Name: Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, zebra balığı embriyolarında fotokonvertibl proteinlerle hücre takibi yapmayı. Bu yöntem, konfokal mikroskopi ile gelişim sürecindeki hücre olaylarını canlı olarak izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Zebrafish transgenik Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 hattını nezaketle sağladığı için Toronto, Kanada'daki Hospital for Sick Children'dan Dr. Ian C. Scott'a teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım ve genel görüntüleme desteği için Konfokal ve 2-Foton Mikroskopi Çekirdek Tesisi'ne (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) ve Dr. Zoltan Cseresnyes'e teşekkür ederiz. S.A.-S., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Heisenberg bursu ile desteklenmektedir. Bu çalışma DFG SE2016/7-1 hibesi tarafından desteklenmiştir.

1. Fotokonversiyon Analizi için Embriyoların Elde Edilmesi
PCFP eksprese eden transgenik zebra balıklarının kendi aralarında çaprazlanmasının ardından, homozigot embriyolar olan en parlak olanlar seçilir ve istenen embriyonik evreye15 kadar 28.5 °C'de büyütülür.
Not 1: Bu ön seçim, embriyoların düşük lazer gücüyle taranmasına olanak tanıyarak fototoksisite ve fotobeyazlamayı önleyecektir.
Not 2: Kaede ve KikGR gibi PCFP'lerin gün ışığı da dahil olmak üzere ışık maruziyetine karşı yüksek hassasiyeti nedeniyle, embriyoları görselleştirirken düşük yoğunluklu ışık kullanmanızı ve embriyoları karanlık koşullarda tutmanızı öneririz.
2. Gömme
<ol>
	<li>Yumurta-su içeren cam bir kapta, embriyoları stereomikroskop altında pens kullanarak dekoryonize edin.</li>
	<li>Dekoryonize edilmiş bir embriyoyu 0,16 mg/ml Trikain (3-amino benzoik asit etil ester, Sigma-Aldrich) çözeltisine (1 ml 1X E3 ortamında 4 mg/ml stok çözeltiden 40μl) aktararak embriyoları anesteziye alın.</li>
</ol>
Not 1: Embriyolara zarar verme riskini en aza indirmek için embriyoları cam bir pipet veya ucu kesilmiş bir (P1000) pipet ile aktarın.
Not 2: Genç dekoryone embriyolar havaya maruz bırakılmamalı veya su/hava arayüzüne kadar kaldırılmamalıdır, çünkü yumurtalar mekanik strese maruz kaldıklarında kolayca yırtılırlar.
<ol start="3">
	<li>Anestezize edilmiş embriyoyu bir kültür kabının kapağına aktarın ve embriyoyu mümkün olan en küçük besiyeri hacmi içinde tutun.</li>
	<li>Embriyoyu, %1 düşük erime sıcaklıklı agaroz (LMA, Lonza) ile pipetleyerek agarozun içine aktarın; 30 °C 0,16 mg/ml Trikain içeren çözeltiyi, lamel tabanlı bir kültür kabının (MatTek Corp. Ashland MA USA) lameli üzerine yerleştirin. Ardından, düz bir plastik uç yardımıyla embriyoyu yönlendirin (örneğin kesilmiş bir Microloader Pipet Ucu (Eppendorf) ve LMA polimerize olduğunda, agarozu 0,16 mg/ml'lik Trikain çözeltisi ile kaplayın.</li>
</ol>
Not 1: %1 LMA'yı 60 °C'de eritin ve eritilmiş agarozu 30 °C'de muhafaza edin.
3. Fotokonversiyon
<ol>
	<li>Zeiss LSM 710 gibi 405 nm, 488 nm ve 561 nm lazer kaynaklarıyla donatılmış bir ters konfokal mikroskopta, fotokonvert edilecek ve daha sonra takip edilecek örneğin tüm yapısını kapsayan bir z-Stack taraması ile; fotokonvert edilebilir proteinlerin sırasıyla yeşil ve kırmızı floresanslarını taramak için 488 nm lazeri (yani, %5-7 yoğunlukta 30 mW Ar lazeri, dedektör 493-540 nm'ye ayarlanmış) ve 561 nm lazeri (yani, %7-9 yoğunlukta 10 mW DPSS 561 lazeri, dedektör 587-651'e ayarlanmış) kullanarak örneği görselleştirin.</li>
</ol>
Not 1: Fotokonversiyon öncesi tarama için Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objektif kullandık.
Not 2: Yanlışlıkla oluşmuş kırmızıya dönüştürülmüş PCFP'nin mevcut olmadığını dışlamak için deneyden önce her zaman kırmızı floresans taraması yapın.
<ol start="2">
	<li>Time series (Zaman serisi) aracını seçin ve aralık olmadan 2 döngü için ayarlayın (biri fotokonversiyon öncesi, biri fotokonversiyon sonrası için).</li>
	<li>Regions (Bölgeler) aracını seçin ve fotokonversiyon için bir veya daha fazla ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın.</li>
</ol>
Not 1: Hücre veya protein hareketinin beklenmediği sabit bir örneklemde, ROI'de tarama lazeri tarafından gerçekte fotokonverte edilen bölgenin, yazılımda seçilen ROI ile ne kadar hassasiyetle eşleştiğini her üç yönde (xy ve z yönü) fotokonverte edilen doku/hücre alanını ölçerek önceden belirlemenizi öneririz. Bu uygulamada açıklanan ayarlar için ROI, fotokonverte edilen bölgeyle yüksek hassasiyetle eşleşmiştir; ancak bu durum kullanılan objektife ve fotokonversiyon için uygulanan lazer miktarına bağlıdır. ROI boyutu, objektifin sayısal açıklığına, zoom faktörüne ve fotokonversiyon için kullanılan lazer ışığı miktarına bağlı olarak tek bir hücre boyutuna kadar indirilebilir.
<ol start="4">
	<li>Bleaching aracını seçin ve ağartmanın 2 taramadan 1. tarama sonrası başlamasını ayarlayın. Fotokonversiyon için 30 mW 405 nm diyot lazer kullandık ve tam fotokonversiyon için gerekli olan minimum lazer ışığı miktarını, çoğunlukla lazer ışığının yoğunluğunu, ROI tarama yinelemelerini ve piksel süresini (yani tarama hızını) değiştirerek dikkatlice optimize ettik.</li>
</ol>
Not 1: Fotokonversiyon için Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objektif kullandık.
Not 2: Lazer gücü ve iterasyon sayısı her deneysel kurulum için ampirik olarak belirlenmeli ve fototoksisiteyi azaltmak için gerekli minimum lazer ışığı miktarıyla ROI içinde yeşilden kırmızı PCFP'ye tam fotokonversiyonu sağlamalıdır. Testlere düşük lazer gücüyle (örneğin objektif planında 0.03 mW'ye karşılık gelen % 3) ve düşük iterasyon sayılarıyla (örneğin 20) başlamayı ve ardından tam fotokonversiyon sağlanana kadar lazer gücünü artırmayı öneririz; bizim çalışmalarımızda bu değer % 10 lazer gücüydü (objektif planında 0.1 mW'ye karşılık gelmektedir). Bu koşullar altında, test edilen tüm embriyolar tedavi planından sağ çıkmıştır. Bununla birlikte, vitellus membranının lazer darbelerine karşı hassas olduğunu ve kolayca hasar görerek embriyonun ölümüne yol açabileceğini gözlemledik. Bu nedenle, hedef dokunun konumu vitellus gövdesine yakınsa, fotokonversiyon sonrası embriyo letalitesi meydana gelebilir.
<ol start="5">
	<li>Kalan yeşil ve PCFP'nin fotokonverte kırmızı floresansını görüntülemek için örneği 488 nm ve 561 nm lazerler kullanarak z-Yığını (z-Stack) şeklinde tarayın.</li>
</ol>
Not 1: Fotokonversiyon sonrası tarama için Plan Apochromat 20x/NA 0.8 kullandık.
4. Embriyonun Agarozdan Çıkarılması
<ol>
	<li>Çözeltiyi boşaltın ve embriyoyu bir iğne veya pürüzsüz bir plastik uç yardımıyla %1 LMA'dan dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Embriyoyu, istenen gelişim aşamasına gelene kadar karanlıkta, 28.5 °C'de yumurta suyunda bekletin.</li>
</ol>
Not 1: Embriyoların, özellikle embriyonik gövdenin uzadığı gelişimin ilk günlerinde, yumurta suyunda gelişmeye devam etmeleri önemlidir. Nitekim, bazı embriyonik dokular/organlar gelişim sırasında konum değiştirirler ve bu nedenle, ilgilenilen spesifik dokuya/organa ve analiz edilmek istenen gelişim evresine bağlı olarak, gömme işlemi sırasında belirli yönlendirmeler gerektirirler.
5. Yeniden Gömme
<ol>
	<li>Bu protokolün 2.) maddesindeki adımları uygulayın.</li>
</ol>
6. Sonraki Embriyonik Evrelerde Fotokonverte Olmuş Dokuların Takip Edilmesi
<ol>
	<li>Sırasıyla yeşil ve kırmızı floresan sinyalleri için 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak ilgi bölgesinin taranması (z-Yığını).</li>
</ol>
Not 1: Fotokonversiyondan x saat sonra yapılan tarama için Plan Apochromat 20x/NA 0.8 kullandık.
Not 2: Bu protokol embriyonun normal gelişimini etkilemediği için, fotokonverte edilmiş embriyonun gelişimin daha sonraki evrelerinde gözlemlenmesi mümkündür (bunun için 4 - 6. maddelerde belirtilen adımları izleyin).
7. Temsili Sonuçlar
Bir fotokonversiyon deneyi örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Zebrafish gelişimi sırasında endotel hücrelerini takip ettik (gelişmekte olan zebrafish vasküler anatomisinin incelemesi için bkz.16). Buna uygun olarak, endotel çekirdekleri içinde KikGR eksprese eden bir zebrafish Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 reporter hattı kullandık17. Homozigot ve güçlü ekspresyon gösteren embriyolar, döllenmeden sonraki 48. saate (hpf) kadar 28.5 °C'de büyütüldü. Dekorionasyonun ardından, embriyolar anestezi altına alındı ve kafa damarlarının daha iyi görselleştirilmesi için embriyonun anterior-dorsal tarafı lam üzerine gelecek şekilde LMA'ya gömüldü. Fotokonversiyon deneyi ve fotokonvert edilmiş proteinin daha sonraki takibi için 405 nm, 488 nm ve 561 nm'de çalışan lazerlerle donatılmış ters konfokal mikroskop (Zeiss LSM 710 Meta) ve Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objektif kullandık. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, fotokonversiyon öncesinde KikGR endotel dokusu içinde eksprese edilmişti ve 488 nm Argon lazer kullanılarak yalnızca yeşil floresan olarak tespit edilebiliyordu. Kırmızı floresan için 561 nm DPSS 561-10 lazer ile yapılan kontrol taramaları, fotokonversiyondan önce herhangi bir fotokonvert edilmiş KikGR tespit etmedi (Şekil 1A). Ardından, ROI 405 nm Diyot lazer kullanılarak ( %10 yoğunlukta, 20 iterasyon) tamamen fotokonvert edildi ve kafa damarları 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak tekrar tarandı (Şekil 1B). Şekil 1B'de görüldüğü gibi, yeşil KikGR, ROI içerisinde tamamen kırmızıya dönüştü. Fotokonversiyon deneyinden sonra embriyo agarozdan çıkarıldı ve yumurta suyunda 28.5 °C'de büyütüldü. Son olarak, fotokonvert edilmiş endotel hücrelerini daha geç aşamalarda takip etmek için embriyo, fotokonversiyondan 24 saat sonra, yaklaşık 72 hpf'de tekrar gözlemlendi (Şekil 1C). Böylece embriyo LMA'ya gömüldü ve örnek 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak yeniden tarandı. Şekil 1C'de gösterildiği üzere, fotokonvert edilmiş ROI'den köken alan endotel dokusu içinde, kırmızı floresan fotokonvert edilmiş KikGR'nin stabilitesi ve yeni yeşil fotokonvert edilmemiş KikGR'nin yeniden sentezlenmesi nedeniyle hem konvert edilmemiş hem de fotokonvert edilmiş KikGR proteinleri gözlemlendi.
<img alt="Zebrafish'teki fotokonversiyon süreci; mikroskopi görüntülerinde zamanla meydana gelen floresan protein değişimi." src="/files/ftp_upload/4350/4350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. Zebrafish gelişimi sırasında KikGR'nin fotokonversiyonu. (A,B) Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 transgenik embriyolarda, endotelyal kafa vaskülatürünün spesifik bir bölgesi 48 hpf'de fotokonversiyona uğratılmış ve (C) fotokonversiyondan 24 saat sonra (yaklaşık 72 hpf) tekrar gözlemlenmiştir. KikGR floresansı (yeşil), fotokonversiyona uğramış KikGR (kırmızı) ve birleştirilmiş kanallar gösterilmektedir. Noktalı daireler, fotokonversiyon öncesini, sonrasını ve fotokonversiyondan 24 saat sonrasını içeren ROI'yi göstermektedir. Görüntüler, ön tarafı alta gelecek şekilde zebrafish embriyosunun dorsal görünümleridir. Ölçek çubukları: 50 μm.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Protein (Kısaltma)</td >
			<td >Ex (nm)</td >
			<td >Em (nm)</td >
			<td >Sönümleme Katsayısı (EC)</td >
			<td >Kuantum Verimi (QY)</td >
			<td >Kuvaterner Yapı</td >
			<td >Parlaklık</td >
			<td >Uygulama</td >
			<td >Ref</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Kaede_G</td >
			<td >508</td >
			<td >518</td >
			<td >99</td >
			<td >0.9</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >259</td >
			<td rowspan="2">Hücre takibi</td >
			<td rowspan="2">2,6</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kaede_R</td >
			<td >572</td >
			<td >580</td >
			<td >60</td >
			<td >0.3</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >59</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >KikGR_G</td >
			<td >507</td >
			<td >517</td >
			<td >54</td >
			<td >0.7</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >112</td >
			<td rowspan="2">Hücre takibi</td >
			<td rowspan="2">3,6,8-10 </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KikGR_R</td >
			<td >583</td >
			<td >593</td >
			<td >35</td >
			<td >0.6</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >68</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >mKikGR_G</td >
			<td >505</td >
			<td >515</td >
			<td >49</td >
			<td >0.7</td >
			<td >monomer</td >
			<td >101</td >
			<td rowspan="2">Dinamik takip Süper çözünürlüklü görüntüler</td >
			<td rowspan="2">13</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >mKikGR_R</td >
			<td >580</td >
			<td >591</td >
			<td >28</td >
			<td >0.6</td >
			<td >monomer</td >
			<td >53</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >EosFP_G</td >
			<td >506</td >
			<td >516</td >
			<td >72</td >
			<td >0.7</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >150</td >
			<td rowspan="2">Hücre takibi</td >
			<td rowspan="2">5,20</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >EosFP_R</td >
			<td >571</td >
			<td >581</td >
			<td >41</td >
			<td >0.5</td >
			<td >tetramer</td >
			<td >67</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >tdEos_G</td >
			<td >506</td >
			<td >516</td >
			<td >34</td >
			<td >0.7</td >
			<td >tandem dimer</td >
			<td >165</td >
			<td rowspan="2">Süper çözünürlüklü görüntüler</td >
			<td rowspan="2">12,14,21</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >tdEos_R</td >
			<td >569</td >
			<td >581</td >
			<td >33</td >
			<td >0.6</td >
			<td >tandem dimer</td >
			<td >59</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >mEos2_G</td >
			<td >506</td >
			<td >519</td >
			<td >56</td >
			<td >0.7</td >
			<td >monomer</td >
			<td >140</td >
			<td rowspan="2">Dinamik takip Süper çözünürlüklü görüntüler</td >
			<td rowspan="2">11,18</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >mEos2_R</td >
			<td >573</td >
			<td >584</td >
			<td >46</td >
			<td >0.7</td >
			<td >monomer</td >
			<td >90</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Dendra2_G</td >
			<td >490</td >
			<td >507</td >
			<td >45</td >
			<td >0.5</td >
			<td >monomer</td >
			<td >67</td >
			<td rowspan="2">Dinamik takip Süper çözünürlüklü görüntüler</td >
			<td rowspan="2">4,11</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dendra2_R</td >
			<td >553</td >
			<td >573</td >
			<td >35</td >
			<td >0.55</td >
			<td >monomer</td >
			<td >57</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tablo I. Fotokonvertlanabilir floresan proteinlerin özellikleri. Her bir PCFP için yaygın ad ve/veya akronimin yanı sıra, pik eksitasyon (Ex) ve emisyon (Em) dalga boyları, molar ekstinksiyon katsayıları (EC, 10-3 M-1 cm-1 ), kuantum verimi (QY), fizyolojik olarak ilgili kuaterner yapı, bağıl parlaklık (EGFP'nin %'si olarak), uygulama ve referanslar tabloda gösterilmiştir. Tablo Day ve Davidson, 2010'dan uyarlanmıştır1.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >PCFP</td>
			<td >Zebrafish transgenik hatları</td>
			<td >Kaynak</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="10">Kaede</td>
			<td >Tg(elavl3:Kaede)rw0130a</td>
			<td >Okamoto Lab</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(ins:Kaede)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(lhx5:Kaede)b1204/+</td>
			<td >ZIRC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(myl7:kaede)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(olig2:Kaede)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t</td>
			<td >ZIRC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS:Kaede)rk8</td>
			<td >ZIRC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(vsx2:Kaede)nns2</td>
			<td >Higashijima Lab</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">KikGR</td>
			<td >Tg(kdrl:nlsKikGR)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(krt4:NTR-KikGR)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(myl7:nlsKikGR)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(sox10:KikGR)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS:KikGR)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">EosFP</td>
			<td >Tg(sox10:EosFP)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(sox10:nlsEosFP)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">Dendra</td>
			<td >Tg(-8mpx:Dendra2)</td>
			<td > </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS:Dendra-kras)</td>
			<td > </td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tablo II. PCFP eksprese eden Zebrafish transgenik hatları. Veriler Zebrafish Model Organizm Veritabanı'ndan (ZFIN, <a href="http://zfin.org/" target="_blank">http://zfin.org/</a>) alınmıştır. Hatların Zebrafish Uluslararası Kaynak Merkezi'ndeki (ZIRC, <a href="http://zebrafish.org/zirc/" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/</a>) mevcudiyeti belirtilmiştir.

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-rational+engineering+of+a+coral+fluorescent+protein+into+an+efficient+highlighter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter.</a> EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).</li>
<li>Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+invasion+is+a+spatially-ordered+progression+into+the+head+with+higher+cell+proliferation+at+the+migratory+front+as+revealed+by+the+photoactivatable+protein%2C+KikGR%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR.</a> Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).</li>
<li>Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+iUBC-KikGR+photoconvertible+transgenic+mice+for+live+time-lapse+imaging+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development.</a> Genesis. 49, 591-598 (2011).</li>
<li>Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green-to-red+photoconvertible+fluorescent+proteins%3A+tracking+cell+and+protein+dynamics+on+standard+wide-field+mercury+arc-based+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes.</a> BMC Cell Biol. 11, 15(2010).</li>
<li>Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+protein%2C+supervillin%2C+accelerates+F-actin-dependent+rapid+integrin+recycling+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility.</a> Traffic. 11, 782-799 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).</li>
<li>Lazic, S., Scott, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2cb+regulates+late+myocardial+cell+addition+from+a+second+heart+field-like+population+of+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish.</a> Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of zebrafish development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).</li>
<li>Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Foxd3+and+Mitf+regulates+cell+fate+plasticity+in+the+zebrafish+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest.</a> Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).</li>
<li>Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconvertible+fluorescent+protein+EosFP%3A+biophysical+properties+and+cell+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications.</a> Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Son yıllarda, Kaede veya KikGR gibi fotokonvertibl proteinlerin ekspresyonu için transgenik hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bu hayvanlar normal şekilde gelişmektedir, bu da söz konusu proteinlerin embriyonik gelişim üzerinde toksik etkilerinin olmadığını göstermektedir. Hayvan embriyolarında hücre takibi için bir fotokonversiyon deneyiyle ilgili ilk rapor Hatta ve çalışma arkadaşları tarafından; yaygın ekspresyon için tek hücreli zebrafish embriyolarına Kaede'yi kodlayan mRNA veya DNA enjeksiyonuyla veya Gal4-UAS siste...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materyaller:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Balık yetiştirmek ve yumurta toplamak için gerekli ekipmanlar (ayrıntılar için Zebrafish Book22'ye bakınız).</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>Lecia MZ6 Stereomikroskop</td><td>488 nm'de çalışan lazer ile donatılmış</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td>488 nm, 561 nm ve 405 nm'de çalışan lazerler ile donatılmış</td></tr><tr><td>Isıtma bloğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bir çift Dumont #5 pens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lam camı tabanlı kültür kabı</td><td>MatTek Corp</td><td></td><td>Ashland MA USA</td></tr><tr><td>Microloader Pipet Uçları</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İğneler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reaktifler:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Yumurta suyu besiyeri&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O içinde 60 &amp;mu;g/ml Instant Ocean Deniz Tuzları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;E3 besiyeri &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.17 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.00001% (w/v) Metilen Mavisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;4 mg/ml Tricaine stok çözeltisi &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>400 mg Tricaine (3-amino benzoik asit etil ester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>97.9 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 ml 1M Tris (pH9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 7'ye ayarlayın, alikvotlayın ve -20 &amp;deg;C'de saklayın</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%1 LMA (Düşük erime sıcaklıklı agaroz, Lonza)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>1g LMA/100 ml 1X E3 besiyeri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alikvotlayın ve 4 &amp;deg;C'de saklayın</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı geliştirme sırasında photoconvertible proteinler kullanma cep takip

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embriyogenez, gelişimsel değişikliklerin in vivo belgelenmesine olanak tanıyan teknikler kullanılarak en iyi şekilde incelenebilen dinamik bir süreçtir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin kullanımı, dinamik morfogenetik süreçlerin sağlam organizmada gerçekleştiği haliyle aydınlatılması için değerli bir strateji olduğunu kanıtlamıştır. Geçtiğimiz on yıl boyunca, fotoaktive edilebilir ve fotokonvertible floresan proteinlerin geliştirilmesi, işaretlenmiş proteinlerin belirli alt popülasyonlarının kaderini araştırma imkanı sunmuştur1. Fotoaktive edilebilir proteinlerin aksine, fotokonvertible floresan proteinler (PCFPs), fotokonversiyon öncesinde doğal emisyon durumundayken kolayca takip edilebilmekte ve görüntülenmekte, bu da bölgelerin optik inceleme yoluyla tanımlanmasını ve seçilmesini kolaylaştırmaktadır. Kaede2, KikGR3, Dendra4 ve EosFP5 gibi PCFP'ler, ışık katalizli bir β-eliminasyon ve ardından gelen bir π-konjuge sistemin genişlemesi yoluyla kırmızıya fotokonvert edilebilen yeşil bir kromofor oluşturan His-Tyr-Gly tripeptit dizisi nedeniyle, UV veya mavi ışığa maruz kaldıklarında yeşilden kırmızıya kayabilirler3. PCFP'ler ve bunların monomerik varyantları, sırasıyla hücrelerin takibi6-10 ve protein dinamiklerinin incelenmesi11-14 için yararlı araçlardır. Son yıllarda PCFP'ler, hücre kaderi takibi için zebra balığı6, tavuk7,8 ve fare9,10 gibi farklı hayvan modellerinde eksprese edilmiştir. Burada, canlı zebra balığı embriyosunda PCFP'lerin hücreye özgü fotokonversiyonu ve fotokonvert edilen proteinlerin daha sonraki gelişim aşamalarında takibi için bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, zebra balığı hayvan modelinde morfogenezin temelini oluşturan hücre biyolojik olayların dokuya özgü bir şekilde incelenmesine olanak tanır.

Burada, canlı zebra balığı embriyosunda fotokonverte edilebilir floresan proteinlerin (PCFPs) fotoaktive anahtarlaması ve fotokonverte edilmiş proteinin gelişim sırasındaki belirli zaman noktalarında takibi için bir yöntem sunmaktayız. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmadaki farklı gelişimsel süreçlerin temelini oluşturan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine olanak tanır.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embriyogenez, gelişimsel değişikliklerin in vivo olarak belgelenmesine olanak tanıyan tekniklerin kullanılmasıyla en iyi şekilde incelenebilen dinamik bir süreçtir. ... kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir zebra balığı embriyosunda foto-anahtarlamalı hücreleri takip etmektir. Bu işlem, öncelikle bir embriyonun düşük erime sıcaklıklı agar içine gömülmesi ve dokuya özgü bir foto-konvertibl floresan proteinin eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, ilgi bölgesindeki protein tamamen foto-konverte edilir.Ardından embriyo dikkatlice agarozdan çıkarılır ve sonraki aşamalara kadar 28,5 °C sıcaklıktaki yumurta suyunda muhafaza edilir. Son olarak, fotokonvert edilmiş embriyo tekrar düşük erime sıcaklıklı agaroza gömülür. Nihayetinde, konfokal mikroskopi aracılığıyla, fotokonvert edilmiş proteinin stabil varlığı sayesinde fotokonvert edilmiş hücrelerin sonraki aşamalarda kesin olarak tespit edilebildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bugün sunacağımız yöntemin hücre ve gelişim biyolojisi bağlamında oldukça faydalı olacağını düşünüyoruz. Bu metodolojinin hücre göçü, doku dinamikleri ve diğer hücre davranışları bağlamında kullanılmasının oldukça yararlı olacağı kanısındayız. Prosedürü, foto-konvertibıl floresan protein ekspres eden transgenik zebra balıklarını çaprazladıktan sonra laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Veronica Lombardo uygulamalı olarak gösterecektir.Homozigot olan en parlak embriyoları seçin ve istedikleri evreye ulaştıklarında 28,5 °C'de büyütün. Embriyoları anesteziye almak için yumurta suyu içeren cam bir kap içerisinde pens yardımıyla koroiyon zarlarını soyun. Embriyoları teker teker trica içerisine aktarmak için cam bir pipet veya kesilmiş bir pipet ucu kullanın.Anestezize edilmiş embriyoyu bir kültür kabının kapağına aktarın ve embriyoyu mümkün olan en küçük besiyeri hacmi içinde tutun. Embriyoyu, 30 °C'de %1 düşük erime sıcaklıklı, trica içeren agros ile pipetleyerek agros içine aktarın ve lam tabanlı bir kültür kabına yerleştirin. Agros polimerize olduğunda embriyoyu yönlendirmek için düz bir plastik uç kullanın.405, 488 ve 561 nanometre lazer kaynakları ile 20 x objektife sahip ters konfokal mikroskop altında Trica çözeltisi ile örtün. İlgi bölgesini de içeren numunenin tüm yapısının Z yığınına (Z stack) sahip olmak için 488 ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Zaman serisi aracını seçin ve foto konversiyon öncesi ve sonrası için birer adet olmak üzere, ara süre bırakmadan iki döngü şeklinde ayarlayın.Bölge aracını seçin ve foto dönüştürme için bir veya daha fazla ilgi alanı belirleyin. Ardından, ağartma aracını seçin ve taramadan sonra ağartmayı başlat seçeneğini ayarlayın. Burada kullanılan iki lazerden biri 30 milliwatt 405 nanometre diyot lazerdir.Lazer ışığının şiddeti, ilgilenilen bölgenin tarama tekrarları ve tarama hızı değiştirilerek, tam fotokonversiyon için gerekli olan minimum lazer ışığı miktarı için dikkatlice optimize edilir. Foto-konvertibl floresan proteinin kalan yeşil ve fotokonvertiyona uğramış kırmızı floresansını görselleştirmek için örneği 488 nanometre ve 561 nanometre lazerlerle tarayın. Fotokonversiyon işleminden sonra çözeltiyi boşaltın ve bir iğne veya pürüzsüz plastik uç kullanarak embriyoyu agarozdan dikkatlice çıkarın.Embriyoyu, istenen gelişim aşamasına gelene kadar karanlıkta, 28,5 °C sıcaklıktaki yumurta suyunda tutun. Embriyoyu ikinci kez gömün, ardından 488 ve 561 nanometre lazerlerini kullanarak ilgi bölgesini de içerecek şekilde örneğin bir Z-yığını (Zack) oluşturun. Bu protokol normal gelişimi etkilemediği için, fotokonverte edilmiş embriyoyu daha sonraki aşamalarda gözlemlemek mümkündür.İşte bir fotokonversiyon analiz örneği. Endotel hücreleri, burada gösterildiği gibi endotel çekirdeklerinde kick G eksprese eden transgenik bir raporlayıcı hat kullanılarak, döllenmeden sonraki 48 ile 72 saat arasındaki zebrafish gelişimi sırasında takip edilmiştir. Fotokonversiyondan önce kick G, endotel doku içinde eksprese edilmişti ve 488 nanometrelik bir argon lazeri kullanılarak yalnızca yeşil floresan olarak tespit edilebiliyordu; kırmızı floresan için 561 nanometrelik lazerle yapılan kontrol taramalarında, fotokonversiyon öncesinde herhangi bir fotokonverte kick GR tespit edilmemiştir.Ardından, ilgi alanı 405 nanometre diyot lazer kullanılarak %10 yoğunlukta ve 20 yinelemeyle tamamen fotokonvert edildi ve kafa damarları 488 nanometre ve 561 nanometre lazerler kullanılarak tekrar tarandı. Bu panelde, fotokonvert edilen endotel hücrelerini daha sonraki aşamalarda takip edebilmek için ilgi alanı içindeki yeşil kick G tamamen kırmızıya dönüştü. Embriyo, fotokonversiyondan 24 saat sonra, yani fotokonvert edilen ilgi alanından köken alan endotel dokular içinde döllenmeden yaklaşık 72 saat sonra gözlemlendi.Kırmızı floresan foto-dönüştürülmüş kick G proteinlerinin stabilitesi ve ardından yeni yeşil dönüştürülmemiş kick G proteinlerinin sentezlenmesi nedeniyle, hem dönüştürülmemiş hem de foto-dönüştürülmüş kick G proteinleri gözlemlenmiştir. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların çeşitli balıklarda hücre biyolojisini ve doku yeniden şekillenmesini incelemelerinin önünü açmıştır.

cell-tracking-using-photoconvertible-proteins-during-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Bu video, fotokonvertibl yeşil floresan proteini eksprese eden transgenik zebra balığı larvaları kullanılarak lökosit alımının izlenmesini göstermektedir. Kırmızı floresan boya etiketli bakterilerin otik veziküle önceden enjekte edilmesi ve fotokonversiyonun indüklenmesi, lökositlerin göçünün, fagositozunun ve vücut boyunca dağılmasının gözlemlenmesini sağlayarak bağışıklık tepkisi dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Bakteriyel Enfekte Transgenik Zebra Balıklarında Fotokonversiyon Tabanlı Lökosit Takibi

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

GFP transgenik arka planlarında in vivo hücre takibi için güçlü, basit ve uygun maliyetli bir araç olarak fotoconvertible PSmOrange sistemini kurduk. Bu protokol, zebra balığı model sistemindeki uygulamasını açıklar.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin, zebra balığı embriyolarında fotokonvertibl proteinlerle hücre takibi yapmayı. Bu yöntem, konfokal mikroskopi ile gelişim sürecindeki hücre olaylarını canlı olarak izlemenizi sağlar.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Daha fazla video keşfet