Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma

Bu prosedürün genel amacı, fare kalbinden canlı kardiyak melanosite benzer hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle ötanazi uygulanmış farelerden kalplerin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise kalpler ince kıyılır ve enzimatik sindirim ile mekanik ajitasyon kullanılarak hücreler ayrıştırılır.

Ardından, hücre süspansiyonu santrifüjlenir ve kardiyomiyositler ile melanosit benzeri hücreleri içeren pelet yeniden süspanse edilir. Son adım, hücrelerin ekilmesi ve kültüre edilmesidir. Nihayetinde izole edilen kardiyak melanosit benzeri hücreler, hücresel uyarılabilirliği veya transkriptomun durumunu değerlendirmek amacıyla, patofizyolojik stresörlere yanıt olarak yama çalışmaları veya mikroarray analizleri için kullanılabilir.

Bu tekniğin, kardiyomiyositleri izole etmek ve kültüre etmek için tasarlanmış mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda işlevsel kardiyak melanosit benzeri hücrenin izole edilmesini sağlamasıdır. Aslında bu yöntem için ilk fikri, fare kalbinde yeni bir hücre popülasyonu keşfettiğimizde ve bunun fizyolojisini araştırmak istediğimizde edindik. Başlamak için, biri kalpleri çıkarmak ve diğeri dokuyu kıymak için kullanılacak iki set steril cerrahi alet hazırlayın.

Ardından, besiyeri takviyelerini hazırlayın ancak hücreleri ekim yapmadan hemen öncesine kadar bunları kültür besiyerine eklemeyin. Bir doku kültürü önlemi altında çalışırken çözeltiyi sterilize etmek için kültür besiyerini hazırlayıp filtreledikten sonra, besiyerini dört derece Celsius'ta saklayın. 0,05 gram DNA's, one'ı, %10 FBS ve antibiyotikli 100 mililitre DPBS'ye ekleyerek DNA's, one çözeltisini hazırlayın.

Ardından, 100 mililitre antibiyotikli DPBS'ye 0,5 gram tripsin ekleyerek %0,5'lik bir tripsin çözeltisi hazırlayın. Son olarak, Petri kapları, 50 mililitrelik konik tüpler, 40 mikron hücre süzgeçleri, antibiyotikli DPBS, 60 milimetrelik ve 35 milimetrelik kültür kapları dahil olmak üzere prosedürü tamamlamak için gerekli diğer ekipmanları bir araya getirin. P0 ile P2 arasındaki neonatal fare yavruları ötanize edildikten sonra, göğüs bölgelerini alkol ile silin ve bir stereo mikroskop altında çalışarak 10 santimetrelik bir P2 kabındaki DPBS içine yerleştirin; göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve tüm kalbi atriyumlar ekli haldeyken çıkarın.

Kalpleri DPBS ile yıkayın ve yeni bir 10 santimetre Petri kabına aktarın. Çıkarılmış kalplerin bulunduğu Petri kabını bir doku kültürü kabinine taşıyın ve sonraki adımlar için steril tekniği uygulayın. İlk olarak, kalpleri antibiyotikli steril DPBS ile üç kez yıkayın.

Kalpleri 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve altı ila sekiz mililitre %0,5 tripsin çözeltisi ekleyin. Ardından, kalpleri küçük parçalara bölün ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, kapta oluşan çözeltiyi steril bir 10 mililitrelik konik tüpe çekin.

10 mililitrelik steril bir pipet kullanarak çözeltiyi hızlı ancak nazikçe 30 ila 50 kez tekrar pipetleyin, elde edilen süspansiyonu 40 mikronluk bir hücre süzgeci aracılığıyla yeni, temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe filtreleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı nazikçe aspire edin ve kalan peleti altı ila sekiz mililitre steril DPBS içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.

Santrifüj sonrası üçüncü yıkamayı takiben, yıkama solüsyonunu dikkatlice boşaltın veya aspire edin ve peleti altı mililitre takviyeli kültür medyumu içinde yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen solüsyonu steril bir transfer pipetiyle çekin ve hücreleri 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından üç neonatal fareden izole edilen kardiyak hücreleri alın, yapışmamış hücrelerle birlikte kültür medyumunu aspire edin ve ardından plakaları bir kez DPBS ile yıkayın, plakalara taze medyum ekleyin ve medyumu yenileyin.

Neonatal veya embriyonik kalplerden izole edilen hücreler, iki günde bir besiyeri değişimiyle üç haftaya kadar kültürde tutulabilirken, yetişkin kalplerden izole edilen hücreler 10 güne kadar kültürde tutulabilir. Yetişkin bir fare kalbinden melanosit benzeri hücreler izole etmek için, öncelikle çıkarılan kalpleri bir doku kültürü davlumbazında, antibiyotik içeren steril DPBS ile yıkayın. Kalan kanı uzaklaştırmak için kalbi kavisli diseksiyon pensi ile hafifçe sıkın ve ardından kalbi bir kez daha DPBS ile durulayın.

Ardından, atriyumları ve atriyoventriküler anulusu kalplerden çıkarın ve eksize edilen doku örneklerini 35 mm'lik bir kaba yerleştirin. Kalpleri kavisli makas ve pens kullanarak küçük parçalara bölün. Kaba 6-8 mL %0,5 tripsin çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 45-60 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, daha önce gösterilen adımları tekrarlayarak yetişkin kalp hücreleri süspansiyonu elde edin ve önceden plaka işlemelerini gerçekleştirin. Bu örnekte, beyaz ok her iki panelde de kardiyak melanositi tanımlamaktadır. Floresan işaretleyici yardımı olmadan kardiyak melanositi tanımlamanın ve plakaya yapışmış atriyal miyositlerden ayırt etmenin zor olduğunu unutmayın; açık mavi ok ucu, burada gösterilen ve plakaya iyi yapışmamış atriyal hücreleri işaret etmektedir, bunlar neonatal fare kalbinden izole edilmiş sağlıklı kardiyak melanositlerdir.

Geniş dendritik uzantılar geliştirmişlerdir ve kutanöz melanositlere oldukça benzerler. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde birkaç saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kalpten canlı melanosit hücrelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu, fizyolojik ve moleküler analizler için uygun olacaktır.