Name: Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Keşfedin fare kalbinden melanosit benzeri hücreleri izole etme yöntemini. Enzimatik sindirim ve santrifüjasyon kullanarak bu hücreleri ayırın ve atriyal aritmi araştırmaları için kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma VVPMDL için Sağlık ödülü R01 HL105734 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Sağlık Araştırma Kariyer Ödülü K08 HL094748 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, kısmen desteklenmektedir. VVP hibe 11IRG900384 tarafından desteklenen Amerikan Kalp Derneği&#39;nin Yenilikçi Araştırmacı olduğunu.

1. Gerekli Çözümler ve Ekipmanları hazırlanması <ol><li> İlk olarak, 15 dakika boyunca onları otoklav ile cerrahi aletler (düz şekli forseps, kavisli şekli forseps, düz şekli makas ve kavisli şekli makas) sterilize. 121 ° C &#39;de. Doku kadar kıyma için kullanılacak bir set kalplerini ve diğer set dışarı Anatomi için kullanılan araçların, 2 set hazırlayın. </li><li> Steril, filtrelenmiş su 900 ml MCDB153 kültür ortamı 1 paket çözülür ve toz çözününceye kadar yavaş yavaş karıştırılır. 1.2 gr sodyum bikarbonat ya da 15.7 mL sodyum bikarbonat solüsyonu, orta nihai her bir litre hacim için hazırlanmış ve çözünene kadar karıştırınız olması [ağ / hac% 7.5] ekleyin. Daha sonra, doku kültürü kaputu (biyo-güvenlik kabini) steril koşullar altında bir 0.2 mikron filtre içinden şişe iyi ortamı dökün, 1 N HCI veya 1 N NaOH eklenerek 7.2 &#39;da pH ayarlayın. Sonra medya toplamak ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Takviyeleri hazırlanınkültür ortamı (Malzeme Listesi) ekleyin. Ek ortam hücreleri kaplama için gerekli olan hemen önce ortama ilave edilmelidir. </li><li> % 10 FBS artı antibiyotik (penisilin ve streptomisin) ile DPBS hazırlayın. </li><li> DPBS artı antibiyotik (penisilin ve streptomisin), 100 ml, sonra, 0.25 g tripsin (USB sığır pankreası, aktivite&gt; 2500 USP birim / mg, son derece saf) eklenmesi ile% 0.25 tripsin solüsyonu hazırlanır. </li><li> Bu yordamı tamamlamak için gerekli diğer gerekli ekipmanı Stereomikroskopta, Petri yemekler (10 cm), 50 ml konik tüpler, 40-mikron hücre süzgeçler, DPBS artı antibiyotik, 60-mm kültür yemekleri ve 35-mm kültür yemekler bulunmaktadır. </li></ol> 2. Yenidoğan Fare Yavrularının dan Hearts Yalıtımlı <ol><li> İlk olarak, P2 bebek sıçan yavrularına P0 elde edilir (N = 6-8). EYFP alel veya etiketlemek için Z / EG alel: Bu R26R biri için heterozigot erkeklerde ile Dct-CRE homozigot kadın damızlık tarafından oluşturulan yavrular kullanılması tavsiye edilirmelanosit-benzeri hücreler. Hem R26R: EYFP ve Z / EG farenin Jackson Laboratories (stok numaraları sırasıyla 006.148 ve 003.920) mevcuttur. </li><li> Sonra, yenidoğan fare yavrular euthanize alkollü bir bezle sandıkları silin ve ardından DPBS ile 10 cm Petri kabındaki yavrular yerleştirin. </li><li> Göğüs üzerindeki deriyi kesin ve sterilize forseps ve makas ile sternum ve sonra steromikroskopla dikkatle kutuyu açın. Yenidoğan fare yavrularının kalpleri ekli kulakçıklardan ile tüm kalp kaldırmak için emin olmak için dikkatli olmak bu yüzden çok küçük. </li><li> DPBS&#39;de kalpleri yıkayın ve yeni bir 10-cm Petri aktarabilirsiniz. </li></ol> 3. enzimatik sindirme <ol><li> Bir doku kültürü kaputu (biyogüvenlik kabini) için kesilip kalpleri ile Petri çanak getirmek ve daha sonra kaputu steril teknikleri kullanarak aşağıdaki adımları izleyin. </li><li> İlk olarak, steril DPBS&#39;de artı antibiyotikler kalpler üç kez yıkayın. </li><li> Bir (n = 6-8) kalpleri yerleştirin60-mm kültür çanak ve çanak% 0.5 tripsin çözeltisi 6-8 ml ekleyin. </li><li> Daha sonra, (boyut olarak 1-mm &#39;den az) küçük parçalar halinde kesilmiş ve kalpleri% 5 CO2 atmosferinde 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra bir steril 50 ml konik tüp içine kardiyak doku ve çanak tripsin edilen dökün. </li><li> Sonra, çabuk ama yavaşça 10 ml steril pipet kullanarak, 50 ml konik tüp 30-50 kere çözümü çiğnemek. </li><li> Süzüntüyü toplamak için bir yeni ve temiz bir 50 ml konik tüp üzerine 40 mikron hücre süzgecinden elde edilen solüsyon filtre. </li><li> Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde 240 x g&#39;de 50 ml tüp santrifüj. Sonra, yavaşça süpernatant aspire ve steril DPBS 6-8 ml kalan pelletini. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın. Bu adım atriyal miyositleri ve kardiyak melanosit pelet ama fi aşağı getirmezfibroblastlar yana broblasts daha küçüktür ve süpernatan içinde kalır. </li></ol> 4. Kaplama Kardiyak Melanocyte-benzeri hücreler <ol><li> Dikkatli bir şekilde tahliye ya da yıkama çözeltisi (DPBS) aspire ve MCDB kültür ortamı 6 ml pelet tekrar süspansiyon santrifüje edildikten sonra, üçüncü durulama sonrasında hangi katkı ilave edilmiş. </li><li> Şimdi, steril bir transfer pipet içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş çözelti yararlanmak ve bir 35 mm tabak hücreleri yer ya da bir 6-yuvalı plakanın bir kuyuda, ve bir 35 mm tabak 3 neonatal fareden izole edilmiş kalp hücreleri havuzda veya iyi. </li><li> , Bir% 5 CO2 atmosferinde, gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe yemekler birleşmeyen hücreleri ile birlikte kültür ortamı aspire ardından DPBS ile bir kez durulama plakaları. Sonra plakalar taze medya eklemek ve Ortam 2 günde değiştirin. Hücreleri yetişkin duymak izole ise yenidoğan kalpleri veya embriyonik hücreler izole edilmiş, en fazla 3 hafta boyunca kültür içinde muhafaza edilebilirts en fazla 10 gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. </li></ol> Yetişkin Fare Kalpten 5. Yalıtımlı Kardiyak Melanocyte-benzeri hücreler <ol><li> İlk olarak, olgun farelerin kalpleri çıkarın (3-4 hafta yaşında, n = 3) farelerine, 100 U heparin karın içinden tatbik edilmesini ve daha sonra bunların ötenazi sonra, bir orta hat sternotomi ile. Bu işlem için fareler euthanize pentobarbitaldir kullanılması tavsiye edilir, ancak bu ilaç her yerde mevcut değildir. </li><li> Sonraki, bir doku kültürü kaputu (biyogüvenlik kabini) antibiyotik içeren steril DPBS&#39;de kesilip kalpleri yıkayın. Onlardan kalan kan kaldırmak ve daha sonra DPBS&#39;de bir kez daha kalpleri durulama kavisli kesme forseps ile hafifçe kalpleri sıkın. </li><li> Kalplerinden Atriumlarm ve atriyoventriküler halkaya çıkarın (bu yapılar melanosit-benzeri hücreler içeren) ve 35-mm çanak kesilmiş doku örneklerinin yerleştirin. </li><li> Kavisli makas ve kuvvet kullanarak küçük parçalar halinde kalpleri kestiPS ve daha sonra çanak% 0.5 tripsin çözeltisi 6-8 ml ekleyin. Daha sonra, 45-60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe yemekler. </li><li> Şimdi, adımdan sonrasını 3.6 başlayarak yukarıdaki prosedür adımları izleyin. </li></ol>

<ol><li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li>
<li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li>
<li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li>
<li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Cardiovasc.+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li>
<li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoblasts+in+culture%3A+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2%2C+stem+cell+factor%2C+and+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li>
<li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kardiyak melanosit sık atriyal aritmi tetikler doğuran kalp içindeki anatomik yerlerde bulunurlar. Bu bölgeler pulmoner venler, atriyoventriküler halkasını, posterior sol atrium ve foramen ovale (Şekil 4) içerir. Bu hücreler aritmogenez oynadıkları rolü anlamak için, onları tecrit ve fizyolojisini incelemek için teknikler geliştirmek. Ancak, biz bu tekniği geliştirerek kalp melanosit sağlıklı ve daha büyük miktarlarda eksojen uyaranlara kardiyak melanosit yanıtını araştırmak için daha fazla çalışmaları ...

Biz son zamanlarda melanin sentezi enzimleri ifade ve morfolojik deri melanosit benzer farelerin ve insanların kalbinde yeni bir hücre popülasyonu tespit. Biz bu hücrelerin kalp melanosit &#39;olarak adlandırılan ve atriyal aritmi genellikle insanlar köken tetikler hangi anatomik yerlerde bulunurlar bulundu. Biz de kalp melanosit DCT germline silinmesi ile farelerde atriyal aritmi katkıda bulundu. Kardiyak melanosit seyrek hepsi atriyal hücrelerin en az% 0.1 içerirler fare atriyum boyunca dağıtılır. Kardiyak melanosit elektriksel ve biyolojik özelliklerinin incelenmesi için biz Cre-uyarılabilir melanosit spesifik işaretlerini kullanarak fare kalp onları izole etmek için bir prosedür geliştirmiştir. Bizim ilk işlemi yenidoğan kemirgen kardiyomiyositlerin ve yama kelepçe kayıtları veya PCR analizi için uygun hücrelerin vermiştir çok az sayıda izole etmek için kullanılan geliştirildi. Ancak, iyileşmek geliştirmek içininci ve elektrofizyolojik analiz veya biyokimyasal çalışmalar daha derinlemesine kardiyak melanosit, canlılığı, biz deri melanosit yalıtmak için tasarlanmış olanlar bir rafine prosedür geliştirmiştir. Bu derlemede anlatılan ve gösterilen prosedür saf nüfus olarak veya kardiyomiyositlerin ile kaplı olabilir sağlıklı kalp melanosit üretme avantajına sahiptir.

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>Suda çözün</td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyumsuz, magnezyumsuz</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>Stok kons.: 1x&lt;br/&gt; Çalışma kons.: 1x</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin </td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Stok kons.: 100x&lt;br/&gt; Çalışma kons.: 1x</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technology</td><td>Sertifikalı</td><td>Çalışma kons.: 4%</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>DMSO'da çözün&lt;br/&gt;Stok kons.: 3.2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;Çalışma kons.: 32 nM</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>DPBS'de çözün&lt;br/&gt;Stok kons.: 0.1 mg/ml&lt;br/&gt;Çalışma kons.: 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Dibütiril siklik AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>DPBS'de çözün&lt;br/&gt;Stok kons.: 0.5 mM&lt;br/&gt;Çalışma kons.: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>10 mM asetik asitte çözün&lt;br/&gt;Stok kons.: 1 mg/ml&lt;br/&gt;Çalışma kons.: 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Bazik FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>Suda çözün&lt;br/&gt;Stok kons.: 4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;Çalışma kons.: 4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

fare kalpten İlköğretim melanocyte gibi hücreleri ayırma

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

Biz farelerde atriyal aritmi tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit. Kardiyak melanosit elektriksel ve biyolojik özelliklerinin incelenmesi için biz yenidoğan kemirgen kardiyomiyositlerin yalıtmak için tasarlanmış olanlar türetilen fare kalpleri onları izole etmek için bir prosedür geliştirmiştir. Daha geniş olduğunda, yamalı kenetleme ve biyokimyasal çalışmalar için uygun sağlıklı kalp melanosit elde etmek amacıyla, ilk olarak izole edilmesi ve deri melanositleri izole etmek için tasarlanmış olanlar göre kalp melanosit kaplama için zarif bir prosedür geliştirilmiştir. Rafine işlemi bu incelemede gösterdi ve saf bir nüfus olarak veya kardiyomiyositlerin ile kaplı olabilir sağlıklı melanosit benzeri hücrelerin daha fazla sayıda üretir.

Bu makalede açıklanan protokol daha önce sıçangil kalp, kalp melanosit izole etmek için yayınlanmış bir oranla geliştirilmiş bir tekniktir. Bu prosedür, kardiyak melanosit-benzeri hücreleri etiketlemek için melanin sentezi, enzim spesifik Kre-rekombinaz tarafından tahrik floresan belirteçlerin kullanımına başvurmaktadır. Atriyal miyositlerden kalp melanosit ayırt morfolojik farklılıklar henüz (Şekil 1A) geliştirdik değil çünkü, taze izole edilmiş embriyonik veya neonatal hücreler çalışırken kalp melanos...

Bu protokolde, w e atriyal aritmi farelerde tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit.

Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma

Farelerin ve insanların kalplerinde, atriyal ... katkıda bulunan, melanosit benzeri hücrelerin (kardiyak melanositler olarak da bilinir) yeni bir popülasyonunu tanımladık.

Bu prosedürün genel amacı, fare kalbinden canlı kardiyak melanosite benzer hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle ötanazi uygulanmış farelerden kalplerin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise kalpler ince kıyılır ve enzimatik sindirim ile mekanik ajitasyon kullanılarak hücreler ayrıştırılır.Ardından, hücre süspansiyonu santrifüjlenir ve kardiyomiyositler ile melanosit benzeri hücreleri içeren pelet yeniden süspanse edilir. Son adım, hücrelerin ekilmesi ve kültüre edilmesidir. Nihayetinde izole edilen kardiyak melanosit benzeri hücreler, hücresel uyarılabilirliği veya transkriptomun durumunu değerlendirmek amacıyla, patofizyolojik stresörlere yanıt olarak yama çalışmaları veya mikroarray analizleri için kullanılabilir.Bu tekniğin, kardiyomiyositleri izole etmek ve kültüre etmek için tasarlanmış mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda işlevsel kardiyak melanosit benzeri hücrenin izole edilmesini sağlamasıdır. Aslında bu yöntem için ilk fikri, fare kalbinde yeni bir hücre popülasyonu keşfettiğimizde ve bunun fizyolojisini araştırmak istediğimizde edindik. Başlamak için, biri kalpleri çıkarmak ve diğeri dokuyu kıymak için kullanılacak iki set steril cerrahi alet hazırlayın.Ardından, besiyeri takviyelerini hazırlayın ancak hücreleri ekim yapmadan hemen öncesine kadar bunları kültür besiyerine eklemeyin. Bir doku kültürü önlemi altında çalışırken çözeltiyi sterilize etmek için kültür besiyerini hazırlayıp filtreledikten sonra, besiyerini dört derece Celsius'ta saklayın. 0,05 gram DNA's, one'ı, %10 FBS ve antibiyotikli 100 mililitre DPBS'ye ekleyerek DNA's, one çözeltisini hazırlayın.Ardından, 100 mililitre antibiyotikli DPBS'ye 0,5 gram tripsin ekleyerek %0,5'lik bir tripsin çözeltisi hazırlayın. Son olarak, Petri kapları, 50 mililitrelik konik tüpler, 40 mikron hücre süzgeçleri, antibiyotikli DPBS, 60 milimetrelik ve 35 milimetrelik kültür kapları dahil olmak üzere prosedürü tamamlamak için gerekli diğer ekipmanları bir araya getirin. P0 ile P2 arasındaki neonatal fare yavruları ötanize edildikten sonra, göğüs bölgelerini alkol ile silin ve bir stereo mikroskop altında çalışarak 10 santimetrelik bir P2 kabındaki DPBS içine yerleştirin; göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve tüm kalbi atriyumlar ekli haldeyken çıkarın.Kalpleri DPBS ile yıkayın ve yeni bir 10 santimetre Petri kabına aktarın. Çıkarılmış kalplerin bulunduğu Petri kabını bir doku kültürü kabinine taşıyın ve sonraki adımlar için steril tekniği uygulayın. İlk olarak, kalpleri antibiyotikli steril DPBS ile üç kez yıkayın.Kalpleri 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve altı ila sekiz mililitre %0,5 tripsin çözeltisi ekleyin. Ardından, kalpleri küçük parçalara bölün ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, kapta oluşan çözeltiyi steril bir 10 mililitrelik konik tüpe çekin.10 mililitrelik steril bir pipet kullanarak çözeltiyi hızlı ancak nazikçe 30 ila 50 kez tekrar pipetleyin, elde edilen süspansiyonu 40 mikronluk bir hücre süzgeci aracılığıyla yeni, temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe filtreleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı nazikçe aspire edin ve kalan peleti altı ila sekiz mililitre steril DPBS içinde yeniden süspanse edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.Santrifüj sonrası üçüncü yıkamayı takiben, yıkama solüsyonunu dikkatlice boşaltın veya aspire edin ve peleti altı mililitre takviyeli kültür medyumu içinde yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen solüsyonu steril bir transfer pipetiyle çekin ve hücreleri 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından üç neonatal fareden izole edilen kardiyak hücreleri alın, yapışmamış hücrelerle birlikte kültür medyumunu aspire edin ve ardından plakaları bir kez DPBS ile yıkayın, plakalara taze medyum ekleyin ve medyumu yenileyin.Neonatal veya embriyonik kalplerden izole edilen hücreler, iki günde bir besiyeri değişimiyle üç haftaya kadar kültürde tutulabilirken, yetişkin kalplerden izole edilen hücreler 10 güne kadar kültürde tutulabilir. Yetişkin bir fare kalbinden melanosit benzeri hücreler izole etmek için, öncelikle çıkarılan kalpleri bir doku kültürü davlumbazında, antibiyotik içeren steril DPBS ile yıkayın. Kalan kanı uzaklaştırmak için kalbi kavisli diseksiyon pensi ile hafifçe sıkın ve ardından kalbi bir kez daha DPBS ile durulayın.Ardından, atriyumları ve atriyoventriküler anulusu kalplerden çıkarın ve eksize edilen doku örneklerini 35 mm'lik bir kaba yerleştirin. Kalpleri kavisli makas ve pens kullanarak küçük parçalara bölün. Kaba 6-8 mL %0,5 tripsin çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 45-60 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, daha önce gösterilen adımları tekrarlayarak yetişkin kalp hücreleri süspansiyonu elde edin ve önceden plaka işlemelerini gerçekleştirin. Bu örnekte, beyaz ok her iki panelde de kardiyak melanositi tanımlamaktadır. Floresan işaretleyici yardımı olmadan kardiyak melanositi tanımlamanın ve plakaya yapışmış atriyal miyositlerden ayırt etmenin zor olduğunu unutmayın; açık mavi ok ucu, burada gösterilen ve plakaya iyi yapışmamış atriyal hücreleri işaret etmektedir, bunlar neonatal fare kalbinden izole edilmiş sağlıklı kardiyak melanositlerdir.Geniş dendritik uzantılar geliştirmişlerdir ve kutanöz melanositlere oldukça benzerler. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde birkaç saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kalpten canlı melanosit hücrelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu, fizyolojik ve moleküler analizler için uygun olacaktır.

isolating-primary-melanocyte-like-cells-from-the-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, doğum sonrası fare yavrusunun derisinden melanositleri ve fibroblastı aynı anda izole etmek ve kültürlemek için hızlı yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler, cilt hücresi biyolojisini, yara iyileşmesini ve melanomu incelemek için in vitro olarak korunabilir ve manipüle edilebilir.

Primer Murin Melanositlerinin ve Fibroblastlarının Hızlı Kültürlenmesi: Tüm Murin Deri Örneğinden Melanositlerin ve Fibroblastların İzole Edilmesi

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Antegrad perfüzyon tekniği ile yüksek kaliteli bireysel fare kalp hücrelerini izole etmek için basit bire yöntemi geliştirdik. Bu yöntem Langendorff içermez ve kardiyak fibroblastlar veya progenitörler gibi ventrikül ve atriyal miyositleri veya interstisyel hücreleri izole etmek için yararlıdır.

Farelerden Kardiyomiyosit İzolasyonu için Antegrad Perfüzyon Yöntemi

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Keşfedin fare kalbinden melanosit benzeri hücreleri izole etme yöntemini. Enzimatik sindirim ve santrifüjasyon kullanarak bu hücreleri ayırın ve atriyal aritmi araştırmaları için kullanın.

Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma

Daha fazla video keşfet