Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma

Bu prosedürün genel amacı, canlı kardiyak melanosit benzeri hücreleri fare kalbinden izole etmektir. Bu, ilk olarak ötenazi uygulanmış farelerden kalplerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, enzimatik sindirim ve mekanik ajitasyon kullanarak kalpleri kıymak ve hücreleri ayrıştırmaktır.

Daha sonra, hücrelerin bulamacı santrifüjlenir ve kardiyomiyositleri ve melanosit benzeri hücreleri içeren pelet tekrar askıya alınır. Son adım tabaklama ve kültürdür. Sonuçta izole edilen kardiyak melanosit benzeri hücreler, hücresel uyarılabilirliği veya transkriptomun durumunu değerlendirmek için patofizyolojik stresöre yanıt olarak yama çalışmaları veya mikrodizi analizi için kullanılabilir.

Bu tekniğin, kardiyomiyositleri izole etmek ve kültürlemek için tasarlanmış mevcut yönteme göre en büyük avantajı, birçok giyilebilir kardiyak melanosit benzeri hücrenin izolasyonu ile sonuçlanmasıdır. Bu yöntem için ilk fikrimiz, yeni bir hücre popülasyonu keşfettiğimizde, fare kalbi ve fizyolojisini araştırmak istediğimizde aklımıza geldi. Başlamak için, biri kalpleri incelemek ve diğeri dokuyu kıymak için olmak üzere iki set sterilize edilmiş cerrahi alet hazırlayın.

Daha sonra, ortam takviyelerini hazırlayın, ancak hücreleri kaplamadan hemen öncesine kadar bunları kültür ortamına eklemek için bekleyin. Bir doku kültürü başlığında çalışırken çözeltiyi sterilize etmek için kültür ortamı filtresini hazırladıktan sonra, ortamı dört santigrat derecede saklayın. % 10 FBS artı antibiyotik ile 0.05 gram DNA, bir ila 100 mililitre DPBS ekleyerek DNA'nın bir çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra, 100 mililitre DPBS artı antibiyotiğe 0,5 gram tripsin ekleyerek% 0,5'lik bir tryin çözeltisi hazırlayın. Son olarak, Petri kapları, 50 mililitrelik konik tüpler, 40 mikron hücre süzgeçleri, DPBS artı antibiyotikler, 60 milimetre ve 35 milimetre kültür kapları dahil olmak üzere prosedürü tamamlamak için gereken diğer ekipmanları bir araya getirin. P sıfırdan P'ye iki yenidoğan fare yavrusuna ötenazi yaptıktan sonra, göğüslerini alkolle silin ve 10 santimetrelik bir P iki tabağa yerleştirin DPBS stereo mikroskop altında çalışırken, göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve kulakçık takılıyken tüm kalbi çıkarın.

Kalpleri DPBS'de yıkayın ve 10 santimetrelik yeni bir Petri kabına aktarın. Eksize edilmiş kalplerin bulunduğu Petri kabını bir doku kültürü başlığına taşıyın ve aşağıdaki adımlar için steril tekniği izleyin. İlk olarak, kalpleri steril DPBS artı antibiyotiklerle üç kez yıkayın.

Kalpleri 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve çözeltiye altı ila sekiz mililitre% 0.5 ekleyin. Daha sonra, kalpleri küçük parçalar halinde kesin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, elde edilen çözeltiyi tabaktan steril 10 mililitrelik konik bir tüpe çekin.

10 mililitrelik steril bir pipet kullanarak, çözeltiyi 30 ila 50 kez hızlı ama nazikçe yeniden derecelendirin, elde edilen süspansiyonu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni ve temiz 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Santrifüjlemeden sonra, supinatı nazikçe aspire edin ve kalan peleti altı ila sekiz mililitre steril DPBS içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.

Santrifüjlemeden sonraki üçüncü durulamayı takiben, yıkama solüsyonunu dikkatlice boşaltın veya aspire edin ve peleti altı mililitre takviye edilmiş kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi steril bir transfer pipetine çekin ve hücreleri 35 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Bir gece inkübasyondan sonra izole edilmiş kardiyak hücreleri üç yenidoğan faresinden çekin, bağlanmamış hücrelerle birlikte kültür ortamını aspire edin ve ardından plakaları bir kez DPBS ile durulayın, plakalara taze ortam ekleyin ve ortamı değiştirin.

Her iki günde bir, yenidoğan veya embriyonik kalplerden izole edilen hücreler kültürde üç haftaya kadar tutulabilirken, yetişkin kalplerden izole edilen hücreler kültürde 10 güne kadar tutulabilir. Yetişkin bir fare kalbinden melanosit benzeri hücreleri izole etmek için, önce eksize edilen kalpleri bir doku kültürü başlığında antibiyotik içeren steril DPBS'de yıkayın. Kalan kanı çıkarmak için kalbi kavisli diseksiyon forsepsleriyle hafifçe sıkın ve ardından kalbi DPBS'de bir kez daha durulayın.

Daha sonra, kulakçık ve atriyal ventriküler anulusu kalplerden çıkarın ve ekzomis doku örneklerini 35 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Kavisli makas ve forseps kullanarak kalpleri küçük parçalar halinde kesin. Tabağa çözelti içinde altı ila sekiz mililitre% 0.5 trip ekleyin ve 45 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, daha önce yetişkin kardiyak hücrelerin ve plakaların bir süspansiyonunu elde etmek için daha önce gösterilen adımları tekrarlayın. Bu örnekte, beyaz ok her iki paneldeki kardiyak melanositi tanımlar. Floresan işaretleyicinin yardımı olmadan, kardiyak melanositin tabağa bağlı atriyal miyositlerden tanımlanmasının ve ayırt edilmesinin zor olduğunu, açık mavi ok ucunun burada gösterilen tabağa iyi bağlanmamış atriyal hücrelere işaret ettiğini, sağlıklı bir kardiyak melanositin yenidoğan fare kalbinden izole edildiğini unutmayın.

Geniş dendritik süreçler geliştirdiler ve kutanöz melanositlere çok benziyorlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa birkaç saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı melanosit hücrelerini kalpten nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu, fizyolojik ve moleküler analiz için uygun olacaktır.