaş yara üzerine hücreleri damla. </li><li> Temiz, otoklavlanmış kafesleri içine yerleştirin fareler. House 2 kafes başına fareler ve içme suyu için antibiyotik ve Tylenol (3 mg / ml) ekleyin. Bizim tecrübelerimize göre, kafes başına iki dişi farelerde olumsuz odasına travma, greft, veya hayvan sağlamamıştır. </li><li> Yarım kafesinin altında ısınma pedi yerleştirin ve anestezi kapalı giyer kadar fareler gözlemlemek. </li></ol> 10. 7-9 gün sonra Odası kaldır <ol><li> Adım 9.1 &#39;de olduğu gibi odacıklı nu / nu fare anestetize. Göz yağlayıcı. </li><li> Iyot odasının etrafında deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin. </li><li> Dikkatlice dikiş kesip odasından çıkarın. </li><li> Yavaşça fare odası çıkarın. Odaya yeni deri grefti sopa, forseps kullanarak odasından odasının parçası ve yavaşça ayrı greft kaldırırsanız. Odanın çıkarılması sırasında greft basılı tutun. Greft loo gerekirŞekil 2B gibi k mat ve opak. </li><li> Yeri (2 ilmek) içine açık yara ve dikiş üzerine antibiyotik ince bir film ile bir yapışmaz pad uygulayın. </li><li> Ped güvenli ve yara korumak için fare etrafında bandaj sarın. Yerine bandaj dikin. </li><li> Silikon odaları sabunla ovarak temizlenmeli ve iyice deiyonize su ile durulanır. % 70 gecede etanol, hava kuru ve mağaza odaları bekletin. </li></ol> 11. Saç Büyüme için Fare inceleyin <ol><li> Odasının kaldırılması 3 gün sonra bandaj ve pedi çıkarın. Greft kuru ve kahverengi renkte opak olmalıdır. </li><li> Saç büyümesi için periyodik farelerde kontrol edin. Saç greft sonra 16 gün de göstermeye başlamalıdır. </li></ol> Prosedür Anahat 1. Gün (2-3 saat): yenidoğan yavrular Kurban deri kaldırmak ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın. 2. Gün (2-3 saat): derinin primer hücreler izole veönerilen hücre yoğunluğu plaka. 3. Gün (3-4 saat): lentivirüs sahip hücreler Infect. Yenidoğan yavruların başka bir dizi deri çıkarın ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın. 4. Gün (6-8 saat): derinin primer hücreler izole, saymak ve buz üzerinde bırakın. Tripsinizasyonla ve santrifüj ile lentivirüs-enfekte hücreleri Kurtar, saymak ve greft başına PBS 50-100 ul içine 7-10 x 10 6 dermal hücrelerin ve keratinositlerin birleştirir. Fare üzerindeki yara yatağı oluşturma, kamara takın ve yatak yara hücre karışımı uygulanır. Alternatif Prosedürü Outlines Alternatif yordamı anahatları dört gün üç prosedürü kısaltacaktır. <ol><li> Bir saat (tahmini süre 5-7 saat) için 37 ° C&#39;de dispase fare derileri davranarak Gün 1 ve Gün 2 birleştirin. </li><li> İki saat boyunca kaplama hücreleri (tahmini süre 5-7 saat) sonra lentivirüs ile hücreleri nüfuz ederek Gün 2 ve 3. Gün birleştirin. </li></ol>

<ol><li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li>
<li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li>
<li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li>
<li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth%3A+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li>
<li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li>
<li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li>
<li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li>
<li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo%3A+determination+of+follicle+formation%2C+hair+growth%2C+and+hair+quality+by+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li>
<li>Woo, W. -M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li>
<li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly%28ethylene-co-vinyl+alcohol%29+membranes+for+hair+follicle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li>
<li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+from+dissociated+cells%3A+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Saç sulandırıldıktan deneyleri de novo saç folikülünün oluşum mekanizmasını incelemek için eşsiz bir organ yenilenmesini model sağlar. Burada, biz saç folikülü oluşumu gen fonksiyonu belirlemek için kullanışlı bir modifiye kamara saç testi açıklamak. Bizim bu tahlil epidermis hücre tipleri ya da gen ekspresyonu ya da devirme elde etmek için bir teknik lentiviral ifade tanıtmak için modifiye bildirilen oda saç sulandırma tahlil 5, 6,11, esas alınmaktadır. Bizim assay doku-spesifik genetik nakavt oluşturmadan hızlı bir alternatif sunuyor. Bu test bize greft toplama lentivirüs primer hücreler bulaşmasını kadar az üç hafta içinde saç folikülü oluşumu gen fonksiyonu göstermek için izin veriyor. Tüm tahlil bir hücre tipinde 12 içine lentivirüs ile kombinasyon shRNA / cDNA teslim kullanılarak genetik etkileşimleri gidermek için uzatılabilir gibi dermal ve epidermal hücre tip arasında sinyal inceleme sağlares. Ince kusurları gözlemlemek zor iken Bizim saç testi iyi, saç folikülü rejenerasyon güçlü kazanç veya kayıp fonksiyon-fenotipleri tespit için uygundur. Biz başarıyla saç rejenerasyon tahlil 1,12 kullanarak birkaç gen dermal özgü gen fonksiyonu göstermiştir. GFP işaretleyici dayanarak shRNA 10 ifade lentivirüs vektöründen ortak ifade, biz donör dermal hücrelerde eksprese shRNA rejenere saç greft devam ettiği gösterilmiştir. GFP pozitif hücreler rejenere saç köklerinin (Şekil 3) dermal papilla (DP) mevcuttu. Hücreleri dolayısıyla gözlenen saç folikülü fenotipi null genetik hypomorph bir dizi vardı, GFP düzeylerde ifade olarak DP hücreler olasılıkla gen demonte farklı düzeylerde oluşuyordu. Bu tahlil için bir gelişme graftin önce yüksek shRNA eksprese eden hücreler için hızlı ve etkili bir seçim kurmak için olacaktırg kuvvetli GFP-ifade eden hücrelere arındırmak için FACS kullanılması. Alternatif bu tahlil 9 mutant ya da koşullu knockout hücre ikame etmektir. Primer dermal geçişli hücreler bir kez DP etki yavaş yavaş kaybolması gibi diğer yandan, DP hücre fonksiyonunu koruyan bir kültür sistemi çok yararlıdır. Potansiyel kültür sistemleri yapay niş veya toplama kültürlerden 2,7,8,13 türetilen biyomalzemelerin kullanımını içerir. Başka bir gelişme bu dermal-spesifik kaybı ya da taze keratinositler oluşturmak için fare yavruların bir ikinci birimler kümesi (adım 7) &#39;nin kullanımını azaltır gibi yüksek bir hücre geri kazanım oranı ile, güvenilir bir epidermal hücre dondurma yöntemi kazanç-of-üretmek için olacaktır fonksiyon çalışmaları. Saç büyüme biraz daha eşitlenmiş ve follikül yönelim daha rastgele olmasına rağmen bu kamara saç testi, saç folikülü yoğunluğu ve normal fare derisine benzer kalitede üretir. Saç rejenerasyon genetik testin birkaç sınırlamalar dahil olmak üzereE lentivirüs ve hücre sayıları büyük miktarda ihtiyacı ve bu tür yama ve flep testleri 3,4,14 gibi saç sulandırma testlerinin diğer formları ile karşılaştırıldığında cerrahi yöntemler açısından yoğun çok emek. Ancak, saç büyüme tespit etmek için saç folikülleri ve zaman çizelgesinin kalitesi diğer deneyleri 4 üstündür. Bizim hedef saç rejenerasyon tahlil varolan genetik modellere hızlı ve kolay bir arkadaşı sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> # Katalog </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Hücre K Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Ek </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> , Kollajenaz Tip 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Doku kültürü çanak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon Makaslar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> kavisli </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Kaynağı </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Size hayır. 10 </td></tr><tr><td> 70 mikron hücre boyama </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konik santrifüj tüpüne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49d </td><td></td></tr><tr><td> Alkol swablar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Göz yağlayıcı </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-lodine bezlerden </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Dikişler </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Esnek bandaj </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Yapışmaz pansuman </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözüm yıkayın PBS 500 mg / ml Penisilin / Streptomisin 12.5 mg / ml Fungizone 100 mg / ml gentamisin Dispase çözümü HBSS 2.5 mg / ml nihai dispase 100 mg / ml gentamisin Nötralizasyon medya HBSS % 15 (v / v) FBS Kollajenaz çözüm % 0.25 (w / v), kollajenaz Tip 1 ontent &quot;&gt; 100 ug / ml penisilin / streptomisin 2.5 mg / ml Fungizone 50 mg / ml gentamisin Polybrene çözümü HBSS 8 ug / mL &#39;lik (ağırlık / hacim) Polybrene </td></tr></tbody></table>

saç rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal sinyal rapid genetik analizi

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Saç folikülü morfolojilerinden, epitel kökenli keratinositlerin ve altta yatan mezenşimi arasındaki etkileşimi gerektiren karmaşık bir süreçtir, organ gelişimi ve doku-spesifik sinyal incelemek için cazip bir model sistemidir. Saç folikül gelişimi olmasına rağmen bu süreç için önemli faktörler genetik uysal, hızlı ve tekrarlanabilir analiz bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada hedeflenen ekspresyonu ya da bir doku-spesifik bir şekilde lentivirüs kullanarak faktör shRNA-aracılı devirme oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Bir saç rejenerasyon modeli 5, 6, 11 değiştirilmiş bir sürümünü kullanarak, saç folikülü morfolojilerinden yol epitelyal-mezenkimal sinyal yollarının çalışma kolaylaştırmak için sağlam kazanç veya birincil fare keratinositler ve dermal hücrelerin kaybı fonksiyon-analizi elde edebilirsiniz . Biz lentivirüs contai teslim, taze Birincil fare keratinosit ve dermal papilla hücrelerini ve bunların öncüleri içeren dermal hücreleri izole etmek nasıl tarifhücre popülasyonlarının birine shRNA ya da cDNA ya da vaziyette, ve çıplak farelerin sırt üzerinde tam olarak oluşmuş saç kökü oluşturmak için hücrelerin bir araya getirir. Bu yaklaşım, üç hafta içinde saç köklerinin üretmek için gerekli doku-spesifik faktörlerin analizine olanak ve mevcut genetik modellere hızlı ve kolay bir arkadaşı sağlar.

Şekil 1 &#39;de bir 3-haftalık rejeneratif saç aşı olarak, düzeltilir (SMO), kritik bir Shh sinyal bileşeninin dermal-özgü lentiviral shRNA portatif bir sonucu göstermektedir. Yalnız lentiviral vektör kullanarak Kontrol greftler sağlam saç büyüme (Şekil 1A) göstermektedir. Buna karşılık, saç büyüme (Şekil 1B) kaybına SMO sonuçlarının dermal özgü devirme. Hematoksilen ve eozin leke saç kontrol folikülleri ve deneysel koşullar (Şekil 1C, D) sahne resmediyor. Benzer tedaviler saç büyüme fenotipi lentiviral vektör yalnız enfeksiyonu ile pozitif kontrol dahil olmak üzere, deneyler arasındaki değişken olabilir. Bu nedenle her zaman pozitif kontrol greft greft% 30 yara izi veya greftler tamamlanmamış ek bir sonucu olarak bozulabilir bir referans olarak, her deneyde de dahil edilmelidir. Yeniden bir faktör cDNA örneğin eksprese olarak iki etken arasındaki etkileşim test durumunda,Başka bir faktör scue shRNA aracılı demonte bir zaman tezahür her deneyde kaybı fonksiyon-sonuç knockdown yalnız greft içermelidir. Bu, belirli bir gen saç folikülü rejenerasyon yolu ve nasıl iki gen etkileşim bozulacaktır nasıl belirlemek için gerekli bir dizi sağlayacaktır. Bölmesinin (Şekil 2A) çıkarılması dikkatle yapılması gerekmektedir. Yeni kurulan greft donuk bir yüzey (Şekil 2B) ile hafif opak olmalıdır. Greft greft yara yatağa bağlı kalır emin olmak için önemlidir bu yüzden yavaşça bir tarafı kaldırarak, odasına yapışabilir. Greft üç gün sonra oldukça istikrarlı ve soyunma çıkarırken biraz zorluk sunmalıdır. Sağlam saç büyüme üç hafta (Şekil 2C) sonra uyulmalıdır. MDCS veya KCS ya da yokluğu, saç (Şekil 2B) 11 olmaksızın, geri kazanılmış bir yara bölgesinde neden olur. Birindeki hücre ölüm ya da hücre kaybınaŞekil 1B &#39;de gösterildiği gibi dermal-SMO devirme azaltılmış saç rejenerasyon aksine, saç içinde hücre tipleri de sonuçlanır. Başarılı bir tahlil sağlamak için, aşılama öncesinde uygun ekspresyonu ya da devirme verim ile% 90&#39;dan daha fazla hücrelerin viral enfeksiyon elde etmek için çok önemlidir. Aşılama işlemi sırasında kısıtlamaları nedeniyle, biz bir aşılama deney başlamadan önce sorun çekim viral enfeksiyon verimliliği, tavsiye ve her zaman kaybı veya kazancı-of-ekspresyonu doğrulamak için prosedür aşılama günü hücrelerinin küçük bir bölümünü kaydedebilirsiniz. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon 90-100% verim elde etmek için önce tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Biz lentiviral vektöründen coexpressed GFP ile viral enfeksiyon etkinliğini izlemek. Biz rutin knockdown veya aşırı ölçüde belirlemek için kantitatif PCR ve / veya Western Blot gerçekleştirin. Etiketlemek için floresan etiketleri ile çift-ekspresyon vektörleri kullanmakviral enfekte hücreler sinyal ve olgun greftler bizim yapıları eksprese eden hücrelerin sayısı perdurance bildirmek için bir yol sağlar. Bu vektör lentiviral SMO shRNA ile kombinasyon halinde pSicoR-CMV-GFP 10 bir CMV promoter ile tahrik GFP kullanır. Şekil 3, biz GFP temsilcisi saç kökü dermal papilla olarak lentivirally-ifade edilir 3 haftalık dermal özgü greft göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Şekil 1. Saç folikülü büyüme histolojik analiz. (A) boş lentiviral vektör ve işlenmemiş keratinositler ile enfekte deri hücreleri ile kontrol saç rejenerasyon greft görüntüle. (B) dermal hücrelerde lentiviral shRNA kullanılarak düzeltilir knockdown saç köklerinin dökülmesi tedavisiz keratinositler sonuçları ile birlikte. (C) Hematoksilen ve eozin boyama anagen kıl f gösterirkontrol greftlerde ollicles dermis içine doğru uzanır ve (D) düzeltilir knockdown saç folikülleri bodur ve büyük ölçüde eksik kalır. Tüm görüntüler üç hafta greftleme sonrası vardır. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Şekil 2. Birincil hücreler Aşılama. Sütüre bölmeli gövde primer dermal hücrelerin ve keratinositlerin (A) nu / nu fare. (B) Odanın kaldırılmasını yeni donuk ve karakter opak olduğu cilt oluşur ortaya çıkarır. (C) greft Tam yetiştirilen tüyleri kullanarak yaban- aşılama sonrası üç hafta az ilköğretim dermal hücrelerin ve keratinositlerin yazın. (D) keratinositler primer dermal hücrelerin eklenmesi üç hafta sonra hiçbir saç yol açar. Benzer sonuçlar dermal hücrelerin primer keratinositlerin ilavesi ile görülür. Şekil 3,. 3 hafta eski rejenere greft dermal papilla dermal papilla GFP Bakım. Konfokal görüntüler. GFP lentiviral vektöründen dermal hücre popülasyonu ifade ve dermal papilla (yeşil) saptandı. Versican (kırmızı) dermal papilla ve çekirdekleri Hoechst (mavi) ile etiket vardı demarcates. Not GFP dermal hücrelerde değil fakat çevreleyen, keratinositler içerisinde spesifik olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu 20 mikron gösterir.

Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Epitel kaynaklı keratinositler ile alttaki mezenkim arasındaki etkileşimi gerektiren karmaşık bir süreç olan kıl folikülü morfojenezi, ...

Bu prosedürün genel amacı, kıl folikülü oluşumu için kritik olan sinyal yollarının dokuya özgü işlevlerini araştırmaktır. Bu işlem, öncelikle yeni doğmuş farelerden birincil dermal ve epidermal hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, birincil hücrelerin lentivirüs ile enfekte edilmesi yoluyla gen ekspresyonu değiştirilir.Üçüncü adım, epidermal ve dermal hücre popülasyonlarını, nude bir fare üzerindeki yara yatağına sabitlenmiş odacıklarda birleştirmektir. Ardından, greft tüy büyümesi açısından izlenir. Sonuç olarak, gen manipülasyonunun kıl folikülü oluşumu üzerindeki etkisi görsel olarak ve greft bölgesinin histolojik boyamasıyla değerlendirilebilir.Bu tekniğin fare nazal modeli gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, greft işleminin üç hafta içinde tamamlanabilmesidir. Bu yöntem, bir dokudaki faktörlerin başka bir dokudaki sinyalleme ve fonksiyonu nasıl etkileyebileceği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu yönteme dair ilk fikri, asfiksi ile ötanazi uygulanmış bir fareyi yıkadıktan sonra, kıl folikülü oluşumundaki hücre yapışma moleküllerinin dokuya özgü fonksiyonlarını incelemek istediğimizde geliştirdik.Steril bir makasla her bir uzvu ve kuyruğu gövdenin tabanından kesin. Ardından gövdeyi kavisli bir pens ile sıkıca kavrayın ve bir bistüri kullanarak baştan kuyruğa kadar dorsal deri boyunca bir insizyon yapın. Alttaki fasyayı delmeyin.Şimdi, farenin orta hattından derisini dikkatlice soyun. Açığa çıkan fareyi kavisli pensetin uzun tarafıyla sıkıca kavrayın ve farenin arka ucundaki derinin altına başka bir kavisli penset yerleştirin. Şimdi, tek bir pürüzsüz hareketle deriyi farenin üzerinden tamamen soyun ve gövdeyi atın.Deriyi, dermis tarafı aşağı gelecek şekilde ilk yıkama çözeltisi kabına yerleştirin. Deriyi çözelti içinde yayın ve pensetle hafifçe hareket ettirin. Ardından, bir sonraki deriyi disseke ederken deriyi yıkama çözeltisinde bekletin.Bir sonraki diseke edilmiş deriyi birinci yıkama çözeltisi kabına yerleştirdikten sonra, önceki deriyi ikinci yıkama çözeltisi kabına aktarın. Tüm deriler toplanana kadar derileri ikinci yıkama çözeltisinde bekletin. Son yıkamadan sonra, beş adede kadar deriyi soğuk disbe çözeltisi içeren bir kaba aktarın.Deriler dermo tarafı aşağı gelecek şekilde düzleştirin ve dört degrees Celsius'ta sekiz ila 16 saat boyunca yüzdürün. Soğuk kaplardan bir deriyi yeni bir kaba aktarın. Dermis tarafı aşağı gelecek şekilde düzleştirin.Epidermisi pensle kavrayın ve yavaşça dermisten ayırarak soyun. Epidermis tek parça halinde soyulmalıdır, beyaz ve ince olacaktır; dermis ise kahverengimsi, daha kalın ve jelatinimsi olmalıdır. Hücre izolasyonuna başlamak için iki dokuyu ayrı kültür kaplarına ayırın.Dermal hücreleri izole etmek için dermisi iki bistüri yardımıyla çok küçük parçalara ayırın. Parçalanmış dermal dokuyu, taze hazırlanmış kollajenaz çözeltisi ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; bu süre boyunca her 10 dakikada bir hücre karışımını nazikçe çalkalayın. Digesyon tamamlandığında işlemi sonlandırın.Süspansiyon çoğunlukla tek hücrelerden oluşmalı ve çözeltinin rengi berraktan bulanığa dönmüş olmalıdır. Şimdi, hücre süspansiyonuna %10 hacminde FBS ekleyin. Hücreleri 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik tüplere aktarın.Tüp başına 30 mililitreye kadar akış sıvısı toplayın. Yazılı protokole uygun olarak dermal hücre izolasyonuna devam edin. Keratinositleri izole etmek için her bir epidermisi altı ila sekiz küçük parçaya bölün.Dilimlenmiş dokuyu, yeni çözülmüş %0,05 tripsin EDTA ile 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Yazılı protokole uygun olarak keratinosit izolasyonuna devam edin; yedi ile 12 haftalık dişi nude fareyi ketamin ve ksilazin veya tercih edilen bir yöntem kullanarak anesteziye alın. Göz lubrikantı uyguladığınızdan ve fareyi ısıtma pedine yerleştirdiğinizden emin olun.Şimdi sırt derisini önce iyotla, ardından alkollü pamuklarla dezenfekte edin. Pens yardımıyla boyun tabanındaki deriyi sıkıştırın ve sıkıştırılan deride bir santimetre çapında bir delik açın. Kamerayı yara yatağına yerleştirin ve kameranın kenarlarını çevreleyen deriyle örtün.Odacığı, kenarları boyunca yaklaşık altı sütürle sabitleyin; fare başına yalnızca bir odacık takın. Odacık sabitlendikten sonra hücre süspansiyonunu kontrol edin. Eğer dipte çökmüşse, bir mililitrelik pipet ucuyla nazikçe yeniden süspande edin.Şimdi hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın ve bir mililitrelik şırıngaya takılı 23 gauge iğne ile çekin. İğne ile her bir bölmeyi delin ve PBS içinde süspanse edilmiş hücreleri yaranın üzerine yavaşça damlatın. Fareler anesteziden uyandığında, onları her kafeste iki fare olacak şekilde temiz otoklavlanmış kafeslere yerleştirin.Antibiyotiklerin ve Tylenol'ün içme suyu aracılığıyla verildiğinden emin olun. Yedi ila dokuz gün sonra, işlem görmüş nude fareyi daha önce yapıldığı gibi anestezi altına alın. Odacık çevresindeki cildi iyotla dezenfekte edin ve alkollü pamuklarla temizleyin.Dikişleri dikkatlice kesin ve bunları odacıkla birlikte çıkarın. Eğer yeni deri odacığa yapışmışsa, odacığı nazikçe ayırın. Grefti odacıktan yavaşça ayırın.Pens yardımıyla grefti aşağıya doğru bastırın. Odağın çıkarılması sırasında greft mat ve opak görünmelidir. Açık yaraya, üzerinde ince bir antibiyotik tabakası bulunan yapışmayan bir ped uygulayın ve iki dikiş kullanarak yerine dikin.Pedin sabitlenmesi ve yaranın korunması için farenin etrafına bir bandaj sarın. Bandajı dikişle sabitleyin. Üç gün sonra, bandajları ve pedi çıkarın. Bu adım sırasında fareye anestezi uygulanmasına gerek yoktur.Greft kuru ve opak ile kahverengi arasında bir renkte olmalıdır. Greftten 16 gün sonra görülmeye başlaması gereken kıl büyümesi açısından greft periyodik olarak kontrol edilmelidir. Kritik bir sonic hedgehog sinyalizasyon bileşeni olan smoothened geninin dermal spesifik nakavtı, izole dermal hücrelerde gerçekleştirilmiştir.Bu hücreler, belirtilen protokol kullanılarak saç yeniden yapılandırma greftlerine uygulandı. Üç haftalık büyümenin ardından, sadece lentiviral vektör içeren pozitif kontrol greftleri güçlü bir saç büyümesi gösterdi. Ancak, smoothened gen susturulması saç büyümesinde ciddi bir azalmaya yol açtı.Birincil dermal hücrelerin veya keratinositlerin eksik olduğu negatif kontrol greftleri, herhangi bir kıl oluşumu olmaksızın iyileşmiş bir yara bölgesiyle sonuçlanmıştır. Benzer şekilde, greftteki hücre tiplerinden birinin ölmesi veya kaybı da kıl büyümesiyle sonuçlanmamıştır. Lentivirüs vektörünün greft deneyinden önce iyi bir enfeksiyon verimliliğine sahip olduğu belirlenmiş olup, bu Smoothened, S-H-R-N-A ile birlikte GFP üretecek şekilde tasarlanmıştır.Kıl foliküllerinin dermal papillasının floresan optik altında görüntülenmesi, lentiviral ekspresyonun kalıcılığını doğrulamak için faydalı bir kontrol sağlamıştır. Üç hafta sonra, kontrol greftindeki kıl foliküllerinin büyüme evresini ve smoothened ekspresyonu susturulduğunda gelişimlerinin geciktiği evreyi betimlemek için H ve d boyaması kullanılır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde üç gün boyunca toplam 14 saatte tamamlanabilir. Bu teknik, kanser biyolojisi alanında kanser ilerlemesi sırasında tümör ve stroma arasındaki ilişkiyi incelemek için genişletilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, kıl folikülü oluşumunda gen fonksiyonunun nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Geleneksel genetik nakavt yöntemlerine alternatif olarak hızlı yeniden yapılandırma kıl analizimizi kullanın.

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Doğrudan bir yöntem, hücre tiplerinde çeşitli mezenkimal geçiş (EMT) epitel indüklenmesi için tarif edilmektedir. Immünositokimya EMT eyalette hücrelerin analiz yöntemleri dahildir.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

Biz burada mikroRNA-200 aile üyeleri ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) kombine ektopik ifadesine dayalı sarkom hücrelerinde mezenkimal-epitel geçişler (MET) uyarılması için bir hücre kültürü yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem kanser agresiflik ve tedavileri hakkında fenotipik esneklik biyolojik etkilerini daha iyi anlamak için uygundur.

Sarkoma Hücreler Mezenkimal-Epitel Geçişler endüklenmesi

Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Diş folikülleri epitel popülasyonu ve mezenkimal hücreler içerir. Epitel popülasyonu, farklı bir kültür ortamı sağlanarak heterojen diş folikül hücre popülasyonundan seçilmiştir. Epitel hücreleri hayatta kaldı ve serumsuz bir ortamda koloniler oluşturdu.

Epitel Hücrelerinin İnsan Diş Foliküllerinden İzolasyonu

Keşfedin saç folikülü oluşumunda hücreler arası sinyal yollarını hızlı greft tekniğiyle. Yenidoğan farelerden izole edilen hücrelerde gen manipülasyonu yaparak saç rejenerasyonunu inceleyin.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Daha fazla video keşfet