Name: İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Keşfedin Drosophila'da bakteriyel enfeksiyon sırasında lokomotor aktivite ölçümüyle uyku ve immün fonksiyon arasındaki ilişkiyi. NFκB aktivasyonunu gerçek zamanlı izleyerek davranış ve bağışıklık arasındaki moleküler bağlantıları anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe # IOS-1025627 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen ve hibe kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri # 1R21NS078582-01 tarafından ÇENE etmek edildi

Bu protokol, bir bakteriyel enfeksiyona maruz kalan sinek toplandı dört farklı okuma elde etmek için iki düzeneklerinin (Şekil 1) kullanır. 2) sağkalım sonuçları;; 3) sinek bakteri yükü ve 4) in vivo NFKB muhabiri aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümü Bu çıkışlar) uyku / uyanıklık davranışları 1 içerir. Drosophila mevcuttur genetik araçları ile birlikte, bu ölçümler bağışıklık fonksiyonu ve davranışı arasındaki moleküler bağlantıyı içine mekanistik bakış açısı sağlar. 1. Sinekler Tedbir Lokomotor Aktivite ve Uyku <ol><li> Lokomotor aktivitesini ölçmek ve Drosophila etkinliği izleme sistemi (DAM2, Trikinetics), inkübatör, karanlık oda ve deney hayvanları ve aktivite tüplerin hazırlanması içeren, sinekler uyku için kullanılan kurulum, daha önce 6 tarif edilmiştir. Aynı yaklaşım, bazı küçük değişikliklerle, burada kullanılır. <ol class="lalpha"><li&gt; Kuluçka aydınlatma inkübatör kendisi tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bu bilgisayar ve kuluçka süresi ayarı arasında senkronize etmek için önemlidir. </li><li> Aktivite tüpler de-iyonize su bir sıcak plaka üzerinde kaynatarak yeniden kullanım için temizlenir. Deterjan küçük bir miktar ilk kaynama ilave edilir, tüp yanı sıra iki kere durulanmış ve daha kaynatılır. Iplik tüp takmak için kullanılması durumunda, ikinci faaliyet tüpler (gıda, balmumu, sinek ve iplik içeren) iplik çıkarma işleminden önce olmaksızın temizlenebilir. </li></ol></li><li> Önce bir deneme başlatmak için geç pupa içeren yer kültürleri deneysel aydınlatma ve diğer çevre koşullarına uyum sağlamak için üç dört gün için kuluçka sinekler düzenledi. Işık: koyu veya sabit koşullar sık ​​uykusu davranış ölçmek için kullanılmaktadır. Bu örnekte, sinekler immün yanıt ve davranış 2,7,8 ilgili sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sabit ışık acclimated edilmektedir. Şekil 1A açıklandığı gibi </strong&gt;, Trikinetics DAM2 faaliyet içine yük 1-4 gün eski sinek gibi enfeksiyon öncesi üç gün en az 6, ve kayıt açıklanan izler. </li></ol> 2. Bakteriler bir patojen ile Sinekler Infect <ol><li> Burada açıklanan protokol S. için spesifiktir büyümek ve bakımı kolay olan marcescens. Diğer bakteri türleri için uzun vadeli depolama ve kültür koşulları için Protokoller. S. değişir marcescens -80 ° C &#39;de% 15-50 gliserol depolanır 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde otoklavlanmış% 50 gliserol 1 hacim - uzun vadeli depolama için hazırlamak için, bir gecede bakteri kültürü 2 cilt (1.0 OD 600 = 0.5) karıştırın. Bu,% 17 gliserol nihai konsantrasyon neden olur. -80 ° C&#39;de saklayın tüpleri Bakteri kaynağı kullanımı kısa vadeli hazırlamak için steril bir 200 ul pipet ucu ile dondurulmuş stok kazıyın ve LB agar plaka üzerinde üç yönlü bir çizgi gerçekleştirin. 37 &amp; d gecede plaka inkübeörneğin; C izole koloniler elde etmek. 4 ° C&#39;de depolayın plaka Planlanan enfeksiyondan önce bir gün, 5 ml LB ortamı içeren bir kültür tüpüne steril bir 200 ul pipet ve batığın ucuyla LB agar plaka tek bir koloni seçin. Bakteri gecede büyümek, ya kadar 37 küvöz çalkalayıcı içinde 16 saat ° C ve 250 rpm de üstel büyüme safhasına kadar. OD 600 bir spektrofotometre ile konsantrasyonunu ölçün. Bu aşamada yoğunluğu 0,5 ile 1 arasında değişir. Konsantrasyonu çok yüksek ise, alt kültür bakteri ve optimal bir konsantrasyon elde etmek için başka bir kaç saat için büyür. Bir alev kaynağının yakınında prosedürü uygulayın. Bazı bakteri suşları antibiyotik direnç için tasarlanmıştır ve büyümüş ve uygun bir antibiyotik için seçilen orta eklendi. S. marcescens (ATCC # 8100) antibiyotik dirençli değildir ve bu nedenle antibiyotik olmaksızın, steril ortamda yetiştirilen. Steril teknik doğrulamak için, bir aldatma cultu yapınkontrol olarak bakteri olmadan yeniden. Sinekler bulaştırmak için çözüm bakteriler (= 0,1 OD 600 seyreltilmiş) ve PBS içinde% 1 gıda boyası (Parlak Mavi FCF) içerir. PBS içinde enfeksiyon çözeltisi ve% 1 mavi renklendirici olarak kullanılan gıda LB ortamı eşdeğer miktarda eklenmesi ile enjeksiyon için bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde çözümler saklayın. </li><li> Sinekler enjekte için cam iğneler hazırlayın. Bir mikropipet çektirmesi (Narishige) kullanılarak ince bir ucu cam kapilerleri (od = 1 mm, id = 0.58 mm, TEFE) çekin. Diseksiyon mikroskobu altında açılış bir şırınga ile emme uygulanarak enjeksiyon sıvı ile doldurmak için yeterince büyük, ancak enjeksiyon işlemi sırasında sinek hasarı en aza indirmek için yeterli küçük olduğunu böylece iğne ucu kopmak ince forseps kullanın. Ucu kırdıktan sonra, ucu boyutu 40-50 mikron civarında olmalıdır. Iğne cam tüp bir uzunluğa sahip bir 3 cc plastik şırınga ile eklenmiştir. Enjeksiyon ortamının akış elle pozitif bir basınç uygulanması ya da s kontrol edilirşırınga ile uction. Şırınga cihaz ve enfeksiyon kontrol enjeksiyonlar için kullanılmış olduğu gibi, enjeksiyon sıvı ile kauçuk borudan yapılmış kirletici kaçının. </li><li> Bir CO 2 pad üzerinde koyarak sinekler uyuştur. CO 2 ped nemlendirmek için ve ped üzerinde uçan bir manipülasyon olarak gelişebilen statik elektrik, su azaltmak için bir kapalı kap içinden geçirilir. Dorsal toraks scutellum Yukarıdaki bölgeye cam iğne alay tarafından sinekler enjekte. Sinek içine enjeksiyon orta geçen gıda boyası ile de doğrulanmaktadır - sinekler sistemi yoluyla gıda boyası yayıldıkça maviye döner. Kısım 3 &#39;de tanımlanan sinekler almak bakteri doz altında, ölçülebilir. Bazı deneysel tasarımlar PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan sinek enjekte edilerek aseptik yaralanma alan bir kontrol grubu yer almaktadır. </li></ol> 3. Bakteriyel Yük belirleyin Evaluatin için bir yaklaşımg bakteriyel enfeksiyona karşı bağışıklık yanıtı bakteri yük sonrası enfeksiyon belirlemektir. D. melanogaster bütün uçucu bir birey içinde toplam bakteri sayısını belirlemek için homojenize edilebilir, çünkü bu parametreleri belirlemek için bir çok iyi bir modeldir. Bu protokol arkasındaki mantık gibi Luria broth (LB) bir Petri kabı agar (LB plaka) olarak sağlam bir ortamda yetiştirilen zaman, tek bir bakterinin görünür ayırt koloni oluşturmasıdır. Bu nedenle, Homojenat seri dilüsyonları üreten ve LB plakaları üzerine seyreltilmiş homojenat yayma, LB sıvı ortam içinde enfekte sinekler homojenleştirici ile, bir uçucu enfekte bakteri hücrelerinin sayısını tespit edilebilir. PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan enjekte sinekler bir kontrol grubu enfeksiyonu diğer bakteriyel türleri ile kontamine olmadığını doğrulamak için kullanılmalıdır. Bu durumda LB agar plakası üzerinde hiçbir koloni olmamalıdır. <ol><li> Bunun için kullanılacak olan malzemelerin otoklavGerçek homojenizasyon adımı gerçekleştirmeden önce prosedürü. Bu homojenizasyon için kullanılan makas, LB medya ve havan ile kesilmiş 200 ul pipet uçları içerir. Sinekler homojenleştirici önce en az 1 gün 10 cm steril Petri kutularına otoklavlanmış LB / agar besiyeri dökülerek tabak hazırlayın. </li><li> Anestezisi ve buz üzerinde 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza tüpler sinekler toplamak. </li><li> Kontaminasyonu önlemek için bir alev yakınında homojenizasyon gerçekleştirin. Böyle S. gibi bir bakterinin kullanırken özellikle enfeksiyon olmadan sinekleri içeren bir denetim homojenizasyon önerilir Antibiyotiğe dayanıklı değildir marcescens. 10 sinekler her başı deney koşulunda 2 grup en az homojenize. Homojenat başına kullanılan sineklerin sayısı deneyi ile belirlenir. Diğerleri Homojenat başına 3-10 sinekler kullanmış Bazı gruplar, bireysel sinekler 8 arasında bakteri yükü değişimi değerlendirmek için yararlı olduğu Homojenat başına bir sinek kullanmış9-12 genotip veya deneysel durum karşısında karşılaştırmaktır. <ol class="lalpha"><li> Sinekleri içeren her mikrosantrifüj tüp 400 ul LB ortamı ekleyin ve küçük bir motor ve havaneli (Kontes) kullanılarak homojenize. </li><li> Sterilize kesilmiş pipet uçları kullanarak, seri 180 ul LB ortamı içeren 1.5 ul mikrosantrifüj tüpe 20 ul homojenize LB / bakteriyel orta ekleyerek homojenat 01:10 sulandırmak. Pipet uçları Kesme anında enkaz tıkanmaları önler ve uygun bir ses aktarılıyor sağlar. </li><li> Seyreltme faktörü ampirik olarak belirlenir ve sinek genotip, kullanılan bakteri suşu ve deneysel koşula bağlıdır. Vahşi tip S. ile enfekte sinekler için marcescens, enfeksiyon sonrası hemen homojenize sinekler için 01:10 2 veya 1:10 3 dilüsyonları kullanmak ve sinekler için 01:10 4 veya 1:10 5 dilüsyonları 24 saat sonrası enfeksiyon homojenize. </li><li> Mikrofon 100 ul LB / bakteriyel orta Ekleve son seyreltme içeren rocentrifuge tüpleri eşit dağılımını sağlamak için cam bilyalar (VWR) kullanarak bir LB plaka üzerinde orta yayıldı. </li><li> % 100 EtOH solüsyonu içine cam topları atın. Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör LB plakaları yerleştirin. </li><li> Isteğe bağlı bir adım olarak, LB plakaları (; Alpha Innotech FluorChem 8900) bir görüntü elde etmek için görsel ışık ile bir görüntüleme sistemi kullanın. Plaka kendisi ya da Photoshop yazılımı (Photoshop CS3) üzerinde sayım aracı kullanılarak levhanın görüntü ya da kolonilerini sayın. </li><li> Sayısı koloni oluşturan formül kullanılarak sinek başı üniteleri hesaplayın: [n / (N * D * v)] * V, n LB plaka üzerinde yetiştirilen koloni = sayı; N = sineklerin sayısı birinde toplanmış mikrosantrifüj tüp; D = seyreltme faktörü ve v Her plaka üzerine yayılmış çözüm = hacmi V Homojenat = başlangıç ​​hacmi. </li></ol></li></ol> 4. Enfeksiyon Sonrası Uyku ve Sağkalım Süresi Değerlendirin <ol><li> Içinbakteri yükü ölçmek için hasat değil sinekler, başka bir 7-10 gün davranışını izlemeye devam. Sağkalım süresi sinek, çevresel koşulların genotip etkilenmiştir ve bakteriyel türler enfeksiyon için kullanılır. </li><li> ~ 10 gün sonra, deney sona indirebilir ve daha önce 6 açıklandığı gibi davranışsal verileri işlemek. Matlab dayanır Insomniac2 özel yazılım, uyku parametrelerin analiz etmek için kullanılır. Bu davranış analizden ölü sinekler ortadan kaldırmak için önemlidir. Normal olarak, bu enfeksiyon ve uçucu genotip türüne bağlı olarak, enfeksiyondan sonra ilk gün içinde için analiz kısıtlar. Tahlil Ölüm tüm etkinlik sayıları sıfıra ulaşmış süresi belirtilir. Sağkalım analizi kolaylaştırmak için, Drosonex, Microsoft Visual yazılmış özel yazılım C + + 6.0, Trikinetics DAM sistemi ham veri dosyaları işlemek için kullanılır. Excel dosyaları, her bir sineğin sağkalım süresi (saat olarak), hem yazılım raporları aktivite dat derlertek bir elektronik tabloya tüm monitörleri bir ve yüzde uçar raporlar kullanıcı tarafından belirlenen zaman içinde hayatta. Excel dosyaları ayrıntılı analiz için diğer istatistik yazılım paketleri içine entegre etmek için tasarlanmıştır. </li></ol> 5. Bir Lusiferaz Reporter Assay kullanma Enfeksiyon sırasında NFKB Aktivite ölçün Transgenik KB&#39;yi-luc Bu tahlilde kullanılan önceden sinekleri gibi Kuo ve ark tarif elde edildi., 2010 2. Kısaca, kappa B-luc lusiferaz raportör bir açık okuma çerçevesinin üst akışında bir promotör içine yerleştirildi bir NFKB bağlayıcı sekans 8 tekrarlar içerir. <ol><li> Olarak bölüm 1.2 &#39;de açıklanan deney aydınlatma koşullarına sinekler ayarlayın. Bu örnekte, 1-4 günlük KB&#39;yi-luc kara sinekler,% 5 sukroz,% 2 agar gıda ve orta enfeksiyon sırasında diğer sinekler gibi aynı yaş ulaşmak için 2 gün boyunca sürekli ışık (LL) yerleştirilir ihtiva eden küçük şişeler içine yerleştirildi. </li><li> Sinekler için 96-çukurlu bir mikrolevhadaki hazırlayın. Her iyi gıda orta 2 kat (Şekil 2) içerir; üst tabaka luciferase, lusiferaz ve substrat içerir. % 5 sukroz, her oyuğa% 2 agar çözeltisi 300 ul ekle ve katılaşmasına izin verir. Daha sonra, her bir sıra içeren% 5 sukroz,% 1 agar, ve 2 mM lusiferin (Gold Biotechnology, Inc) ile bir 50 ul üst tabaka ekleyin. Drosophila ölçüm raportör etkinliği için kullanılan lusiferin konsantrasyonlarda literatürde değişiklik göstermektedir, ve 100 uM 13 gibi düşük olmuştur. Gerekli konsantrasyon ampirik olarak saptanabilir. Gıda katmanları dağıtım arasında, sterilite korurken kurutma kolaylaştırmak için ince örgü kumaş ile plaka kapağı. Plaka yoğunlaşma damlacıkları sıkışmış uçar önlemek için, bir saat kadar, iyice kurumasına izin verilmelidir. Luciferase ışığa duyarlı olduğundan, gereğinden fazla ışığa plakalar maruz bırakmayın. </li><li> Açık yapışkan film (En Uygula-Seal-A, Perkin Elmer) kuyu başına 2 adet delik bir miktarda ince bir iğne kullanılarak bir 96-gözlü mikro levha ve perfore. Bu delikler sadece her iyi hava değişimi izin vermez, aynı zamanda bireysel bazda sinekler uyutmak için bir yol sağlayacaktır. Keskin bir bıçak ve straight edge kullanarak, her sütun arasında bir kesim tanıtmak. Bu bir seferde yüklemek / 8 kişilik gruplar halinde sinekler boşaltmak için kolay bir yol sağlar. Mikro plaka içine sinekler yüklemek için, bir CO 2 pad üzerinde kuvöz ve uyutmak sinekler şişeleri çıkarın. Yük sütun-by-sütunu, her iyi bir-tek uçar. Genellikle müdahalesi olmadan kurtulmaları mümkün olduğu gibi bir yapıştırıcı mühür takılıp yanlışlıkla uçması gerektiğini, yalnız sinek bırakın. 8-24 saat yeni ortama alışması için ve luciferase substrat tüketmek için LL olarak inkübatör Mikro plaka dön. </li><li> Kültür bakteriler, S. marcescens, ve yukarıda tarif edildiği gibi enfeksiyon için bir solüsyon hazırlanır. </li><li> Anesteziyoloji to bir düşük basınçlı CO2 hattına bağlı bir mikropipet ucu kullanarak uçuyor. Doğrudan her kuyu için yapılan havalandırma delikleri yukarıda mikropipet ucu yerleştirin. CO 2 basınç sinek uyuşturan için yeterince yüksek, ama sinek yaralanmasını önlemek için yeterince düşük olduğundan emin olmak için dikkatli atın. Sekiz gruplar halinde, ayrı ayrı bir CO2 ped için her bir uçucu aktarmak ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Enfeksiyon sonra, iyi orijinal her sinek dönmek ve mikroplak kapatın. </li><li> Tedbir lüminesans (TopCount-NXT Lüminesans ve Sintilasyon Sayıcı; Perkin-Elmer). TopCount lüminesans sayacı herhangi bir süre (genellikle en fazla beş gün) için istenilen aralıklarla sürekli olarak programlanmış ve otomatik okuma sağlayan plakalar için bir istifleme kaset içerir. Bu özellik, tüm enstrümanlar mevcut değildir, ve diğer enstrümanlar ile yapıldı deneyler için veri toplama dolayısıyla daha az sık olabilir. Işıldama sayacı bir ro housedkontrollü bir sıcaklık ve aydınlatma programı ile om. Istifleme kasete plakaları yüklerken, sinekler ışık almasını sağlamak için açık boş plakaları arasındaki sinekleri içeren plakalar yığını. Okumalar 24 saat en az saatte toplamak için üreticinin spesifikasyonlarına göre Programı luminometre. Bu örnekte, detektörler 10 saniye için her bir kuyu okumak için ve saniye başına sayımları (isteğe bağlı birimleri) sonuç olarak ifade etmek için programlanmıştır. Bu değer, kuyu başına 3 okumalar karşısında ortalaması alınır. Bir elektronik veri dosyalarını verme ve bir standart analiz, lüminesans sonuçlarının grafik. </li></ol>

<ol><li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li>
<li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7(2009).</li>
<li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+%28and+why%29+the+immune+system+makes+us+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305(2008).</li>
<li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).</li>
<li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li>
<li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).</li>
<li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li>
<li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li>
<li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila%3A+a+role+for+the+NFkappaB+relish%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li>
<li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li>
<li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li>
<li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relish%2C+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li>
<li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li>
<li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+immunity%3A+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I%7Bkappa%7DB+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3Awake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep%2C+aging%2C+and+lifespan+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllee%2C+WC+%22The+social+life+of+animals%22">The social life of animals</a>. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).</li>
<li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1(2002).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150(2009).</li>
<li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol davranış, özellikle uyku, bağışıklık yanıtı parametreleri nasıl bağlantılı olduğuna araştırmak için bir yaklaşım belirlemektedir. Bu parametreler in vivo bir lusiferaz muhabir tarafından ölçülen bakteri yükü, sağkalım sonuçları ve NFKB aktivite içerir. Birlikte bu parametreler bir sinek bir enfeksiyonla mücadele ne kadar iyi hakkında bilgi sağlar. Bakteriyel yük ve sağkalım sonuçları Drosophila basit ölçümü dahil bağışıklık yanıtı parametrelerdir. Yenik hızla bakteriyel enfeksiyona bağışıkl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> İnkübatörler </td><td> Percival Scientific, Inc </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Programlanmış ışık / sıcaklık programları çalıştıran herhangi inkübatör yeteneğine uygundur. </td></tr><tr><td> Drosophila Aktivite Monitörler </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Başka 6 açıklandığı gibi, bu sistem bir bilgisayar arayüzü, yazılım ve diğer aksesuarları gerektirir. </td></tr><tr><td> Pyrex Cam Tüpler </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka sintilasyon ve ışıldama sayacı </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 dedektör </td><td> Işıldama tespit etme yeteneğine sahip herhangi bir mikroplaka okuyucu haberci deneyi için bu tür de kullanılabilir. TopCount birden dedektörleri ve otomatik istifleyici içerir; birden plakaları sürekli okumak için programlanmış olma yeteneğine sahiptir. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Bakteri kültürlerinin Görüntüleme isteğe bağlıdır; görsel ışık kapasitesi ile herhangi bir dijital görüntüleme sistemi yeterlidir. </td></tr><tr><td> Mikropipet Çektirme </td><td> TriTech Research, Inc </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeleri </td></tr><tr><td> Borosilikat Cam Kapilerde </td><td> Dünya Precision Enstrüman A.Ş. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga İğneler </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - tüp zarar görmesini önlemek için iğne ucu kesilir. </td></tr><tr><td> Silikon Hortum, id (0.030 &quot;) od (0.065&quot;) Duvar Kalınlığı (0.018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Bir şırınga cam kılcal iğne takmak için kullanılır </td></tr><tr><td> 3 Yollu Musluk </td><td> Amerikan Pharmaseal Şirketi </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pelet Pestle Akülü Motor </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pelet Pestle </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Cam bilyalar 3mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select ışıldama için uygun olan levha 96-kuyu - onlar opak olması gerekir. </td></tr><tr><td> Topseal&#39;ın-A :96-iyi mikropleytin </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6005185 </td><td> Mikroplaka Basın-On Yapıştırıcı Sızdırmazlık Film </td></tr><tr><td> D-lusiferin, potasyum tuzu </td><td> Altın Biyoteknoloji, Inc </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Yazılım </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Yazarlara istek üzerine mevcuttur </td><td> özel; Lesley Ashmore, Ph.D. tarafından yazılmış (Westminster College) </td><td> Uyku 2,6,11 analizi için rutin kullanılır olmuştur Matlab tabanlı yazılım </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Yazarlara istek üzerine mevcuttur </td><td> özel; Thomas Coradetti (Kaldırım Yazılımı) tarafından yazılmış </td><td> Ham veri dosyaları hayatta kalma analizi için kullanılan bir bilgisayar programı MSVC6 ile toplanmışTrikinetics sistemi </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Kerpiç </td><td></td><td> Dijital görüntüler (isteğe bağlı) kob / plaka numaralarını almak için Faydalı </td></tr></tbody></table>

İmmün yanıt ve uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; drosophila</em

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Immün yanıtı ve konak davranış arasında karmaşık bir etkileşim tür geniş bir biçimde tarif edilmiştir. Aşırı uyku, özellikle, memelilerde 1 enfeksiyonuna yanıt olarak oluştuğu bilinmektedir ve ayrıca son zamanlarda Drosophila melanogaster 2&#39;de tarif edilmiştir. Bu, genel olarak uyku bir enfeksiyon sırasında ana için yararlı olan ve bir güçlü bağışıklık sistemi 3,4 korunması için önemli olduğu kabul edilir. Ancak, bu hipotezi destekleyen deneysel kanıtlar 4 sınırlıdır ve bir bağışıklık yanıtı sırasında aşırı uyku fonksiyonu belirsizdir. Biz bu karmaşık sorunu çözmek için multidisipliner bir yaklaşım kullanmış ve basit bir genetik model sistem, meyve sineği Drosophila melanogaster de çalışmalar yapmıştır. Biz, sinekler lokomotor davranışlar ve uyku ölçülmesi için bir standart tahlil kullanmak, ve bu tahlil sinekler infecte davranış ölçmek için nasıl kullanıldığını göstermekbir bakteri patojen d. Bu test aynı zamanda bir enfeksiyon sırasında bireysel sinekler sağkalım süresini izlemek için yararlıdır. Bağışıklık işlevi ek önlemler enfeksiyon ve NFKB, Drosophila doğal immün yanıtı için merkezi bir anahtar transkripsiyon faktörünün aktivasyonu temizlemek için sinekler yeteneğini içerir. Enfeksiyon sırasında sağkalım sonuçları ve bakteriyel klirense Hem birlikte direniş ve enfeksiyona hoşgörü göstergeleridir. Toleransı sistem 5 içinde patojen yüksek seviyelerde olmasına rağmen bir enfeksiyon hasarı sınırlamak ve böylece hayatta kalmak için ana yeteneği olarak tanımlanır iken Direniş, bir enfeksiyon temizlemek için sinekler yeteneğini ifade eder. Enfeksiyon sırasında NFKB faaliyet Gerçek zamanlı izleme enfeksiyon sırasında hayatta bir moleküler mekanizma fikir sağlar. Bu apaçık deneylerinde Drosophila kullanımı uyku genetik ve moleküler analizler kolaylaştırırve immün yanıt ve nasıl bu iki kompleks sistemlerin karşılıklı etkilenir.

<ol><li> Enfeksiyon uyku teşvik. Bu örnekte, Canton-S (CS), vahşi tip sinekler ve bir NFKB gen, Relish (İ E20) 14 eksik mutant sinekleri, iki DAM2 aktivite monitörleri dolduruldu (n = her bir genotip için 32) ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Sinekler davranış ve enfeksiyon 2,7,8 üzerinde sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sürekli ışık altında tutuldu. Daha önce anlatıldığı gibi 11 İ E20 mutant CS isogenized edildi. Sinekler Hem setleri S. ile enfek...

Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem tarif<em&gt; Drosophila</em&gt; Bakteriyel enfeksiyon yanı sıra izleme sağkalım, bakteri yükü, ve doğuştan gelen bağışıklık, NFKB önemli bir regülatör gerçek zamanlı aktivite ile bir bağışıklık yanıtı bağlamaya sinekler yeteneği sırasında.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

Bağışıklık yanıtı ile konakçı davranışı arasındaki karmaşık bir etkileşim, çok geniş bir tür yelpazesinde tanımlanmıştır. Özellikle aşırı uyku durumunun ... olduğu bilinmektedir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila'da uyku ve bağışıklık fonksiyonlarını değerlendirmektir. Bu öncelikle, uyku miktarını ölçmek için enfekte edilmiş sineklerin lokomotor aktivitesinin kaydedilmesiyle; ikinci adımda ise enfekte sineklerin homojenize edilip seyreltilerek LB agar plaklarına yayılmasıyla sağkalımın ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Üreyen koloni oluşturan birim sayısı, sineklerin enfeksiyonu temizleme yeteneğini gösterir.Ardından, NF kappa b lüsiferaz raporlayıcısını içeren bir transjen eksprese eden enfekte sinekler, lüsiferazın substratı olan luciferian içeren 96 kuyucuklu bir plakaya eklenir. Kappa b Lüsiferaz'ın gerçek zamanlı ölçümü, enfeksiyon sırasında bir NF kappa B sinyal yolunun aktivasyonunu ve genel olarak uykuyla ilişkili sağkalım sonucunu gösterir. Bakteriyel temizlenme ve NF KB raporlayıcı aktivitesi, bağışıklık fonksiyonu ile davranış arasındaki moleküler bağlantıya dair mekanistik içgörü sağlayan ölçümlerdir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan bireyler veya sineklere manuel olarak tutarlı bir şekilde nasıl enfeksiyon bulaştırılacağını öğrenmenin zaman ve pratik gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşarlar. Lucifer raporlu tekniğin QPCR gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, NF Kappa B aktivitesinin canlı sineklerde gerçek zamanlı olarak sürekli ölçülebilmesidir. Yetişkinlerin çevresel koşullara adapte olabilmesi için, geç pupa evresindeki drosophila kültürlerini üç ila dört gün boyunca inkube ederek başlayın.Burada, sirkadiyen saatin bağışıklık yanıtı ve davranış üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak için sinekler sabit ışık altına yerleştirilir. Ardından, bir ila dört günlük sinekler aktivite monitörlerine yüklenir. Monitörler, planlanan enfeksiyondan bir gün önce başlayarak, enfeksiyon öncesinde en az üç gün boyunca aktivitelerini kaydeder.Steril bir pipet ucuyla tek bir SIA kolonisi seçin ve steril tekniğini doğrulamak için ucu beş mililitre LB medyumu içeren bir kültür tüpüne daldırın. Bakterisiz bir kontrol yalancı kültür hazırlamayı unutmayın. Bakterileri, ertesi güne kadar eksponansiyel büyüme evresine ulaşana dek gece boyunca büyütün.Kültürün 600 nanometredeki absorbansını ölçün. İkinci bir Q vet'i kör olarak kullanın. Konsantrasyon 0,5 ile 1 absorbans ünitesi arasında olduğunda alt kültür için hazır hale gelir veya gerektiğinde kültür süresini uzatın.Şimdi sinekleri enfekte etmek için bakteri çözeltisini hazırlayın. Bakterileri, 600 nanometrede 0,1 beklenen absorbansa ulaşana kadar PBS ile seyreltin. Ardından, enjeksiyon kontrolü için gıda boyası ekleyin.Bakterileri LB besiyeri ile değiştirin. Her iki çözeltiyi de buz üzerinde saklayın. Ardından, bir mikro pipet çekici kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu enjeksiyon iğneleri hazırlayın.Sinek üzerindeki hasarı minimize edecek kadar küçük, ancak vakumlama yoluyla enjeksiyon sıvısının doldurulabileceği kadar geniş bir açıklık oluşturmak için her bir iğnenin ucunu ince bir pens ile kırın. Bir cam iğneyi, bir uzunluktaki tüp yardımıyla üç cc'lik plastik bir şırıngaya bağlayın. Enjeksiyon ortamının akışı manuel olarak kontrol edilir.Enjektör düzeneği hem enfeksiyöz hem de kontrol enjeksiyonları için kullanıldığından, kauçuk tüplerin enjeksiyon sıvısıyla kontamine olmasından kaçının. Enjeksiyon ortamının akışını bir Kim wipe mendil kullanarak doğrulayın. Başarılı enjeksiyonlar için iki kritik detay, optimal iğne boyutunun kullanılması ve iğne ile şırınga arasındaki sızdırmazlığın sağlanmasıdır.Enjeksiyon sistemi tamamen hazırlandığında, sinekleri düşük akışlı karbondioksit kullanarak anesteziye alın; hiçbir sineğin beş dakikadan daha uzun süre anestezi altında kalmaması için işlemleri hızlıca gerçekleştirin. Ardından, cam iğneyi dorsal toraksın scutellum bölgesinin üst kısmına batırarak sineklere enjeksiyon yapın. Enjeksiyon ortamının sineğe geçişi, enjekte edilen solüsyon yayıldıkça görülebilen gıda boyası ile doğrulanır.Başlamadan önce, bu prosedür için kullanılan tüm malzemelerin en az bir gün öncesinden otoklavlandığından emin olun. LV agar besiyeri ile 10 santimetrelik petri kaplarını hazırlayın. Deney gününde, sinekleri anestezi altına alarak 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin.Her bir deneysel koşul için, her birinde en az 10 sinek bulunan minimum iki grup hazırlayın. Özellikle antibiyotik direnci olmayan bir bakteriyel suş kullanırken, enfeksiyon uygulanmamış bir kontrol grubu sinekler de hazırlayın. Yükleme yapılmış tüm tüpleri buz üzerinde saklayın.Ardından, yüklü sinek tüplerinin her birine 400 µL LB besiyeri ekleyin. Kontaminasyonu önlemek için alev yakınında, küçük bir pestel kullanarak sinekleri homojenize edin. Şimdi, kesilmiş pipet uçlarını kullanarak homojenatı 200 µL'lik hacimlerde 10 kat seri dilüsyona tabi tutun.Homojenat, sia enfeksiyonundan hemen sonra hazırlanmışsa seyreltmeyi 1:1000'e kadar yapın; ancak enfeksiyondan 24 saat sonra hazırlanan homojenat için seyreltmeyi 1:100.000'e kadar yapın. Ardından, eşit bir dağılım sağlamak için cam bilyeler kullanarak en yüksek iki seyreltmeyi 10 santimetrelik plakalara ekleyin ve plakaları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plakalardaki koloni sayılarını doğrudan gözlem yoluyla veya koloni sayma yazılımı aracılığıyla sayın.Ardından, sinek başına düşen koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın. Bu analiz, uygun zamanda kappa b lusiferaz raporlayıcısını taşıyan transgenik sinekler kullanır. Analiz ayrıca, önceki bölümde açıklandığı şekilde enjeksiyon için hazırlanmış SCIA gibi kültürlenmiş bakteriler gerektirir.Sinekleri deneysel aydınlatma koşullarına adapte edin. Bu örnekte, bir ila dört günlük kappa b luciferase sinekleri %5 sükroz ve %2 agar içeren besiyeri bulunan viallerde tutulur ve iki gün boyunca sabit ışığa maruz bırakılır. Şimdi sinekler için bir 96 kuyucuklu mikroplaka hazırlayın.Her bir kuyucuğu iki katman gıda ile doldurun. Önce orta katman için, her birine 300 µL %5 sükroz, %2 agar çözeltisi ekleyin. Plakayı ince gözenekli bir bezle örtün ve plağın bir saate kadar iyice kurumasını bekleyin.Ardından, her kuyucuğa %5 sükroz, %1 agar ve iki milimolar Lucifer içeren 50 µL'lik bir üst katman ekleyin. Lucifer ışığa duyarlı olduğu için plakayı karanlıkta kurumaya bırakın ve bundan sonra plakanın ışığa maruz kalmasını en aza indirin.Agar soğuduktan sonra, plağı şeffaf yapışkan bir filmle kapatın. Ardından ince bir iğne kullanarak, her kuyucuğun üzerindeki filmi iki kez delin. Bu delikler hava alışverişini ve gazla anesteziyi sağlar.Ardından, sineklerin yerleştirilmesini kolaylaştırmak için keskin bir bıçak ve düz bir kenar kullanarak her sütun arasına bir kesik atın. Sinekleri karbondioksit ile anestezi edin ve her bir kuyucuğa sütun sütun, tek tek yerleştirin. Bir sinek filme yapışırsa, müdahale etmeden önce kendi başına kurtulması için ona fırsat tanıyın.Mikro kuyucuklu plakayı, sabit ışık altında sekiz ila 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Kuyucuklara hapsolmuş sinekleri anestezi altına almak için, düşük basınçlı karbondioksit hattına bağlı bir mikro pipet ucu kullanın. Gazın zararsız düzeyde düşük basınçta olduğundan emin olun ve sekizerli gruplar halindeki sinekleri tek tek anestezi altına almak için mikro pipet ucunu doğrudan havalandırma deliklerinin üzerine yerleştirin.Her bir sineği bir CO2 pedine aktarın ve daha önce yapıldığı gibi bakterilerle enfekte edin. Ardından her sineği orijinal kuyucuğuna geri koyun ve mikroplakayı yeniden mühürleyin. Sıcaklık kontrollü bir odada, belirlenmiş bir aydınlatma programı altında, bir lüminometre kullanarak her bir sinekteki lüminesansı ölçün.Sineklerin bulunduğu plakaların şeffaf boş plakalar arasına yerleştirildiğinden emin olarak plakaları istifleme kasetine yükleyin. Luminometreyi üretici spesifikasyonlarına göre programlayın ve minimum 24 saat boyunca her saat başı okumalar toplayın. Bu örnekte, dedektörler her kuyucuğu 10 saniye boyunca okuyacak şekilde programlanmıştır.İşlem tamamlandığında, veri dosyalarını bir hesap tablosuna aktarın ve sonuçları grafikleyerek standart bir analiz gerçekleştirin. Örnek veriler analiz edilebilir. Kuyu başına üç okumadan ortalaması alınan saniye başına düşen indirimler.Canton S yabani tip sinekler ve NF kappa B geni eksik olan relish. E 20 mutant sinekler, sabit ışık altında iki aktivite monitörüne yerleştirilmiş ve sia ile enfekte edilmiştir. Bu örnekte, enfeksiyon uykuyu teşvik etmiştir.Relish E 20 mutantlarının, enfeksiyondan sonra Canton s. kontrol sineklerine göre daha az uyudukları açıkça görülmüştü. Önceki bulgularla uyumlu olarak, relish E 20 mutantları ayrıca yabani tip sineklere kıyasla enfeksiyon nedeniyle hızla can verdi.Sineklerin çoğu aseptik kontrol enjeksiyonundan sağ kurtuldu; bu durum, sineklerin enjeksiyona bağlı yaralanmadan değil, enfeksiyondan dolayı öldüğünü göstermektedir. Relish mutantları çok hızlı öldüğü için, enfeksiyon sonrası bakteriyel yükü göstermek amacıyla sadece Canton s sinekleri kullanılmıştır. Sia, enfeksiyondan 24 saat sonra sinek içerisinde çoğalmaya devam etmiştir.Lusifer raporlayıcı aktivitesi, bireysel sinekler arasında ve veri noktalarının başarısı arasında geniş bir varyasyon gösterdi. Sinyal sineğin içindeki tüm dokulardan kaynaklansa da, her dokunun aynı miktarda sinyal yayması beklenmez ve sinek hareket ettikçe dokunun detektör tarafından görünürlüğü değişkenlik gösterir. Bu örnekte, sinekler enfekte edilmiş ve işlem görmüş bir kontrol grubuyla karşılaştırılmıştır.Sinek grubu genelinde ölen sinekler analiz dışında bırakılmıştır. Kappa b Luciferase reporter aktivitesi enfeksiyondan sonra sürekli olarak artmaktadır. Kappa b Luciferase reporter aktivitesi aseptik yaralanmadan sonra da sürekli artış göstermiştir.Zirve aktivite hem yaralanma sonrası hem de enfeksiyon sonrası için yaklaşık 12 saat civarındaydı. Bu videoyu izledikten sonra, enfeksiyon sonrası SSO'da bağışıklık fonksiyonunun ve uykunun nasıl nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uyku, sağkalım, süre, bakteriyel temizleme ve bir transkripsiyon raporlayıcısının gerçek zamanlı aktivitesini ölçebiliriz.

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz günlük lokomotor aktivite ritimleri kayıt için prosedürler...

Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila</em

Bu videoda, E. coli'yi  Drosophila melanogaster'in göğüs kafesine enjekte ettikten sonra E. coli bakteri yükünü ölçmek için bir teknik gösteriyoruz.

E. coli Enfeksiyonunu Takiben Drosophila melanogaster'de E. coli Bakteri Yükünün Ölçülmesi

Burada yüksek verimli tarama sağlayan, Drosophila uçuş performans hızlı ve doğru bir ölçümü için bir yöntem tarif eder.

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Burada, stresli bireylerin kaçınma durumunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu paradigma güçlü ancak kullanıcı dostudur ve Drosophila melanogaster'de genlerin ve çevrenin bir tür sosyal etkileşim üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

Sosyal Kaçınma Niceleme için Basit Testi Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster, doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini ve enfeksiyon ve hastalığın fizyolojik sonuçlarını incelemek için olağanüstü bir model organizmadır. Bu protokol, D. melanogaster'e sağlam ve kantitatif olarak tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonların nasıl sağlanacağını ve daha sonra enfeksiyon şiddetinin nasıl ölçüleceğini ve konak immün yanıtının nasıl ölçüleceğini açıklar.

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu rapor, TriKinetics Drosophila Activity Monitor kullanılarak Drosophila larva aktivitesini ölçmek için bir yöntemi açıklar. Cihaz, 16 adede kadar bireysel hayvanın hareketlerini algılamak için kızılötesi ışınlar kullanır. Veriler, oranlar ve hayvanların tahlil odaları içindeki konumları dahil olmak üzere hareket parametrelerini temsil etmek için analiz edilebilir.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Bu iletişim kuralı sözlü olarak ortaya çıkarmak ve bakteriyel patojenler ile meyve sineği Drosophila melanogaster bulaştırmak ve bağırsak enfeksiyonu takip bulaşıcı bakteri döken sayısını ölçmek için yöntemler açıklanır. Daha fazla sinek hayatta kalma sözlü bakteriyel enfeksiyonu takip bağışıklık mutantlar etkisini açıklar.

Bakteriyel enfeksiyon ve atma Drosophila melanogaster içinde sözlü

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Uyku yoksunluğu, uyku fonksiyonunu ve düzenlemesini araştırmak için güçlü bir araçtır. Uyku Nullifiye Aparatı'nı kullanarak Drosophila'yı uykudan yoksun bırakmak ve yoksunluğun neden olduğu ribaund uykusunun kapsamını belirlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Uyku Nullifiye Aparatı: Drosophila'dan Yoksun Uykunun Son Derece Verimli Bir Yöntemi

Sunulan, yaşlı bir Drosophila modelinde meyve sineklerinin uyku davranışını izleyerek uykuyu iyileştirmek için yüksek verimli ilaç taraması için bir protokoldür.

Drosophila melanogaster Kullanarak Yaşa Bağlı Uyku Bozuklukları İçin Yüksek Verimli Küçük Moleküllü İlaç Taraması

Bu protokol, Drosophila melanogaster'de stres kaynaklı davranış değişikliklerini değerlendirmek için bir çerçeve sağlar. Tamamlayıcı testlerin birleştirilmesi, bireysel sinekler için aktivite, keşif ve karar verme süreçlerinin nicelendirilmesini sağlar. Yaklaşım esnektir ve stres biyolojisi, metabolizması ve nörodavranışsal fonksiyonları inceleyen geniş bir çalışma yelpazesine uyarlanabilir.

Drosophila melanogaster'de Stres Kaynaklı Depresyona Benzer Durumların Çok Modlu Davranışsal Fenotiplenmesi

Keşfedin Drosophila'da bakteriyel enfeksiyon sırasında lokomotor aktivite ölçümüyle uyku ve immün fonksiyon arasındaki ilişkiyi. NFκB aktivasyonunu gerçek zamanlı izleyerek davranış ve bağışıklık arasındaki moleküler bağlantıları anlayın.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü

Daha fazla video keşfet