Name: Viral Nanopartiküller In vivo Tümör Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Öğrenin, bitki viral nanopartiküllerinin fare tümör modellerinde hedefleme ve görüntüleme için nasıl üretildiğini, saflaştırıldığını ve işlevselleştirildiğini. Bu yöntem kanser tedavisinde umut vadeden uygulamalar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH / NIBIB hibe R00 EB009105 (NFS) ve P30 EB011317 (NFS), bir NIH / NIBIB eğitim bursu T32 EB007509 (AMW için), bir Case Western Reserve Üniversitesi Disiplinlerarası Birlik Yatırım Hibe (NFS), tarafından desteklenen ve Bir Olgu Kapsamlı Kanser Merkezi&#39;nde hibe P30 CA043703 (NFS). Biz onların için Steinmetz Lab lisans öğrencisi araştırmacıların teşekkür hands-on desteği: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Yani, ve Paul Chariou .

1. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Yayılım <ol><li> Kapalı bitki odasının günün 15 saat (% 100 ışık, 25 ° C,% 65 nem) ve gece 9 saat (% 0 ışık, 22 ° C,% 60 nem) kontrollerini ayarlayın. </li><li> Tablo 1&#39;de çizelgesine göre bitki inoküle edin. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV ve BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gün 0: Bitki 3 börülce tohum / saksı. </td><td> Gün 0: Bitki ~ 30 N. benthamiana tohum / saksı. 1 çorba kaşığı gübre / 5 L su ile haftada bir kez gübreleyin. </td></tr><tr><td> Gün 14: 1 Bitki / pot Re-pot N. benthamiana. </td></tr><tr><td> Gün 10: Infect korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon tarafından CPMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile primer yapraklar bırakır. </td><td> Gün 28: Infect üç five korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon yoluyla PVX, TMV veya BMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile bırakır. </td></tr><tr><td> Gün 20: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C. </td><td> Gün 42: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C. </td></tr></tbody></table> , Büyüyen bulaşmasını ve yaprakları hasat için Tablo 1. Timeline. Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX, ve TMV) saflaştırılması Not: Tüm adımlar buz üzerinde veya 4 yürütülmektedir ° C <ol><li> Soğuk tampon 2 cilt (bkz. Tablo 2) kullanılarak standart bir blender dondurulmuş yaprakları 100 g homojenize. Tülbent 2-3 katmanları süzülür. </li><li> PVX için, 1 M HCl ile pH 6.5 &#39;e ayarlayın. % 0.2 (w / v) askorbik asit ve% 0.2 (w / v) sodyum sulfi eklemete. </li><li> 20 dakika boyunca 5.500 xg&#39;de ham bitki Homojenat santrifüjleyin. Süpernatant toplayın. </li><li> BMV için, tabaka% 10 (w / v) sakaroz çözeltisi, 5 ml süpernatant üzerine, 25 ml. % 38.5 CsCl çözeltisi (w / v) içinde 3 saat ve pelet tekrar süspansiyon 9,000 x g&#39;de santrifüjleyin. 5 saat sallayarak karıştırın, ardından adım 2.12 ile devam edin. </li><li> 1:1 (v / v) kloroform :1-bütanol 0.7 hacim ekleme yoluyla bitki materyali ayıklamak. 30-60 dakika boyunca karışımı karıştırın. </li><li> 20 dakika boyunca 5,500 x g çözelti santrifüjleyin. Üst sulu faz toplanır. </li><li> M 0.2 ve% 8 (ağırlık / hacim) PEG (MW 8000) ile NaCl ekleyin. TMV için, aynı zamanda (v / v) Triton X-100,% 1 ekleyin. En az 1 saat süre ile karıştırınız, sonra en az 1 saat boyunca bekletilir. </li><li> 15 dakika boyunca 15.000 xg&#39;de çözümü santrifüjleyin. 10 ml tampon içinde yeniden süspanse pelet. PVX için, 0.5 M için% 0.1 β-merkaptoetanol ve üre ekleyin </li><li> 30 dakika boyunca 8.000 xg&#39;de santrifüjleyin ve süpernatant toplamak. </li><li> 3 saat boyunca 160,000 x g süpernatant Ultrasantrifüj. 5 ml tampon o da süspanse peletvernight. </li><li> Eşit hacimde% 10,% 20,% 30, ve tampon içinde% 40 sakaroz (ağır ilk) ile bir% 10-40 oranında sakaroz eğim hazırlayın. Gradyan oda sıcaklığında gece boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> Ultrasantrifüj 2 saat (BMV için 24 saat) için 100.000 xg&#39;de sukroz gradient üzerinde pelet yeniden süspanse. </li><li> Işık saçılması bandı toplayın ve tampon karşı dialyze. </li><li> 4&#39;te VNPs (aşağıda) ve mağaza Karakterize ° C. Uzun süreli depolama için, -80 ° C&#39;de saklayın </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV ve TMV </td><td> 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) 38.5 mM KH 2 PO 4 61.5 mM K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0.5 M borat tamponu (pH 7.8) 0.5 M borik asit NaOH ile pH ayarlama </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA tamponu (pH 4.5) 250 mM sodyum asetat 10 mM MgCl2 2 mM β-merkaptoetanol (taze ekleyin) </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Her VNP için Tamponlar ve kendi tarifleri. Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Karakterizasyonu <ol><li> VNPs konsantrasyonunu belirlemek için UV / Görünür Bölge spektroskopisi gerçekleştirin. <ol><li> Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak numunenin 2 ul absorbansı ölçülür. </li><li> Beer-Lambert yasası kullanılarak partikül ve boyaların konsantrasyonu belirleyin (A absorbans A = εcl, ε sönüm katsayısı, c konsantrasyon ve l yol uzunluğu). Yol uzunluğu Nanodrop için 0,1 cm dir. VNP özgü nesli katsayıları şunlardır: CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (260 nm) PVX: 2.97 cm -1 mg -1 ml (260 nm) TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (260 nm) BMV: 5.15 cm -1 mg -1 ml (260 nm) </li></ol></li><li> Boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) parçacıkları analiz edin. <ol><li> Bir Superpoze 6 boyut dışlama kolon ve AKTA Explorer, 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) ve 200 ul içinde VNPs yük 50-100 ug kullanılması. </li><li> 260 nm (nükleik asit), 280 nm (protein) ve bağlı herhangi boyaların uyarma dalga boyu dedektörü olarak ayarlayın. </li><li> 72 dakika boyunca 0.5 ml / dak &#39;lık bir akış hızında çalışırlar. </li><li> Elüsyon profili ve A260: A280 nm VNP hazırlık saf olup olmadığını ve parçacıklar sağlam ve monte olup olmadığını gösterir. Aşağıdaki A260: 280 oranlarında saf VNP hazırlık göstermektedir: CPMV: 1,8 ± 0,1 PVX: 1.2 ± 0.1 TMV:1.1 ± 0.1 BMV: 1.7 ± 0.1 </li></ol></li><li> Bireysel kat proteinlere hazırlanması ve konjugasyon saflığını analiz (prekast NuPAGE) Bis-Tris poliakrilamid 4-12% gradyan jel elektroforezi denatüre gerçekleştirin. <ol><li> Potasyum fosfat tampon 9 ul içinde 10 ug parçacıkların için 4x LDS numune tamponu 3 ml ilave edilir. Disülfid bağlarının yüksek sayısını azaltmak için BMV 4x LDS örnek tampon ve β-merkaptoetanol 3 ul ilave 1 ul ekleyin. </li><li> 100, 5 dakika süreyle ısıtma bloğu içinde inkübe ° C. </li><li> SDS jel üzerine örnekler yükleyin. </li><li> Tampon çalıştıran 1x MOPS 1 saat için 200 V örnekleri çalıştırın. </li><li> Floresan ceket proteinleri görselleştirmek için UV ışık altında jel belgeleyin. </li><li> Floresan olmayan protein için, 1 saat için Coomassie mavisi (% 0.25 (w / v) Coomassie Brillant Blue R-250,% 30 (v / v) metanol,% 10 (v / v) asetik asit) ile leke. </li><li> Gece boyunca% 30 metanol,% 10 asetik asit ile Destain. Change çözüm isteniyorsa. </li><li> Beyaz ışık altında jel belgeleyin. </li></ol></li><li> Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından parçacıkların bütünlüğünü analiz. <ol><li> 0.1-1 mg / DI su 20 ul ml numune sulandırınız. </li><li> Parafilm ile ilgili örnekler 20 ul damla yerleştirin. </li><li> TEM ızgara ile damla örtün ve 2 dakika bekletin. Filtre kağıdı ile ızgara üzerinde aşırı Solüsyon Wick. </li><li> Kuru esneklik ardından DI bir damla su üzerine koyarak ızgara yıkayın. </li><li> % 2&#39;lik bir 20 ul damla (w / v) 2 dk için uranil asetat ile ilgili yerleştirilmesi ile ızgara Leke. Filtre kağıdı ile leke aşırı kapalı Wick. </li><li> Suda bir kez daha ızgara yıkayın. </li><li> Bir transmisyon elektron mikroskobu altında ızgara gözlemleyin. </li></ol></li></ol> 4. PEG ve fluorophores, Saflaştırılması, ve karakterizasyonu ile VNPs Kimyasal Konjugasyon <ol><li> Aşağıdaki reaksiyonlar için hesaplamalar için, VNPs molar kütlesi vardır: CPMV: 5.6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4.6 x 10 6 g / mol </li><li> Tek adımlı bir N-hidroksi süksinimit bağlama reaksiyonu kullanılarak CPMV ve PVX yüzey lysines ile boyalar ve PEG konjugatı: Alexa Fluor 647 süksinimidil ester ve 4.500, 2.500 eşdeğer molar eşdeğerleri (tüm molar aşırı VNP göre molar fazlalıkta bakınız) ekleyin NHS PEG (MW 5,000) 0.1 M potasyum fosfat tamponu içinde CPMV için DMSO içinde çözülür. PVX çalışırken, NHS-boya ve NHS-PEG 10.000 molar aşırı ekleyin. CPMV ve PVX nihai konsantrasyon 2 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı gece boyunca inkübe edin. CPMV ve PVX, sırasıyla, 300 ve 1,270 adreslenebilir lysines sahiptir. (Okuyucu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denirCPMV ve PVX kimyasal modifikasyonu: 13-15). </li><li> Diazonyum kaplin ile TMV tirozinlerin konjugat boyalar ve PEG bakır (I) katalizli azit-alkin siklo izledi. <ol><li> 0.3 M p-tolüensülfonik asit monohidrat, 3.0 M sodyum nitritin 25 ul, ve 0.68 M damıtık, 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de, asetonitril içerisinde çözündürüldü 3-ethynylaniline için 75 ul 400 ul karıştırılarak diazonyum tuzu (alkin) hazırlayın. </li><li> TMV 1.25 ml (20 mg / ml stok çözeltisi) için NaCl 100 mM borat tamponu, pH 8.8, 3.3 ml ilave edilir. </li><li> Bir alkin ligasyon diazonyum bağlanması ile TMV işlemek için eklemek için 3 saat boyunca bir buz banyosu içinde diazonyum tuzu (alkin) çözeltisi 450 ul TMV React. Çözüm açık kahverengi bir renk dönüşecektir. TMV konjugasyon için 2.140 kullanılabilir tirozinlerin vardır. </li><li> Adım 4.4 &#39;de tarif edildiği gibi bir sükroz tampon kullanarak nihai ürün üzerine koyulmuştur. </li><li> Azid fonksiyonlu Alexa Fluor 647 ve PEG-azid (MW 5000) istimal takıng bakır (I) katalizli azit-alkin siklo (CuAAC). 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 2 mM sodyum askorbat ile kılıf proteini ve inkübe başına boya ve PEG-azit 2 eşdeğer ekleyin. TMV nihai konsantrasyon tepki 2 mg / ml &#39;dir ki bu tür tampon hacim ayarlama. (: 16,17 okuyucu TMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir). </li></ol></li><li> Lysines ve BMV sistein mutant (cBMV) ve sistein ile PEG boyalar Dualı: <ol><li> 0.1 M TNKM tampon maddesi (50 mM Tris baz, 50 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, pH 7.4) içinde cBMV için DMSO içinde çözülür Oregon Green 488 süksinimidil ester, 2.000 molar eşdeğer ekleyin. BMV nihai konsantrasyon 1 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. 4. gece boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C&#39;de ışıktan korunur. </li><li> Santrifüje kullanarak Purify parçacıklarolarak fugal filtreleri adım 4.4 &#39;de tanımlanmıştır. </li><li> Daha önce olduğu gibi aynı reaksiyon koşulları kullanılarak, PEG-maleimit (MW 2,000), 2.000 molar fazlası ilave edin ve 4 de 2 saat boyunca, reaksiyon karışımı inkübe ° C cBMV 180 reaktif lysines ve sistein sahiptir. (: 18 okuyucu BMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir). </li></ol></li><li> Saflaştırma: 2.5 saat boyunca 160,000 x g bir% 40 (w / v) sakaroz yastığı çözelti geçirir. Tampon pelet yeniden çözülür. Alternatif olarak, 10 kDa kesme spin-off filtreleri kullanarak uygun tampon karşı dialyze. </li><li> Karakterizasyon: Pegile ve floresan-etiketli VNPs yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak analiz edilmiştir: görünür / UV spektroskopi, SDS jel elektroforezi, FPLC ve TEM (gösterilmemiştir, ancak, Şekil 6 ve 7&#39;ye bakın). </li></ol> 5. Bir Fare Xenograftlarında Modeli kullanılarak Tümör Hedefleme ve Görüntüleme<ol><li> Kültür HT-29 RPMI medyumu içinde insan kolon kanser hücreleri 175 cm2 hücre kültür şişeleri ile% 5 CO2 içinde% 5 FBS, 37% 1 penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin ° C ile desteklenmiştir. </li><li> 5 dk için 37 ° C &#39;de tripsin-EDTA 5 ml steril PBS ile inkübe ederek ve hasat ile iki kere yıkayın hücrelerini. RPMI ortam 5 ml tripsin inaktive eder. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüj hücreleri toplayın. 4 at 5x10 6 cells/50 ul orta (tripan mavi ve bir hemasitometre kullanarak toplam hücre sayısını belirlemek) taze RPMI ° C ve tekrar süspansiyon. Enjeksiyonu (tüm çözeltiler ve reaktifler steril tutmak) öncesinde Matrigel eşit hacmi ile karıştırın. </li><li> Procure altı hafta eski NCR nu / nu farelerine ve 2 hafta boyunca bir yonca ücretsiz diyet onları korumak. [Not:. Bütün hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış olmalıdır] subkutan enjeksiyon yoluyla tümör xenografts øndükle 5x10 6 cells/100 steril bir 18 1/2 ölçü kullanarak yamaçlarında ul / tümör (2 tümörler / fare)iğne. Düzenli hayvanları izleyin. Pergel ile ölçülür ve tümör boyutu tümör 20 mm 3 (bir sonraki 12 gün içinde) bir ortalama hacim büyümesine izin verir. PBS ve VNP (n = 3 hayvan / grup / zaman noktası): rastgele iki farklı grup fareler atayın. Bir 1 ml 28 gauge insülin şırıngası kullanılarak, damar içi steril PBS kuyruk damarından enjeksiyon 100 ul ya da 10 mg / kg VNP formülasyon tarafından idare. </li></ol> Not: Canlı hayvanlar ile Doku kültürü deneyleri ve çalışmalar göstermiştir olmayacaktır. Hands-on gösteri doku işleme ve veri toplama ile sınırlı olacaktır. HT-29 tümör ksenogreft modelinde bir referans için, okuyucunun ref adlandırılır. 19 Üç teknikleri VNPs yuvalandırma tümörü değerlendirmek için kullanılır: <ol start="4"><li> CO 2 kullanarak farklı zaman noktalarında (2, 24 ve 72 saat) de Kurban fareler: Maestro Görüntüleme Sistemi kullanarak Floresans görüntülemegaz. Kanatlarda tümörleri ile birlikte hayvan ve tüketim tüm önemli organları (beyin, kalp, akciğer, dalak, böbrek ve karaciğer) teşrih, parafilm üzerindeki dokular yerleştirin ve (800 ms sarı eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanarak floresan görüntüleme cihazı ile analiz dokularda floresan sinyalleri (VNPs konjuge A647 etiket türetilen) varlığını tespit maruz kalma). Görüntüleri kaydedin ve ImageJ 1.44o yazılımını kullanarak (floresan yoğunlukları analiz <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Süre ile diğer dokularda önemli olan tümörlerde VNPs alımını paterni karşılaştırın. </li><li> Görüntüleme sonra yarıda her doku kesilmiş ve kriyo-kesit ve konfokal analizi için Ekim bileşik bir buçuk gömün. Önceden tartılmış kriyo-flakonlarda diğer yarısı toplayın ve bunları hemen sıvı N 2 kullanarak dondurma. Mağaza -80 ° C daha fazla işlem için hazır olana kadar. </li><li> Floresans ölçümü: Rekord dokuları ağırlıkları. Oda sıcaklığında dondurulmuş doku çözülme ve PBS 1 ml içeren ayrı 50 ml Falcon tüpleri yerleştirin. Bir el dokusu homojenizatör kullanarak, PBS içinde 2-3 dakika süreyle doku homojenize sonra mikrofuge&#39;de tüplere homojenat aktarın. Non-homojenize doku kaldırmak için 13.000 g&#39;de 10 dakika süreyle homojenatlarında santrifüjleyin. </li><li> 384 de siyah UV plaka içine her grup (PBS ve VNP formülasyonları / zaman puan) dokulardan süpernatant pipetleyin 100 ul. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğu (Ex / Em dalga boylarında 600/665) değerlendirin. Doku ağırlıkları ile elde edilen floresan değerlerini normalleştirmek. </li><li> İmmünohistokimya: -20 ° C&#39;de kriyo-mikrotom bölümleri (10 mikron) ve mağaza hazırlayın Hücre çekirdeğinin (DAPI) ve endotel hücre işaretleyici (CD31 antikoru anti-fare FITC-etiketli) için doku kesitleri Leke. Floresan-etiketli VNP ve vasküler ve intra-tümöral yerelleştirme haritasına konfokal mikroskopi analizi yapıns. </li></ol> Not: Bu işlem ortaya olmayacak, temsilci veriler Şekil 8 &#39;de gösterilmiştir. Immünohistokimya ve anlatılan boyama yöntemleri ile ilgili bir başvuru için okuyucu ref adlandırılır. 19

<ol><li>Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dpvweb.net/ ">http://dpvweb.net/ </a> (2012).</li>
<li>Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIPERdb2%3A+an+enhanced+and+web+API+enabled+relational+database+for+structural+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology.</a> Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).</li>
<li>Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+engineering+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The art of engineering viral nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+an+icosahedral+virus+for+nanomedicine+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Nano-Constructs+Composed+of+Genome-Depleted+Brome+Mosaic+Virus+Doped+with+a+Near+Infrared+Chromophore+for+Potential+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications.</a> ACS Nano. , (2011).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+virions%3A+dynamic+tracking+of+the+pathway+of+adenoviral+gene+transfer+vectors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells.</a> Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat. Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+human+prostate+cancer+using+viral+nanoparticles+targeted+to+gastrin-releasing+Peptide+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors.</a> Small. 7, 1664-1672 (2011).</li>
<li>Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+using+hybrid+virus-dye+nanoparticles+for+near-infrared+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Communications%22%5BJournal%5D)">A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography.</a> Optics Communications. 255, 366-374 (2005).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cowpea+mosaic+virus+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3A+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+novel+platform+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications.</a> Nano Lett. 10, 305-312 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+virus+particles+as+addressable+nanoscale+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).</li>
<li>Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+tobacco+mosaic+virus+with+%22click%22+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry.</a> Chembiochem. 9, 519-523 (2008).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol vivo tümör görüntüleme için VNPs ve uygulamaları kimyasal modifikasyonu için bir yaklaşım sağlar. Burada sunulan hayvan floresan görüntüleme, floresans ölçme ve immunohistokimyasal teknikler biyodağılımını okuyan ve tümör homing değerlendirmek için yararlıdır. Bu teknikler EPR etkisi ile tümörün nanopartiküller erişim konusunda değerli bilgiler sağlamaktadır. Çeşitli analitik yöntemlerle elde edilen sonuçları birleştirerek, VNPs lokalizasyonu ve biyodağılımını değerlendirmek için güçlü bir ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;VNP üretimi&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>İç mekan bitki odası</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; tohumlar (California black-eye no. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; tohumlar</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;N. benthamiana tohumları Salk Institute tarafından hediye edilmiştir. Tohumlar bitki çoğaltma yoluyla üretilir.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Karborundum</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Pro-mix BX saksı toprağı</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Gübresi</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Ekipman&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50,2 Ti rotor</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti rotor</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>SLA-3000 rotoru</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 rotoru</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen şişe</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>SLA-3000 rotoru için</td></tr><tr><td>Polikarbonat şişe</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>SS-34 rotoru için</td></tr><tr><td>Ultra-Clear tüp</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Sükroz gradyanı ve SW 32 Ti rotor için</td></tr><tr><td>Polikarbonat şişe</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Çöktürme için ve 50.2 Ti rotor</td></tr><tr><td>NanoDrop spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>PowerEase 500 hazır döküm jel sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL (24 ml) boyut dışlama kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 Kromatografı</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Masaüstü santrifüj</td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Doku Yırtıcı</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>FluoView lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Kimyasallar ve Reaktifler&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-etinilanilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyucuklu siyah plaka</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>%4-12 Bis-Tris NuPAGE SDS jeli</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>4X LDS örnek tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 azid</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 karboksilik asit, süksinimidil ester</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0,5 ml Santrifüj Filtreleri</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>10 kDa kesme sınırı</td></tr><tr><td>Aminoguanidin hidroklorür</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>P5 kalite</td></tr><tr><td>FITC anti-fare CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit sodyum tuzu</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamları</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lam örtü camı</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanokristaller</td><td>PG1-ML-2k</td><td>MA 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanokristaller</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>MA 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanokristaller</td><td>PG1-SC-5k</td><td>MA 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 süksinimidil ester *6-izomeri*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>p-toluensülfonik asit monohidrat</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Dibazik potasyum fosfat</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum nitrit</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sülfit</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sakkaroz</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>TEM ızgarası</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazı</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Doku Kültürü&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Fetal bovin serum</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>HT-29 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü flaskları</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, %0,05 (1X), EDTA 4Na ile, sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Hayvan Çalışmaları&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>%18 Proteinli Kemirgen Diyeti</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Yoncuzsuz diyet</td></tr><tr><td>İnsülin şırıngası</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28 gauge</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrisi bazal membran</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>NCR nu/nu fareler</td><td></td><td></td><td>CWRU Okulu&lt;br/&gt; Tıp Fakültesi Atimik Hayvan ve Xenograft Çekirdek Tesisi</td></tr><tr><td>Steril şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Bileşiği</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

viral nanopartiküller<em&gt; in vivo</em&gt; tümör görüntüleme

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Nanomalzemelerin kullanımı malzeme bilimi ve tıp devrim potansiyeline sahiptir. Şu anda değişik nanopartiküller bir dizi görüntüleme ve tedavi uygulamaları için araştırılmaktadır. Bitkilerden elde edilen viral nanopartikül (VNPs) belirlenmiş boyutlarda ve şekillerde ile kendini monte bionanomaterials olarak kabul edilebilir. Steinmetz laboratuarda inceleme altına Bitki virüsleri çapı 30 nm her ikisi de Börülce mozaik virüsü (CPMV) ve Brom mozaik virüsü (BMV) oluşan icosahedral parçacıkları içerir. Biz de şu bitki virüsleri türetilen çubuk şeklinde ve ipliksi yapılar geliştiriyoruz: 18 nm 300 nm boyutlarında ve ipliksi parçacıklar 515 oluştururlar Patates X virüsü (PVX), rijit çubuklar oluşturur Tütün mozaik virüsü (TMV), uzunluk ve genişlik olarak 13 nm olarak nm (okuyucu Refs ifade edilir. VNPs hakkında daha fazla bilgi için 1 ve 2). planta büyük ölçekte kolaylıkla üretilebilir, son derece istikrarlı ve biyouyumlu vardır. Ayrıca, VNPs özellikle genetik modifikasyon veya kimyasal bioconjugation yöntemleri 3 kullanılarak tasarlanmış olabilir &quot;programlanabilir&quot; birimlerdir. VNPs yapısı atomik çözüm bulunmakta olduğu bilinmektedir, ve modifikasyonlar atomik seviyede 4, mevcut teknoloji teknolojileri ile sentetik nano kullanılarak elde edilemeyen bir kontrol seviyesinde uzaysal hassasiyet ile gerçekleştirilebilir. Bu yazıda CPMV, PVX, TMV ve Vigna ungiuculata ve Nicotiana benthamiana bitkilerde BMV yayılımı tanımlar. Her VNP için Ekstraksiyon ve saflaştırma protokolleri verilmektedir. Saflaştırılmış ve kimyasal-etiketli VNPs karakterizasyonu için yöntemler tarif edilmiştir. Bu çalışmada, ch odaklanmakemical florofor ile VNPs etiketlenmesi (örneğin Alexa Fluor 647) ve polietilen glikol (PEG). Boyalar izleme ve 5-10 VNPs tespiti kolaylaştırmak ve onların farmakokinetiği 8,11 artırırken PEG protein nanopartiküller immünojenite azaltır. Biz bir fare ksenogreft tümör modeli kullanılarak Pegile VNPs yuvalandırma tümör ortaya. Maestro Görüntüleme Sistemi kullanılarak dokuların ex vivo floresan görüntüleme, homojenize dokularda floresans ölçme ve konfokal mikroskopi kombinasyonu biyodağılımını incelemek için kullanılır. VNPs retiküloendotelyal sistem (RES) ile temizlenir; homing tümör geliştirilmiş geçirgenlik ve saklama (EPR) etkisi 12 ile pasif olarak elde edilir. VNP nanoteknoloji güçlü bir plug-and-play görüntü teknolojisi ve in vivo hastalık siteleri tedavi. Bu daha fazla ilaç için yük ve klinik olarak-ilgili görüntüleme kısımları gibi doku-spesifik ligandlar taşımak için VNPs geliştirmektedirkanser ve kardiyovasküler hastalık aşırı eksprese moleküler reseptörleri hedef.

<img alt="Bitki büyüme karşılaştırmalı analizi; deneysel kurulum, yaprak rengi varyasyonu çalışması, kloroz yöntemi." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
 Şekil 1. Bitki virüsü enfekte olmuş bitkiler. CPMV ile enfekte olmuş Vigna unguiculata bitkileri (A). PVX (B), TMV (C) ve BMV (D) ile enfekte olmuş Nicotiana benthamiana bitkileri. Fotoğraflar, mekanik inokülasyon sonrası yaklaşık 10....

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Nanomalzemelerin kullanımı, malzeme bilimi ve tıpta devrim yaratma potansiyeline sahiptir. Günümüzde, birçok farklı nanoparçacık...

Bu prosedürün genel amacı, floresan işaretli viral nanoparçacıkların in vivo tümör hedeflemesini ve biyodağılımını incelemektir. Fare tümör modellerinde önce virüsü çoğaltın ve saflaştırın, ardından boyaları ve peg'i parçacıklara konjugleyin. Fonksiyonelleştirilmiş parçacıkların karakterizasyonunu tamamladıktan sonra, bunları tümör ksenogreftli farelere enjekte etme işlemine geçin.Maestro görüntüleme, floresan yoğunluğu, doku homojenliği ölçümleri ve immünofloresan sonuçları, viral nanoparçacıkların tümörde ve vücut genelindeki çeşitli organlarda lokalize olduğunu göstermektedir. Nanoparçacıklar veya BMP'ler, biyomedikal uygulamalar için gelecek vadeden platformlardır. Burada PLA VMP üretimi, çoğaltılması, saflaştırılması, karakterizasyonu ve bağırsak konjugasyonuna yönelik prosedürleri açıklıyoruz.Son olarak, bir malino greft modeli ve floresan görüntüleme kullanarak tümöre yönelim ve görüntüleme için V mps uygulamasını gösteriyoruz. Günümüzde, görüntüleme ve tedavi uygulamaları için birçok farklı nanoparçacık araştırılmaktadır. Bitkisel BMP'lerin kullanımının metal veya polimerik nanomalzemeler gibi sentetik materyallere göre temel avantajı, bunların tekil olarak dağılması ve yapılarının atomik çözünürlükte bilinmesidir.Bitki virüsleri, moleküler tarım yoluyla büyük ölçekte üretilebilir ve hem genetik hem de kimyasal mühendisliğe uygundur. Bu gösterimde, viral nanoparçacıkların floroforlar ve PEG ile kimyasal modifikasyonunu gösteriyoruz. Floroforlar görüntüleme geliştirmesi için, PEG ise farmakokinetiği iyileştirmek için kullanılacaktır.Kimyasal modifikasyonlar, viral nanopartiküllerin terapötikler ve MRI gibi klinik görüntüleme için kontrast ajanlar ile yüklenmesini sağlayacak şekilde genişletilebilir. Burada, diğer nanopartiküllerde olduğu gibi, modifiye edilmiş viral nanopartiküllerin biyodağılım çalışmasını gösterdik. V NP'lerin tümörde birikmesi, pasif tümör hedefleme olarak tanımlanan artırılmış geçirgenlik ve tutulum etkisine dayanmaktadır.Yakın zamanda, farklı bitki virüslerinin biyodağılım profillerinin belirgin şekilde farklı olduğunu saptadık. Bu gösterim için, viral N teknolojisi için altın standart olarak kabul edilen copy mosa virüsünü kullanacağız. Bitki virüslerinden nanomalzemeler geliştirmek, mühendisliğini yapmak ve bunları incelemek konusunda özel bir ilgiye sahibiz.Laboratuvarım, Ed cowpea mosaic virus, brom mosaic virus, çubuk şekilli bacca mosaic virus ve filamentöz potato virus X'in memeli sistemiyle nasıl etkileşime girdiğine dair temel bir anlayış kazanmaya odaklanmaktadır. Özellikle, şekil ve esnekliğin EVO özelliklerini nasıl etkilediğini ve bunların dokuya özgü görüntüleme ve ilaç iletimi gibi uygulamalar için nasıl en iyi şekilde uyarlanabileceğini öğrenmek istiyoruz. Bu makale, kalp mosaic virus, potato virus X, brown mosaic virus ve tobacco mosaic virus'un hazırlanışını detaylandırmaktadır.Vic, Gil ve Nicotiana'dan başlayarak, bunların fonksiyonelleştirilmesini ve preklinik bir fare modelindeki uygulamasını açıklıyoruz. Bu demonstrasyonda, kapalı bir inkübasyon odasında inek P mozaik virüsünü kullanacağız. Saksı başına üç adet inek P tohumu ekin.10. günde, her bir yaprağı, carum ile hafifçe tozlama ve ardından yaprakları hafifçe ovalama yoluyla mekanik inokülasyon kullanarak 0,1 µg/µL CPMV ile enfekte edin. 10 gün sonra yaprakları hasat edin ve -80 °C'de saklayın. Standart bir blenderda, dondurulmuş 100 g yaprağı, iki hacim soğuk 0,1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7) içerisinde homojenize edin; homojenatı üç kat tülbentten süzün ve 20 dakika boyunca 5.500 ×g'de santrifüjleyin.Süpernatantı toplayın, ardından bitki materyalini hacminin 0,7 katı oranında bir bir kloroform ve bir bütanol karışımı ile organik ekstraksiyona tabi tutun ve karışımı en az 30 dakika boyunca karıştırın. Çözeltiyi 20 dakika boyunca 5.500 G'de santrifüj ettikten sonra, üstteki sulu fazı toplayın ve ultrasantrifüj yapın.Üç saat boyunca 160,000 G uygulayın. Ardından, peleti beş mililitre fosfat tamponunda yeniden süspande edin ve örneği dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ayrıca, tampon içerisinde eşit hacimlerde %10, %20, %30 ve %40 sükroz kullanarak %10-40 sükroz gradyanı hazırlayın.En ağır olanı önce yerleştirerek gradyanı oda sıcaklığında gece boyunca dengeleyin. YENİDEN SÜSPANDİFİYE edilmiş pellet'i sükroz gradyanının üzerine katmanlar halinde ekleyin ve 100,000 G'de iki saat boyunca santrifüjleyin. Işık saçılım bandını toplayın ve boyaların ve peg'in yüzey lizin kalıntılarına konjuge edilmesi için tampon çözelti ile diyalize edin; bu işlem için CPMV başına 2,500 molar eşdeğer Flor ve 4,500 eşdeğer NHS PEG kullanın.Reaksiyonu saflaştırdıktan sonra, nano drop kullanarak iki µL örneğin absorbans spektrumunu ölçün ve 260, 280 ve 651 nm'deki değerleri kaydedin. Parçacıkları boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi (size exclusion fast protein liquid chromatography) ile analiz etmek için Superose 6 boyut dışlama kolonu ve ACTA Explorer kullanarak, 200 µL 0,1 M potasyum fosfat tamponu içindeki 50 ila 100 µg VNP örneğini yükleyin.pH 7.0'da dedektörleri nükleik asitler için 260 nanometreye ve proteinler için 280 nanometreye ayarlayın. Ayrıca, bağlı olan tüm boyaların absorbans dalga boyunu ayarlayın. Ayırmayı 0.5 mililitre/dakika akış hızında 72 dakika boyunca gerçekleştirin.2:62:80 oranındaki elüsyon profili, reaksiyonun saf olup olmadığını ve V NPS'lerin tamamen birleştiğini ve bütün olduğunu gösterir. Ardından, tekil kılıf proteinlerine konjugasyonu analiz etmek için denatüre edici bir SDS jel elektroforezi hazırlayın. Her örnek için, potasyum fosfat tamponu içindeki 9 µL'lik 10 µg partiküle, üç mikrolitre 4X LDS örnek tamponu ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 100 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin.Numuneleri bir SDS jeline yükleyin ve bir saat boyunca 200 volt ile çalıştırın. Bir X mops çalışma tamponu içerisinde jeli beyaz ışık altında belgeleyin. Boyamadan sonra, bu viral nanopartiküller artık bir ksenogreft fare modeli kullanılarak tümör hedefleme ve görüntüleme için hazırdır.Genellikle, bu partikülleri uygulamak ve VN ps'lerin tümöre yönelimini değerlendirmek için kuyruk veni yoluyla intravenöz enjeksiyon kullanırız. Dokuları Maestro floresan görüntüleme cihazı ile analiz edin. VN PS'lere konjuge edilen A 6 47 etiketinden kaynaklanan floresan sinyallerinin varlığını tespit etmek ve floresans miktarını belirlemek için 800 milisaniye pozlama süresi ile sarı eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanın.Dokuları PBS içinde iki ila üç dakika boyunca homojenize edin. Ardından homojenatı santrifüj tüplerine aktarın; her zaman noktası için her bir PBS ve VNP formülasyonundan 100 µL numuneyi 384 kuyucuklu siyah UV plakaya aktarın. Floresan yoğunluğunu 6 ve 665 nm eksitasyon ve emisyon dalga boylarını kullanarak ölçün.Başarılı VNP propagasyonu, mekanik inokülasyondan yaklaşık bir hafta sonra yapraklarda mozaik semptomlarının görülmesiyle belirlenebilir. Partiküllerin saflığını değerlendirmek için UV görünür spektroskopisi kullanılabilir. 260 nanometredeki absorbans nükleik asit konsantrasyonu ile, 280 nanometredeki absorbans ise protein konsantrasyonu ile orantılıdır.VN PS'nin bu boyut dışlama elüsyon profilleri, bir Superose six kolonu ve ACTA purifier kullanılarak elde edilmiştir. UV-görünür spektrumlarında olduğu gibi, A₂₆₀/A₂₈₀ oranı VNP preparatlarının saflığını değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, elüsyon profili partiküllerin saflığını belirlemek için kullanılabilir.SDS jel elektroforezi, denatüre olmuş kılıf proteini alt birimlerini ayırır. CPMV partikülleri, biri 42 kilodaltonluk büyük bir protein ve diğeri 24 kilodaltonluk küçük bir protein olmak üzere iki proteinden oluşur. Not. Virüs partiküllerinin bu TEM görüntülerinde, daha küçük olan proteinin iki elektroforetik formu bulunmaktadır.TEM ızgaraları %2 uranil asetat ile negatif olarak boyanmıştır, bu nedenle partiküller koyu bir arka plan üzerinde açık renkli görünmektedir. CPMV partikülleri 30 nanometre boyutundadır. V NP'ler daha sonra biyokonjugasyon kimyaları aracılığıyla fonksiyonelleştirilebilir.Örneğin, CPMV, fonksiyonelleştirilmiş NHS Esterleri ile reaksiyona girebilen lizinlere sahiptir; VN ps karakterizasyonunun fonksiyonelleşmesini doğrulamak için, daha önce saflaştırılmış partiküller için kullanılan yöntemlerle aynı işlemler gerçekleştirilir. Bunlar, floresanla işaretlenmiş ve pegillenmiş VN ps'lere ait temsilci verilerdir. Fonksiyonelleştirilmiş partiküller daha sonra, pegillenmiş ve floresan işaretli VN ps'ler ile biyodağılım ve tümör hedeflemesinin incelenmesi gibi alt uygulamalar için kullanılabilir.Burada, insan HT 29 ksenogreftleri implante edilmiş nude farelerde CPMV'nin biyodağılımı değerlendirilmiş; biyodağılım ve tümöre yönelim, dokuların maestro görüntülemesi kullanılarak incelenmiştir. Ex vivo olarak PBS kontrolü için herhangi bir floresans gözlemlenmemiştir. 6 47 ve peg ile konjuge edilmiş CPMV için ise retiküloendotelyal sistem tarafından temizlenmeye bağlı olarak karaciğerde belirgin, dalakta ise kısmi floresans tespit edilmiştir.Tümördeki belirgin floresans, artmış geçirgenlik ve tutulum etkisi aracılığıyla tümör yönelimini göstermektedir. Bu kantitatif veriler, doku ağırlığına göre normalize edilmiş homojenize dokuların floresans ölçümü yoluyla elde edilmiştir. Beklendiği üzere veriler, CPMV'nin karaciğer ve dalak tarafından temizlendiğini göstermektedir.CPMV tümörde de tespit edilmiştir. Kriyoseksiyon yapılmış dokuların immün boyaması kullanılarak gerçekleştirilen ileri intratümöral lokalizasyon çalışmaları, CPMV'nin intratümöral lokalizasyonunu göstermektedir. CPMV kırmızı renkle gösterilmiştir.Mavi renk çekirdekleri, yeşil renk ise anti CD 31 ile boyanmış bir kan damarını göstermektedir. CPMV temel olarak tümörün vaskülatürünün yakınında bulunmuştur. Tanımlanan teknikler, çeşitli biyonanopartikül sistemlerine uygulanabilirlik kazandırmıştır.Stein laboratuvarı, inek mozaik virüsü, bro mozaik virüsü, patates virüsü X ve tütün mozaik virüsü gibi VMP'leri incelemektedir. Ancak kullanılan metodolojiler, herhangi bir diğer viral nanoparçacığa veya ısı şok proteinleri gibi protein nano yapılarına da uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, R-T-P-C-R veya Western Block gibi ek yöntemler bağımsız yöntemler olarak gerçekleştirilebilir.Kriyoseksiyon ve immünohistokimya, v ps'lerin intratümöral konumu ve tümörle ilişkili makrofajlar veya diğer organellerle potansiyel kolokalizasyonu hakkında ek bilgi edinmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonel viral nanoparçacıkların nasıl çoğaltılacağı, saflaştırılacağı, fonksiyonelleştirileceği ve karakterize edileceği ile bir tümör fare modeli kullanılarak in vivo biyodağılımın nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Kaynak: Kim, B. D., et al. Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2024)Bu video, glioblastoma taşıyan bir farede terapötik nanopartiküllerin intravenöz enjeksiyonunu göstermektedir. Yöntem, kan-beyin bariyeri boyunca hedefli iletimi mümkün kılar ve beyin tümörlerinde nanopartikül biyodağılımını ve terapötik etkinliği değerlendirmek için invaziv olmayan görüntülemeyi destekler.

Bir Murin Glioblastoma Modelinde Terapötik Nanopartiküllerin İntravenöz Uygulaması

Video, bir fare tümörü ksenogreft modelinde in vivo antikor lokalizasyonu için bir floresan görüntüleme yöntemini göstermektedir. Deri altında katı ksenogreftler oluşturmak için bir fareye tümör hücrelerinin enjeksiyonunu içerir. Floresan antikorların müteakip enjeksiyonu, tümör ksenogrefti içindeki gelişmiş floresan sinyalleri yoluyla spesifik lokalizasyonu doğrular.

Bir fare tümörü ksenogreft modelinde antikorları lokalize etmek için in vivo floresan görüntüleme

Bu makalede, tümör hedefli nanoparçacık, Herdox optik görüntüleme analizi için prosedürler. Özellikle, hedef ve tümör penetrasyon değerlendirilmesi tümör tespit için çoklu görüntüleme cihazı ayrıntılı kullanımı burada açıklanmıştır.

Hedefli Viral Protein analizi HER2 + tümörler için teslim Nanopartiküller

Biz, çok açılı bir dönme optik görüntüleme saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tarafından sağlanan bir floresan marker in vivo nicelendirilmesi için (Maroi) sistemi tarif eder. Kanser ve artrit fare modelleri istihdam biz Maroi sinyal eğrisi analizi kesin haritalama ve hastalık süreçlerinin biyolojik karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

Bu protokol, florofor etiketli nanokorlar ve geleneksel antikorlar kullanan farelerde in vivo yakın kızılötesi floresan ksenogreft görüntüleme deneylerinin ex vivo doğrulamasını gerçekleştirmek için gereken adımları ana hatlarıyla belirtir.

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama<em&gt; İn Vivo</emFarelerde&gt; Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sitometrisi ve Mikroskopi

Nanoilaçların in vivo performansının zayıf anlaşılması, klinik translasyonlarını engellemektedir. Tümör taşıyan immünokompetan farelerde kanser nanoilaçlarının sistemik, doku, tek hücreli ve subselüler düzeylerde in vivo davranışını değerlendirme prosedürleri burada açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, araştırmacıların klinik çeviri için umut verici kanser nanoilaçlarını tanımlamalarına yardımcı olabilir.

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Biz kanseri metastaz preklinik vivo içinde takibi için bir iletişim kuralı tanımlamak. Non-invaziv [18F] tetrafluoroborate-evde beslenen hayvan ve aerodinamik ex vivo onay floresan bir protein tarafından algılanan sodyum iyodür simporter birleştiren bir radyonüklid Floresans muhabir dayanmaktadır. Preklinik in vivo hücre tümör biyolojisi izleme için uygun bir yöntemdir.

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Burada, nazal kendiliğinden monte edilmiş nanoemülsiyon tümör aşısının in vitro ve in vivo olarak hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Nazal Kendi Kendine Toplanan Nanoemülsiyon Tümör Aşısının İn Vitro ve İn Vivo Hazırlanması, Özellikleri, Toksisitesi ve Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin glioblastoma tümör iletiminin iki foton mikroskobu için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Bir Murin Modelinde Glioblastomun İki Fotonlu İntravital Mikroskobu

Kan-beyin bariyeri, tedavisi olmayan bir hastalık olan glioblastoma için tedavilerin uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada, boyut nedeniyle bu fizyolojik bariyeri atlayabilen ve tümör içinde birikebilen in vivo görüntü kılavuzluğunda demir oksit terapötik nano bir platform sunuyoruz.

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Öğrenin, bitki viral nanopartiküllerinin fare tümör modellerinde hedefleme ve görüntüleme için nasıl üretildiğini, saflaştırıldığını ve işlevselleştirildiğini. Bu yöntem kanser tedavisinde umut vadeden uygulamalar sunar.

Viral Nanopartiküller

Daha fazla video keşfet