İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan intestinal mukozasının stimülasyonu için in vivo durumunu taklit etmektir. Bu, stimulusun bazolateral temas kurmasını önlemek amacıyla dokunun apikal tarafına bir kave silindiri yapıştırılarak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak stimulus uygulanır ve bu sayede tetiklenen immün yanıtın analizi sağlanır.

Ardından, dokunun 24 ila 36 saat boyunca canlı kalmasını sağlamak amacıyla uyaran, dokunun apikal tarafından kaldırılır. Elde edilen sonuçlar; immünohistokimya verileri, sitokin sekresyonu, profil analizi ve benzeri verilere dayanarak çeşitli probiyotik suşların farklı etkilerini gösterebilir. Bu tekniğin ASIC kamarası gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, aynı anda 20'ye kadar farklı koşulun analiz edilmesine olanak tanımasıdır.

Kültür süresinin 36 saate kadar uzatılmasına olanak tanır ve ayrıca DNA/RNA analizi, immünohistokimya, sitokin salınımı vb. gibi çeşitli okuma analizleri için yeterli materyal sağlar. Bu yöntem probiyotik alanında içgörü sağlayabildiği gibi, diğer teknolojiler için ve biyolojikler, antiinflamatuar ilaçlar gibi diğer immünomodülatörlerin etkilerini incelemek için de kullanılabilir. Sağlıklı bireylerden veya inflamatuar bağırsak hastalığı olan kişilerden intestinal mukoza dokusu cerrahi sırasında elde edilmelidir.

Örnek eksize edildikten sonra, pen strep içeren HBSS içerisinde soğuk tutularak hızla laboratuvara nakledilir. Ardından, doku tampon ile yıkanarak başlanır ve tüm mezenterik materyaller uzaklaştırılır. Sonrasında, doku HBSS tamponunda tutulurken steril makas ve pens kullanılarak mukoza tabakası submukozadan ayrılır.

Bir Petri kabında dokunun tamamen daldırılmış olarak tutulması gerekli değildir, ancak forseps ile mukozal yüzeye mümkün olduğunca az dokununuz. Ardından, mukozayı en az bir santimetre genişliğinde ve mümkün olduğunca uzun şeritler halinde, iki steril skalpeli yiyecek keser gibi kullanarak kesin. Kesme işlemi tamamlandıktan sonra, mukozayı kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile nazikçe yıkayıp temizleyin.

Son olarak, mukoza şeritlerini apikal yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yayın. Taze TIS DMEM hazırlayarak başlayın. Ardından, 10 santimetrelik bir Petri kabını yaklaşık 30 mililitre F-B-S-N-A ile doldurun ve bir demir ızgarayı tamamen çözeltinin içine daldırın.

Plakayı açık tutun ve plastik silindirleri plaka üzerine yerleştirin. Kapatın. Şimdi, üç µL cerrahi yapıştırıcıyı bir pipete çekin ve pensle sıkıca tutarken yapıştırıcıyı plastik silindirin kenarlarından birine dikkatlice uygulayın. Ardından, yapıştırıcı kururken silindiri mukoza üzerindeki apikal tarafa, şerit kenarlarından birine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde nazikçe yerleştirin.

Doku plakasının merkez kuyucuğuna 850 ila 1000 µL besiyeri ekleyin ve demir ızgarayı plaka merkez kuyucuğunun kenarlarına yerleştirerek destekleyin. İki neşter kullanarak, silindirin kenarlarındaki fazla dokuyu kesin. Ardından, ekli dokuyla birlikte silindiri nazikçe kaldırın ve dokunun bazolateral tarafını plakanın merkezindeki demir ızgara üzerine yerleştirin.

Ardından, doku stimülasyonuna geçiniz. İlgilenilen stimülileri, plastik silindirin merkezine istenen konsantrasyonda uygulayınız. Pipet ucuyla silindiri veya mukoza yüzeyini rahatsız etmeyiniz ve silindirin içindeki yüzeyi homojen bir şekilde kaplayınız.

Şimdi dokuyu üç saate kadar inkübe edin. Daha küçük bir hacimde stimülasyon çözeltisi kullanılarak üç saatten daha uzun süreli inkübasyon da mümkündür. İnkübasyonun ardından, stimülasyon maddelerini dokunun apikal yüzeyinden uzaklaştırın ancak yerine taze besiyeri eklemeyin.

Besiyeri eklemek dokunun nefessiz kalmasına neden olur. Şimdi oksijen kavanozunu, 24 saatlik kültür süresi boyunca bir atmosfer basıncında %100 oksijen ile doldurun. Oksijen tüpünü kullanırken her zaman dikkatli olun ve kullanımdan sonra düzgünce kapattığınızdan emin olun.

24 saatlik stimülasyon kültürünün ardından, yapıştırıcıyı nazikçe kazıyarak silindiri dokudan dikkatlice çıkarmak için bir skalpel kullanın. Ardından, IHC veya immünofloresan analizler için dokuyu fikse edin. Gen ekspresyonu veya protein analizi için ise dokuyu sıvı azot içerisinde şok dondurun.

Ardından, sitokin salgılama profillemesi için bazal lateral medyumu toplayın. Bunu takiben, medyumu bir santrifüj tüpüne aktarın ve belirtilen protokolü kullanarak kalıntıları çöktürün. Sağlıklı ve IBD'li insan intestinal mukozaları, dokuların refahı korunarak en az 24 saat boyunca kültüre edilmiştir.

Bu durum, ancak kültür süresinin en az %85'inin oksijen açısından zengin bir ortamda gerçekleşmesi durumunda mümkün olmuştur. Geleneksel yöntemlerle kültüre edilen mukoza aynı derecede iyi sonuç vermemektedir. Sağlıklı doku daha sonra pro-inflamatuar invaziv salmonella ile stimüle edilmiştir.

İnokülasyondan iki saat sonra, kontrollere kıyasla epitelin üst tabakasındaki yıkım halihazırda görünür hale gelmişti. 24 saat sonra, dejenerasyon oldukça geniş bir alana yayıldı. Yayınlanmış sonuçlarla birlikte deneysel uygulamaların daha ayrıntılı bir tartışması, yazılı taslağın geliştirilmesinin ardından sunulacaktır.

Bu teknik, gastroenteroloji alanında çalışan araştırmacıların gastrointestinal sistemdeki konakçı-mikrop etkileşimini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, insan intestinal mukozasının kültürde nasıl tutulacağı ve topikal olarak nasıl stimüle edileceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. İnsan örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken gerekli önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.