Genom çapında Gen Delesyonlar içinde

Bu prosedürün genel amacı, yüksek verimli PCR aracılığıyla streptococcus sanguine türünde genom genelinde tek gen delesyonları gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle antibiyotik direnç geni ile hedef genin yukarı akış ve aşağı akış DNA dizilerini içeren üç amplikonun yüksek verimli PCR amplifikasyonu ile elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, üç PCR amplikonunu kalıp olarak kullanarak lineer rekombinant PCR amplikonunun elde edilmesidir.

Ardından, yetkin s sanguine hücreleri hazırlanır. Son adım, lineer rekombinant PCR amplikonunun yetkin s sanguineous hücrelerine transforme edilmesidir. Nihayetinde, doğru mutantları doğrulamak için kolon A PCR amplifikasyonu ve DNA dizilemesi kullanılır.

Bu tekniğin, intihar plazmidi nakavt gibi tükenmiş diğer yöntemlere göre temel avantajı, yüksek verimli bir şekilde doğrudan genom genelinde delesyon mutantları oluşturabilmesidir. PCR primerleri, streptococcus sanguineous SK 36 genom dizisine dayalı kurum içi betikler kullanılarak, yazılı protokolde açıklandığı şekilde tasarlanabilir ve sentezlenebilir. Hedef genin bir kilobazlık yukarı akış dizisinin, A PHA üç gen ENC kodlamasının, kanamisin direnç proteininin ve hedef genin bir kilobazlık aşağı akış dizisinin amplifikasyonu için üç set primer tasarlanmıştır.

Gene spesifik primerler. R1 ve F3, hedef s sanguine genlerinin 1 kilobazlık üst akış veya alt akış bölgesini yüksek verimle amplifiye etmek için hedef genin beş prime ve üç prime dizilimlerine göre tasarlanmıştır. İlk olarak, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde buz üzerinde bir PCR kokteyl karışımı hazırlayın.

s sanguineous genomik DNA içeren PCR karışımının bileşenleri için metne bakınız; çok kanallı bir pipet kullanarak karışımın 23 µL'sini 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna aktarın. Hedef genin upstream dizisi için, çok kanallı pipet kullanarak 10 µM'lık çalışma primer plakalarından F1 ve R1 primerlerinden birer µL'yi PCR plakasına aktarın. Hedef genin downstream dizisini amplifiye etmek için aynı işlemi F3 ve R3 primerleri ile tekrarlayın. PCR plakasını mühürleyin ve önce 94 °C'de bir dakika, ardından 94 °C'de 30 saniye şeklinde 30 döngü boyunca amplifikasyonu gerçekleştirin.

30 saniye boyunca 54 °C ve 1,5 dakika boyunca 68 °C. Amplifikasyonun ardından, çok kanallı pipet yüklemesine uygun 48 kuyucuklu ve uygun bir bromür içeren %1'lik agaroz jel hazırlayın. Dört µL PCR ürününü, bir µL 5X DNA yükleme tamponu ile karıştırın.

96 kuyucuklu bir plakada, 10 µL'lik çok kanallı pipetler kullanarak örnekleri aros jel üzerine yükleyin. Elektroforezi 135 volt'ta 30 dakika boyunca çalıştırın. Jel üzerindeki bandı bir UVP dokümantasyon ve analiz sistemi altında inceleyin.

PCR ürünlerini, DNA elüsyonu için üretici talimatlarına uygun olarak santrifüj yardımıyla pure link 96 PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın. Bağlama plakasının her kuyucuğuna 40 µL steril çift distile su ekleyin. DNA konsantrasyonlarını incelemek için plakadaki saflaştırılmış amplikonlardan rastgele birkaçını seçin.

Bir NanoDrop spektrofotometresi kullanarak, plaka üzerindeki amplikonların konsantrasyonunu yaklaşık olarak 10 nanogram per microliter seviyesine ayarlayın. Ardından, PCR şablonu olarak hizmet edebilmesi için kanamisin direnç kasetini içeren bir plazmidi sindirmek üzere eco R one kullanın. Sindirilmiş plazmidi kayak quick PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın ve lineer plazmid DNA'sını 10 nanogram per microliter nihai DNA konsantrasyonuna ayarlayın.

Yazılı prosedürde listelenen F two ve R two primerlerini içerecek şekilde, kanamisin direnç Kasedi amplikonu için 25 microliter PCR karışımı hazırlayın. Bu videoyu takip ederek, burada belirtilen talimatlara göre PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin. PCR ürününü incelemek için %1'lik agaroz jelde jel elektroforezi yapın.

Ardından, 10 PCR saflaştırılmış bireyden elde edilen yüksek miktardaki cany direnç kaseti amplikonlarını birleştirin. Amplikon konsantrasyonunu 10 nanograms per microliter seviyesine ayarlayın. Bu prosedürün en zor olan tek aşaması, üç PCR aplikant t'sinden nihai lineer kompetan PCR aplikantını elde etmektir.

Başarıyı sağlamak için, üç PCR aplikant konsantrasyonu neredeyse eşit miktarlara ayarlanır. Üç adet 10 nanogram per microliter PCR solüsyonundan birer mikrolitre ile PCR kalıbını bir PCR plağında birleştirin. Ardından, yazılı prosedürde listelenen F1 ve R üç primerini de içerecek şekilde PCR karışımını hazırlayın.

Ardından, örneklerin PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin. PCR amplikonlarının saflaştırılması ve miktar tayini sonrası PCR amplikonlarını agaroz jel üzerinde inceleyin. Daha önce yapıldığı gibi, yeniden birleştirilen PCR amplikonlarını -20 °C'de dondurun.

Başlamak için, bu videoya eşlik eden yazılı prosedürde belirtildiği şekilde Todd Hewitt ve at serumlu besiyeri hazırlayın; iki adet 15 mL'lik konik tüpe sırasıyla 2 mL ve 10 mL besiyeri paylaştırın. -80 °C'de dondurulmuş ve çözülmüş 5 µL S. sanguine SK 36 stok kültürünü, 2 mL besiyerine inoküle edin. Sıkıca kapatılmış kültürü gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

Ayrıca, gece boyunca süren inkübasyonun ardından 10 mililitrelik besiyeri tüpünü de aynı koşullar altında ön inkübasyona tabi tutun. Kültürden 50 mikrolitreyi 10 mililitrelik besiyeri tüpüne aktarın. Tüpü 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun hemen ardından, 96 kuyucuklu bir blok üzerindeki tüplere iki mikrolitre 70 nanogram s sanguineous, SK 36 kompetans uyarıcı peptit ve iki mikrolitre lineer rekombinant PCR amplikonu ekleyin ve bunları 37 °C'de ön ısıtmaya tabi tutun. Üç saat boyunca inkübe edilmiş SK 36 kültüründen her bir tüpe 330 mikrolitre aktarın. Kontrol olarak DNA yerine steril çift distile su kullanın.

Kuluçka işleminin ardından tüpleri bir saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bloğu buz üzerine yerleştirin ve her bir transformasyonun 100 µL'sini, 500 µg/mL kanamisin içeren beyin kalp infüzyonu veya BHI agar plaklarına yayın; plakları mikroaerofilik koşullar altında iki gün boyunca 37 °C'de inkübe edin. Her bir yer değiştirme mutandı için rastgele iki adet tekil koloni seçin ve her bir koloniyi, 500 µg/mL kanamisin içeren 5 mL BHI içerisine inoküle edin. Her bir inokülümü mikroanaerobik koşullar altında gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

Her kültürü %30 gliserol ile -80 °C'de kriyoprezerve edin. Mutantın beklenen gen değişimini içerip içermediğini incelemek için, 96 kuyucuklu bir PCR plakası kullanarak her mutant için F1 ve R3 primerleri ile koloni PCR'ı gerçekleştirin.

Her bir bireysel koloniden yaklaşık 1 µL gece boyu kültürü, 25 µL'lik bir PCR amplifikasyon reaksiyonunda DNA kalıbı olarak kullanın. Çift bantlı mutantları veya kontaminant PCR amplikonlarını kesin olarak tanımlamak için mutant gen değişimini doğrulamak amacıyla PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin. PCR amplikonunu, 12 cm'den daha uzun bir jelde dört saat boyunca jel elektroforezi ile inceleyin.

Bu agaroz jel elektroforezi koşulu altında, bromür boyamalı %2'lik agaroz jel kullanılmıştır. 100 baz çifti veya daha fazla farka sahip olan amplikonlar net bir şekilde tanımlanabilir. Alternatif olarak, kanamisin direnç kasetinin ve vahşi tip genin amplifikasyonundan kaynaklanan bantların 100 baz çiftinden daha az farklılık göstermesinin beklendiği durumlarda, PCR ile vahşi tip genin saptanıp saptanamayacağını belirlemek için hedef genin dahili bir T1 primeri kullanın.

Silinmeyi daha fazla doğrulamak için, amplikonları pure link 96 PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın ve kanamisin direnç kasetine bağlanan P one primeri ile dizileme yapın; üst akış sekansı için F1 ve R one primerleri ile alt akış sekansı için F three ve R three primerleri kullanılarak gerçekleştirilen PCR amplifikasyonu sonrası dizileme ile doğrulanan yalnızca doğru mutantları saklayın. Her bir s sanguineous geninin yaklaşık bir kilobazlık üst ve alt akış bölgeleri, PCR koşulları altında ve tasarlanan primerler kullanılarak 96 kuyucuklu formatta elde edilmiştir.

Her bir PCR reaksiyonunda s sanguineous genomik DNA'sından spesifik bir ürün amplifiye edilmiş olup; F1 ve R3 primerleri kullanılarak yapılan PCR yeniden amplifikasyonunda üç amplikonun DNA şablonu olarak kullanılmasıyla, primerlerin s sanguine hedeflerine karşı oldukça spesifik olduğu gösterilmiştir. Doğrusal rekombinant PCR konstrüktleri yüksek verimle oluşturulmuştur. Her bir hedef genin yukarı akış bölgesinden, bir cany kasetinden ve ardından her bir hedef genin aşağı akış bölgesinden oluşan bir düzende, 96 kuyucuklu plakada hazırlanan rekombinant PCR konstrüktleri daha sonra s sanguine SK 36'ya transforme edilmiş ve BHI agar plaklarında cany ile seçilmiştir.

Transformasyonların çoğunda, iki günlük mikro aerobik inkübasyonun ardından her plakta 1000'den fazla koloni elde edildi. Bu koloniler F1 ve R üç kullanılarak PCR ile çoğaltıldığında, potansiyel esansiyel genleri silme girişimi sırasında jel elektroforezi ile beklenen mutant boyutuna karşılık gelen tek bir DNA bandı gözlemlendi. Bazı esansiyel genlerin silinmesi için yapılan transformasyonların çoğunda koloni elde edilmemesi gerekir.

Buna rağmen, bu kolonların F1 ve R primerleri kullanılarak PCR amplifikasyonundan sonra transformasyon sonucunda kolonlar elde edildi ve jel elektroforezi ile incelendiğinde, beklenen mutant boyutuna ve vahşi tip boyutuna karşılık gelen üç adet 2D NA bandı görüldü. Bazı mutantlar için, PCR amplikonunun beklenen mutant boyutu ile vahşi tip boyutu, uzun agaroz jel ile ayrılabilecek kadar farklı değildi. Bu durumda, hedef genin vahşi tip gen dizilimine dayanarak dahili bir T one primeri tasarlandı.

PCR işlemi, internal T one primeri ve F1 primeri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu PCR için pozitif kontrol suşu olarak yabani tip SK 36 kullanılmıştır. Eğer mutanttan internal primer kullanılarak beklenen boyutta bir bant amplifiye edildiyse, gen esansiyel bir gen olarak tanımlanmıştır.

Mutantta kanamisin kasetinin varlığı, daha önce P1 primeri kullanılarak yapılan DNA dizilemesi ile doğrulanmıştır. Bu protokol temel alınarak, diğer açık okuma çerçevelerinin tamamen içinde yer alan dört açık okuma çerçevesi hariç tutulmak üzere, 2048 esansiyel olmayan S. sanguineus gen mutantı toplanmıştır.

Deneysel koşullar altında, s sanguine hayatta kalması için temel teşkil eden 218 gen tanımlanmıştır. Bu videoları izledikten sonra, yüksek verimli PCR kullanarak genom genelinde gen iyonizasyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olduğunuzu düşünüyorum.