İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü Drosophila

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila'da uyku ve bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmektir. Bu ilk olarak, enfeksiyon sinekleri homojenize edildikten, seyreltildikten ve LB agar plakalarına yayıldıktan sonra ikinci bir adım olarak uyku ve sağkalımı ölçmek için enfekte sineklerin lokomotor aktivitesinin kaydedilmesiyle elde edilir. Büyüyen koloni oluşturan birimlerin sayısı, sineklerin enfeksiyonu temizleme yeteneğini gösterir.

Daha sonra, NF kappa b lusiferaz raportörünü içeren bir transgeni eksprese eden enfekte sinekler, lusiferazın substratı olan lusiferian içeren 96 oyuklu bir plakaya eklenir. Kappa b Lusiferaz'ın gerçek zamanlı ölçümü, enfeksiyon sırasında bir NF kappa B sinyal yolunun aktivasyonunu gösterir, tamamen uyku sağkalım sonucu. Bakteriyel klerens ve NF KB raportör aktivitesi, bağışıklık fonksiyonu ve davranış arasındaki moleküler bağlantıya mekanik bakış açısı sağlayan ölçümlerdir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan veya mücadele eden kişiler, sinekleri tutarlı bir şekilde manuel olarak nasıl enfekte edeceklerini öğrenmek zaman ve pratik gerektirdiğinden mücadele eder. Lucifer tarafından bildirilen tekniğin QPCR gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, NF Kappa B aktivitesinin yaşamda gerçek zamanlı olarak sürekli olarak ölçülebilmesidir. Sinekler Geç öğrenci aşamalı drosophila kültürlerini üç ila dört gün boyunca kuluçkaya yatırarak başlayın, böylece yetişkinler çevresel koşullara uyum sağlar.

Burada sinekler, sirkadiyen saatin bağışıklık tepkisi ve davranışı üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak için sabit ışık altına yerleştirilir. Daha sonra aktiviteye bir ila dört günlük sinekler yükleyin. Monitörler, planlanan enfeksiyondan bir gün önce enfeksiyondan en az üç gün önce aktivitelerini kaydeder.

Steril bir pipet ucu ile tek bir SIA kolonisi seçin ve steril tekniği doğrulamak için ucu beş mililitre LB ortamı içeren bir kültür tüpüne daldırın. Bakteri içermeyen bir kontrol mock kültürü yapmayı unutmayın. Ertesi gün üstel büyüme aşamasına ulaşana kadar gece boyunca bakteri büyütün.

Kültürün absorbansını 600 nanometrede ölçün. Boş olarak ikinci bir Q veterineri ekleyin. Konsantrasyon 0.5 ila bir absorbans birimi alt kültürü arasında olduğunda veya kültür süresini gerektiği gibi uzattığında hazırdır.

Şimdi sinekleri enfekte etmek için bakteri çözeltisini hazırlayın. Bakterileri PBS ile 600 nanometrede 0.1'lik beklenen bir absorbansa seyreltin. Ardından enjeksiyon kontrolü için gıda boyası ekleyin.

Bakterileri LB ortamı ile değiştirin. Her iki çözeltiyi de buz üzerinde saklayın. Daha sonra, bir mikro pipet çektirmesi kullanarak, diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu enjeksiyon iğneleri yapın.

Her iğnenin ucunu kırmak için ince forseps kullanın, böylece açıklık emme kullanılarak enjeksiyon sıvısı ile doldurulacak kadar büyük, aynı zamanda sineğin zarar görmesini en aza indirecek kadar küçük olur. Şırıngayı kullanarak uzun bir boru uzunluğuna sahip üç cc'lik plastik bir şırıngaya bir cam iğne takın. Enjeksiyon ortamının akışı manuel olarak kontrol edilir.

Şırınga aparatı hem enfektif hem de kontrol enjeksiyonu için kullanıldığından, kauçuk boruyu enjeksiyon sıvısı ile kirletmekten kaçının. Kim silme mendili kullanarak enjeksiyon ortamının akışını doğrulayın. Başarılı enjeksiyonlar için iki kritik detay, optimum iğne boyutunun ve iğne ile şırınga arasındaki güvenli sızdırmazlığın kullanılmasıdır.

Enjeksiyon sistemi tamamen hazırlandıktan sonra, minimum karbondioksit akışı kullanarak sinekleri uyuşturun, hızlı bir şekilde ilerleyin, böylece sinekler beş dakikadan daha uzun süre uyuşturulmaz. Şimdi cam iğneyi dorsal toraksın çarpık tellumunun üzerindeki bölgeye sokarak sinekleri enjekte edin. Enjeksiyon ortamının sineğe geçişi, enjekte edilen çözelti yayılırken görülebilen gıda boyası ile doğrulanır.

Başlamadan önce, bu prosedür için kullanılan tüm malzemelerin en az bir gün önceden otoklavlandığından emin olun. LV agar ortamı ile 10 santimetre petri kapları hazırlayın. Deney günü, sinekleri uyuşturun ve 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin.

Deney koşulu başına her biri 10 sinekten oluşan en az iki grup hazırlayın. Ayrıca, özellikle antibiyotik direnci olmayan bir bakteri suşu kullanırken, enfeksiyonu olmayan bir sinek kontrol grubu hazırlayın. Yüklenen tüm tüpleri buz üzerinde saklayın.

Daha sonra, her sinek yüklü tüpe 400 mikrolitre LB ortamı ekleyin. Sinekleri küçük bir kabuk kullanarak homojenize edin ve kontaminasyonu önlemek için bunu bir alevin yanında yapın. Şimdi kesilmiş pipet uçlarını kullanarak, homojenatı 200 mikrolitrelik hacimlerde 10 kat ile seri olarak seyreltin.

Homojenat sia ile enfeksiyondan hemen sonra yapılırsa, bir ila 1000'e kadar dilu yapın, ancak 24 saat boyunca enfeksiyon sonrası homojenat, 100.000'e kadar yapın. Bir sonraki tohum, eşit bir dağılım sağlamak için cam toplar kullanarak 10 santimetrelik plakalar üzerindeki en büyük iki dilu, plakaları gece boyunca kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, doğrudan gözlem veya koloni sayma yazılımı aracılığıyla plakadaki koloni sayılarını sayın.

Daha sonra sinek başına koloni oluşturan birimlerin sayısını hesaplayın. Bu tahlil, uygun zamanda kappa b lusiferaz raportörünü taşıyan transgenik sinekleri kullanır. Test ayrıca, önceki bölümde açıklandığı gibi enjeksiyon için hazırlanan SCIA gibi kültürlenmiş bakterileri de gerektirir.

Sinekleri deneysel aydınlatma koşullarına göre ayarlayın. Bu örnekte, bir ila dört günlük kappa b lusiferaz sinekleri, %5 sakaroz, %2 agar gıda ortamı içeren şişelere yerleştirilir ve iki gün boyunca sabit ışıkta tutulur. Şimdi sinekler için 96 Kuyulu bir mikroplaka hazırlayın.

Her kuyuyu iki kat yiyecekle doldurun. Orta önce, her birine 300 mikrolitre% 5 sükroz,% 2 agar çözeltisi ekleyin. Plakayı ince bir ağ bezle örtün ve plakanın bir saate kadar iyice kurumasını bekleyin.

Daha sonra, %5 sakaroz, %1 agar ve iki milimolar Lucifer içeren her bir oyuğa 50 mikrolitrelik bir üst tabaka ekleyin. Lucifer ışığa duyarlı olduğundan, plakanın karanlıkta kurumasına ve ilerlemesine izin verin. Plakanın ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

Agar soğuduktan sonra plakayı şeffaf yapışkan film ile kaplayın. Daha sonra ince bir iğne kullanarak, filmi her bir oyuğun üzerine iki kez delin. Bu delikler hava değişimine ve gazlı anesteziye izin verir.

Ardından, sinek yüklemesini kolaylaştırmak için, her sütun arasına bir kesim yapmak için keskin bir bıçak ve düz kenar kullanın. Sinekleri karbondioksit ile uyuşturun ve her bir kuyucuğa tek tek sütun yükleyin. Filme bir sinek yapışırsa, müdahale etmeden önce ona kendini serbest bırakması için bir fırsat verin.

Mikro kuyucuk plakasını sekiz ila 24 saat boyunca sabit ışık altında inkübatöre geri koyun. İyi bağlanmış sinekleri uyuşturmak için, düşük basınçlı bir karbondioksit hattına bağlı bir mikro pipet ucu kullanın. Gazın zararsız derecede düşük basınçta olduğundan emin olun ve bir sineği ayrı ayrı sekiz kişilik gruplar halinde uyuşturmak için mikro pipet ucunu doğrudan havalandırma deliklerinin üzerine yerleştirin.

Her sineği bir CO2 pedine aktarın ve daha önce olduğu gibi bakterilerle enfekte edin. Ardından her sineği orijinal kuyucuğuna geri koyun ve mikroplakayı tekrar kapatın. Tanımlanmış bir aydınlatma programı altında sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirilmiş bir luminometre kullanarak her uçuştaki lüminesansı ölçün.

Plakaları istifleme kasetine yerleştirin ve sinekleri içeren plakaları şeffaf boş plakalar arasında istiflediğinizden emin olun. Luminometreyi üreticinin spesifikasyonlarına göre programlayın ve en az 24 saat boyunca her saat başı okumaları toplayın. Bu örnekte, dedektörler her bir kuyuyu 10 saniye boyunca okuyacak şekilde programlanmıştır.

Tamamlandığında, veri dosyalarını bir elektronik tabloya aktarın ve sonuçların grafiğini çizen standart bir analiz gerçekleştirin. Örnek veriler analiz edilebilir. Saniye başına indirimler, kuyu başına üç okumadan ortalama olarak alınmıştır.

Kanton S vahşi tipi uçar ve zevk alır. NF kappa B geninde bulunmayan E 20 mutant sinek, sabit ışıkta iki aktivite monitörüne yüklendi ve sia ile enfekte edildi. Bu örnekte, enfeksiyon uykuyu teşvik etti.

Relish E 20 mutantlarının Canton s'dan daha az uyku yaşadığı açıktı. Kontrol enfeksiyondan sonra uçar. Önceki bulgularla tutarlı olarak, lezzet E 20 mutantları, vahşi tip sineklere kıyasla enfeksiyona hızla yenik düştü.

Sineklerin çoğu aseptik kontrol enjeksiyonundan kurtuldu, bu da sineklerin enjeksiyona bağlı yaralanmaya değil, enfeksiyona yenik düştüğünü gösteriyor. Lezzet mutantları çok çabuk öldüğü için, enfeksiyondan sonra bakteri yükünü göstermek için sadece Kanton sinekleri kullanıldı. Sia, enfeksiyondan 24 saat sonra sineklerde çoğalmaya devam etti.

Lucifer'in muhabir etkinliği, bireysel sinekler arasında ve veri noktalarının başarısı arasında büyük farklılıklar gösterdi. Sinyal, sinek içindeki tüm dokulardan elde edilmesine rağmen, her dokunun aynı miktarda sinyal yayması ve dokunun dedektöre görünürlüğünün sinek hareket ettikçe değişmesi beklenmez. Bu örnekte, sinekler enfekte edildi ve ele alınan bir kontrol grubu ile karşılaştırıldı.

Ölen sinekler, bir grup sinek arasında analizden çıkarıldı. Kappa b Luciferaz raportör aktivitesi enfeksiyondan sonra istikrarlı bir şekilde artar. Kappa b Luciferaz muhabirinin aktivitesi de aseptik yaralanmadan sonra istikrarlı bir şekilde arttı.

En yüksek aktivite, hem yaralanma sonrası hem de enfeksiyon sonrası için yaklaşık 12 saat idi. Bu videoyu izledikten sonra, enfeksiyondan sonra SSO'da bağışıklık fonksiyonunu ve uykuyu nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Uykuyu, hayatta kalmayı, zamanı, bakteri temizlemeyi ve bir uncopy transkripsiyon muhabirinin gerçek zamanlı aktivitesini ölçebiliriz.