Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip
28 Eylül 2012
Burada, canlı zebra balığı embriyosundaki fotokonvertibl floresan proteinlerin (PCFP'ler) fotoaktif geçişi ve gelişim sırasında belirli zaman noktalarında fotokonvertif proteinin daha fazla izlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmasında farklı gelişimsel süreçlerin altında yatan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine izin verir.
Bu prosedürün genel amacı, canlı bir zebra balığı embriyosundaki foto anahtarlamalı hücreleri izlemektir. Bu, önce bir embriyonun gömülmesi, dokuya özgü bir fotoğrafın ifade edilmesi, düşük erime sıcaklığındaki arolarda dönüştürülebilir floresan proteinin ifade edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, ilgilenilen bölgedeki protein tamamen foto dönüştürülür.
Daha sonra embriyo dikkatlice arostan çıkarılır ve daha sonraki aşamalara kadar 28.5 santigrat derecede yumurta suyunda tutulur. Son olarak, foto dönüştürülmüş embriyo tekrar düşük erime sıcaklığındaki arolara gömülür. Sonuç olarak, fotofokal mikroskopi yoluyla foto dönüştürülmüş proteinin stabil varlığı nedeniyle foto dönüştürülmüş hücrelerin daha sonraki aşamalarda kesin olarak tespit edilebileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu yüzden bugün sunacağımız yöntemin hücre ve gelişim biyolojisi bağlamında oldukça faydalı olacağını düşünüyoruz. Bu nedenle, bu metodolojiyi hücre göçü, doku dinamikleri ve diğer hücre davranışları bağlamında kullanmanın oldukça faydalı olacağını düşünüyoruz. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir postdoc olan Veronica Lombardo olacak Transgenik zebra balığını geçtikten sonra, fotoğrafa dönüştürülebilir bir floresan proteini ifade ediyor.
Homozigot olan en parlak embriyoları seçin ve istenen aşamaya ulaştıklarında 28,5 santigrat derecede büyütün. Embriyoları uyuşturmak için yumurta suyu ile cam bir kapta kaplamak için forseps kullanın. Bunları teker teker trica'ya aktarmak için bir cam pipet veya kesilmiş bir pipet ucu kullanın.
Anestezi uygulanmış bir embriyoyu bir kültür kabının kapağına aktarın ve embriyoyu mümkün olan en küçük ortam hacminde tutun. Embriyoyu 30 santigrat derecede trica ile %1 düşük erime sıcaklığında agros ile pipetleyerek aros içine aktarın ve üstü kapalı cam tabanlı bir kültür kabına yerleştirin. Agros polimerize olduğunda embriyoyu yönlendirmek için pürüzsüz bir plastik uç kullanın.
405, 488 ve 561 nanometre lazer kaynakları ve 20 x objektif ile donatılmış ters konfokal bir mikroskopta Trica solüsyonu ile kaplayın. 488 ve 561 nanometre lazerleri, ilgilenilen bölgeyi de içeren numunenin tüm yapısının bir Z yığınını oluşturmak için kullanın. Zaman serisi aracını seçin ve biri öncesi ve diğeri fotoğraf sonrası dönüştürme için olmak üzere aralıksız iki döngü için ayarlayın.
Bölgenin aracını seçin ve fotoğraf dönüştürme için bir veya daha fazla ilgi alanı tanımlayın. Ardından, ağartma aracını seçin ve taramadan sonra ağartmayı başlat olarak ayarlayın. Burada kullanılan iki lazerden biri 30 miliwatt 405 nanometre diyot lazerdir.
Lazer ışığının yoğunluğunu, ilgilenilen bölgenin tarama yinelemelerini ve tarama hızını değiştirerek elde edilen tam fotoğraf dönüştürme için gerekli olan minimum lazer ışığı miktarı için dikkatlice optimize edilmiştir. Numuneyi 488 nanometre ve 561 nanometre lazerlerle tarayın ve kalan yeşili ve foto dönüştürülebilir floresan proteinin fotoğrafa dönüştürülmüş kırmızı floresansını görselleştirmek için tarayın. Fotoğraf dönüşümünden sonra, çözeltiyi atın ve bir iğne veya pürüzsüz plastik uç kullanarak embriyoyu agrostan dikkatlice çıkarın.
İstenilen gelişim aşamasına kadar embriyoyu karanlıkta 28,5 santigrat derecede yumurta suyunda tutun. Embriyoyu ikinci kez gömün, ardından tekrar 488 ve 561 nanometre lazerleri kullanarak, ilgilenilen bölge de dahil olmak üzere numunenin bir Zack'ini oluşturun. Bu protokol normal gelişimi etkilemediği için foto dönüşümlü embriyonun daha sonraki aşamalarda gözlemlenmesi mümkündür.
İşte bir fotoğraf dönüştürme testi örneği. Endotel hücreleri, zebra balığı gelişimi sırasında, döllenmeden 48 ila 72 saat sonra, burada gösterildiği gibi, endotel çekirdeği içinde tekme G'yi ifade eden bir transgenik raportör hattı kullanılarak izlendi, foto dönüşüm tekmesi G, endotel dokusu içinde eksprese edildi ve sadece kırmızı floresan için 561 nanometre lazerle 488 nanometre argon lazer kontrol taramaları kullanılarak yeşil floresan olarak tespit edilebilirdi. Fotoğraf dönüştürmeden önce herhangi bir fotoğrafa dönüştürülen kick GR tespit etmedi.
Daha sonra, ilgilenilen bölge% 10 yoğunlukta, 20 iterasyonda 405 nanometre diyot lazer kullanılarak tamamen foto dönüştürüldü ve kafa damarları 488 nanometre ve 561 nanometre lazerler kullanılarak tekrar tarandı. Bu panelde, yeşil tekme G, daha sonraki aşamalarda fotoya dönüştürülmüş endotel hücrelerini izlemek için ilgilenilen bölgede tamamen kırmızıya dönmüştü. Embriyo, foto dönüşümünden 24 saat sonra, yani döllenmeden yaklaşık 72 saat sonra, foto dönüştürülmüş ilgilenilen bölgeden kaynaklanan endotel dokuları içinde gözlendi.
Kırmızı floresan foto dönüştürülmüş kick g'nin stabilitesi ve geliştirilmesinden sonra yeni yeşil dönüştürülmemiş kick G'nin sentezi nedeniyle hem olmayan hem de foto dönüştürülmüş kick G proteinleri gözlendi. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların çeşitli balıklarda hücre biyolojisini ve doku yeniden şekillenmesini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fotokonvertebilir floresan proteinler kullanılarak yaşayan zebra balığı embriyolarında foto değiştirilmiş hücrelerin izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, konfokal mikroskop kullanılarak gelişim sırasındaki hücresel biyolojik olayların izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Fotokonvertebilir floresan proteinler (PCFP'ler) belirli hücrelerin görselleştirilmesini sağlar.
- Canlı organizmalarda hücresel olayların izlenmesi, gelişimi anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Zebra balığı embriyoları, omurgalı gelişimini incelemek için model bir organizmadır.
- Konfokal mikroskop, biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığı embriyolarında foto değiştirilmiş hücrelerin izlenmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Gelişim sırasında fotokonverte edilmiş proteinlerin stabilitesini izlemek.
- Canlı omurgalılardaki gelişimsel süreçler hakkındaki anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Zebra balığı embriyolarının düşük erime sıcaklıklı agaroza gömülmes.
- Dokuya özgü fotokonvertebilir floresan proteinlerin ifade edilmesi.
- İlgili bölgede proteinlerin foto değiştirilmesi.
- Embriyolar gelişim için 28.5 derece Celsius'ta yumurta suyunda muhafaza edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Foto değiştirilmiş hücreler gelişimin sonraki aşamalarında tespit edilebilir.
- Fotokonverte edilmiş proteinlerin stabil varlığı hassas izlemeyi sağlar.
- Konfokal mikroskop, foto değiştirilmiş hücreleri etkili bir şekilde görselleştirir.
- Yöntem, çeşitli gelişimsel çalışmalara uygulanabilir.
Sonuçlar
- Sunulan yöntem, canlı zebra balığı embriyolarında hücresel olayları izlemek için etkilidir.
- Gelişimsel süreçler ve hücre biyolojisi hakkında bilgiler sağlar.
- Bu yaklaşım, gelecekteki omurgalı gelişimi çalışmalarında kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cell tracking using photoconvertible proteins enables precise monitoring of cellular dynamics in vivo, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, reproducible data on cell fate and tissue remodeling, enhancing predictive confidence in preclinical models. The method’s applicability to zebrafish—a disease-relevant system—facilitates translational biomarker alignment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking specific cell populations during morphogenesis.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of protein fate changes in intact organisms.
- Predictive Value: Generates stable, quantifiable readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, fluorescent outputs compatible with confocal imaging for high-content screening.
- Reproducibility: Ensures consistent photoconversion efficiency via controlled laser parameters and embedding protocols.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated microscopy for longitudinal studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Tracks endothelial and other cell types in zebrafish models of vascular and developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring cellular events across developmental stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go criteria for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven cell tracking, supporting assay development for phenotypic screening, and informing translational research through longitudinal fate mapping.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target validation by isolating cellular contributions to morphogenetic processes.
- Screening: Generates quantitative fluorescence readouts for compound effect assessment in live embryos.
- Analytics: Delivers stable red/green signal ratios for objective comparison of photoconversion efficiency and protein turnover.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking cellular dynamics to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for tracking multiple cell types across diverse zebrafish transgenic lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in cellular mechanism and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embedding, photoconversion, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets via direct cell fate observation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, mechanism-linked cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic line maintenance, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to UV/blue laser sources (405 nm) and compatible photoconvertible protein expression systems.
- Necessitates standardization of laser intensity, scan speed, and iteration counts for reproducible photoconversion.
- Requires optimization across tissue types and developmental stages to avoid phototoxicity and ensure signal stability.
- Limited by the need for genetic accessibility and embryonic viability during prolonged imaging sessions.
