Songbirds İşitsel Uyarım ile Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme (fMRI)

Bu prosedürün genel amacı, şarkı söyleyen kuş beynindeki işitsel ve şarkı kontrol bölgelerinde ses algısının ve işlemesinin başarılı bir şekilde görüntülenmesi için optimize edilmiş bir protokolü göstermektir. Fonksiyonel MRI kullanılarak bu işlem, öncelikle fonksiyonel MRI veya FMRI taraması sırasında kuşa sunulmak üzere bir açık-kapalı blok paradigmasına dahil edilebilen yüksek kaliteli işitsel uyaranlar hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, kuşun önce anestezi edilmesi ve ardından MRI tarayıcısının gövdesine yerleştirilen uyarlanmış bir hayvan yatağına konumlandırılmasıyla taramaya hazırlanmasıdır. Sonrasında, işitsel stimülasyon sırasında FMRI görüntüleri elde edilebilir.

Son adım, görüntülerin zebra ispinozu atlasına göre normalizasyonu da dahil olmak üzere, elde edilen MRI verilerinin ön işlemesidir. Nihayetinde, elde edilen sonuçların görselleştirilmesine ve işitsel uyaranların tetiklediği beyin aktivasyonlarının lokalizasyonuna olanak sağlamak için istatistiksel voksel tabanlı analiz kullanılır. Bu tekniğin, bal kimliğine sahip kuş araştırmalarında daha yaygın olarak kullanılan elektrofizyoloji, histoloji ve moleküler haritalama teknikleri gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, fMRI'ın non-invaziv bir in vivo yöntem olmasıdır; bu da aynı deneğin zaman içinde incelenmesine ve incelenen süreçte yer alan nöral substratların lokalizasyonuna dair önceden bir hipotez kurmaya gerek kalmadan tüm beynin aynı anda ele alınmasına imkan tanır.

Bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü kuşlarda fonksiyonel MRI uygulamak, aynı yöntemin insanlarda veya kemirgenlerde kullanılmasından çok farklı ve çok daha zorludur. Bu durum sadece deneklerin beyinlerinin küçük boyutundan değil, aynı zamanda kafataslarının süseptibilite artefaktlarına yol açan çok sayıda hava boşluğundan oluşmasından kaynaklanmaktadır; gradyan sekansına kıyasla bu artefaktlara karşı daha az duyarlı olan bir spin ekosu sekansı kullanarak, şarkıcı kuşun tüm beyin fonksiyonel görüntülemesini oldukça iyi bir uzamsal özgüllükle gerçekleştirebiliriz. Tarayıcı borusu, işitsel stimülasyonu bozabilecek dar bir alandır.

Bu nedenle, bu protokol için hazırlıklara başlamak için, yedi T MR sisteminin boru içerisinde çalınan ses uyaranlarını fiber optik bir mikrofon kullanarak kaydedin ve kullanılan MRI sistemi için bozulmaları doğrulayın. Burada, tarayıcının dışında ve kuş başının mıknatıs borusu içindeki konumunda yapılan beyaz gürültü kayıtlarının gösterdiği gibi, güçlendirilen ve bastırılan frekansları görebiliriz. Bu yapay güçlendirmeyi telafi etmek için, görülen kurulum için wave lab yazılımını kullanarak her bir uyarana bir ekolayzır fonksiyonu uygulayın.

Bu protokolde fonksiyon, ekranda görülen parametrelere sahip bir Gauss çekirdeğinden oluşmaktadır. Burada, şarkı uyaranları, belirli bir kuşa ait birkaç bireysel şarkı motifinin sessizlik süreleriyle ardışık olarak sıralanmasından oluşmalıdır; tüm uyaranlar boyunca toplam ses ve sessizlik miktarlarının aynı kalması için bu sessizlik sürelerinin uzunluğu ayarlanmalıdır. Her bir uyaranın toplam uzunluğu, iki fMRI görüntüsünün elde edilme süresine karşılık gelen 16 saniyedir.

Tam stimülusa entegre etmeden önce, hazırlık yazılımını kullanarak her şarkının yoğunluğunu eşleşmiş kareli ortalama kare (root mean square) cinsinden normalize edin ve 400 hertz'de yüksek geçiren filtre uygulayın. Deney, işitsel stimülasyon dönemleri ile dinlenme dönemlerinin dönüşümlü olduğu bir açık-kapalı blok tasarımı kullanılarak sunum yazılımı ile tasarlanabilir. Her blok, iki görüntünün acquisition süresine karşılık gelecek şekilde 16 saniye sürmelidir; her stimülüs tipini 25 kez sunmak, stimülüs başına ve denek başına 50 görüntünün elde edilmesiyle sonuçlanır.

Koşulların sunum sırası, denekler içinde ve denekler arasında randomize edilmelidir. Ayrıca, deneysel paradigmayı tarayıcıdan tetikleyiciler alacak şekilde ayarlayın. Bu, fMRI sekansı içindeki her tekrarda tarama yapılırken, tarayıcı yazılımının işitsel sunum yazılımına bir tetikleyici göndermesini, yazılımın da buna karşılık tarama numarasını kaydederek ilgili komutu yürütmesini sağlar.

Burada, özellikle yetişkin zebra ispinozlarının kullanımına uyarlanmış bir protokol sunuyoruz. Zebra ispinozları, 12 saat ışık ve 12 saat karanlık fotoperiyoduna sahip kuşevlerinde barındırılmalı ve çalışma boyunca yiyecek ile suya serbestçe erişebilmelidir. Deney başına gereken minimum birey sayısı 15'tir.

Bu sayı, spin ekolu fMRI'ın hassasiyetini ve deneyde ölçülen biyolojik fenomenlerin doğal bireyler arası değişkenliğini dikkate almaktadır. Deneye hazırlanmak için öncelikle, gaga maskesini plastik tüplerle gaz kontrol cihazına bağlayın ve yedi T bir MR sisteminin MR yatağına yerleştirin. Hem oksijen hem de nitrojen gaz tüplerini açın ve gaz kontrol cihazını çalıştırın.

Ayrıca geri bildirim kontrollü sistemi ve sıcak hava akışı cihazını açın. Ardından, zebra ispinozunun gagasını maskeye yerleştirip kuş tamamen anestezi olana kadar başını tutarak, oksijen ve azot karışımı içindeki %3 isofluorine ile anestezi uygulayın. Bu durum, pençenin hafifçe çekilmesiyle doğrulanabilir.

Kuş tamamen sedate edildiğinde, pençe geri çekilmeyecektir. Ayrıca, kuşun gözleri kapalı olacaktır. Deney boyunca vücut sıcaklığını takip etmek için bir kloakal sıcaklık probu yerleştirin ve solunum hızını izlemek için karnın altına pnömatik bir sensör yerleştirin.

Ardından, deney boyunca kuşun gövdesini sabitlemek için bir ceket yerleştirin. Solunum hızını dakikada 40 ile 100 nefes arasında tutun ve vücut sıcaklığını 40 derecede sabit tutun. Solunum aralığı çok düşük veya çok yüksekse, anestezi düzeyini buna göre ayarlayın.

Sorun devam ederse, deney durdurulmalı ve hayvan düzenekten çıkarılmalıdır. İyileşme sağlamak için, zebra ispinozunun başının her iki yanına manyetik olmayan dinamik hoparlörler yerleştirin ve bunları amplifikatöre bağlayın. Hoparlör kablolarının sıcaklık probundan uzağa yönlendirildiğinden emin olun, çünkü bu durum sıcaklık okumasını etkileyebilir.

Çok yakın olduğunda, yüzey RF bobinini zebra ispinozunun başının üzerine yerleştirin. Ardından zebra ispinozunu mıknatısın merkezine konumlandırın. Son olarak, tarama öncesinde anestezi seviyesini %1,5 ISO floruna düşürün.

Taramaya başlamak için öncelikle beynin mıknatıstaki konumunu belirleyin. Sagital, horizontal ve koronal düzlemlerde tek kesitli gradyan ekoscout görüntülerinden oluşan bir set ile fonksiyonel taramaların konumlandırılmasında daha sonra kullanılacak olan çok kesitli scout görüntüler edinin. Ardından, rampa sürelerini 1000 mikrosaniyeye çıkararak gradyanların gürültüsünü azaltın.

Ardından, hızlı kazanımlı gevşeme ile güçlendirilmiş, diğer adıyla rare T2 ağırlıklı fMRI sekansını hazırlayın; ardından beynin neredeyse tamamını kapsayacak şekilde 15 sagital kesit tanımlayın. İşitsel sunum yazılımının tarayıcıdan gelen hiçbir tetikleyiciyi kaçırmadığından emin olmak için sunum yazılımında işitsel protokolü seçin.

Önce işitsel protokolü başlatın. Ardından protokol tamamen yüklendiğinde, FMRI sekansını başlatın. İşitsel stimülasyona başlamadan önce sinyalin kararlı hale gelmesini sağlamak için her FMRI deneyinden önce 10 adet dummy görüntü alınmalıdır.

Edinim tamamlandıktan sonra sıfırlama yapın. Verileri 64'e 64 olacak şekilde doldurun. Verilerin kalitesini belirlemek için, fonksiyonel aracı kullanarak sonuçlara ön bir göz atın.

ParaVision yazılımında, tüm "açık" (on) bloklar ile bazal hat arasındaki diferansiyel kan cevabı hesaplayın. Primer işitsel alanlarda herhangi bir aktivasyon görülmezse, kuş muhtemelen teknik sorunlar veya anestezi düzeyi nedeniyle işitsel uyaranları duymamış veya işlememiştir. Kurulum doğrulanmalı ve ölçüm tekrarlanmalıdır.

Fonksiyonel veri alımından sonra, önceki fMRI taramalarıyla aynı yönelimde anatomik 3D T2 ağırlıklı bir sekans çalıştırın. Ardından, bu verileri 256 x 256 x 256 boyutuna sıfırla doldurun.

Son olarak zebra ispinozunu MRI yatağından çıkarın ve bir ısı lambası altındaki kafeste anesteziden ayılmasına izin verin. Normalde bir zebra ispinozunun izofloran anestezisinden ayılması beş dakikadan kısa sürer. Sadece birkaç dakika sonra kuş ayağa kalkmaya çalışacaktır ve kuş tamamen ayıldığında, veri işlemeye başlamak için kafesin tabanında oturmak yerine bir dala tüneyecektir.

Öncelikle, MR verilerini analyze veya nifty formatına dönüştürün. Ardından, SPM'de veri işlemeye başlamadan önce, voksel boyutunu 10 ile çarparak fMRI şarkı söyleyen kuş verilerini uyarlamak gerekir. fMRI analiz yazılımı, insanlardan elde edilen fMRI verilerini işlemek üzere geliştirildiğinden, izlenecek en basit yol, MRI Crow yazılımını kullanarak kuş fMRI verilerinin voksel boyutunu yapay olarak artırmaktır.

Bu ayarlamanın verilerin kendisini etkilemediğine dikkat edin. Verilere herhangi bir yeniden örnekleme veya başka bir modifikasyon uygulanmaz. Ardından, elde edilen veriler ön işlemeden geçirilir.

Önce SPM 8 kullanarak fMRI verilerini yeniden hizalayın ve anatomik 3D veri setini fMRI zaman serisiyle eşleştirin. Ardından, 3D verileri ve EŞLEŞTİRİLMİŞ fMRI zaman serisini zebra ispinozu beyin MRI Atlası'na normalize edin.

Transformasyon matrisini fMRI veri setine uygulayın ve verileri 0,5 milimetrelik bir Gaussian çekirdeği ile düzleştirin. Ardından SPM eight programında, önce bireysel kuşlar düzeyinde, ardından grup düzeyinde istatistiksel voksel tabanlı analiz gerçekleştirin. Son olarak, sonuçları görselleştirmek ve fonksiyonel aktivasyonları lokalize etmek için istatistiksel parametrik haritayı zebra ispinozu atlası olan yüksek çözünürlüklü 3D zebra ispinozu beyin atlası üzerine projekte edin; zebra ispinozu fMRI sonuçlarının açıklanan analizinde kullanılan stereotaktik koordinatlar, Bioimaging laboratuvarında bu deney için MRI Atlas veri seti olarak tasarlanmıştır.

Beyin sınırlandırmaları ve çekirdek sınırlandırmaları, buradaki web sitesi üzerinden ücretsiz olarak erişilebilirdir. Burada, atlasın midsajital kesiti üzerine yansıtılmış sınırlandırılmış yapılarla birlikte sol hemisferin 3D temsilinin lateral görünümü gösterilmektedir. Burada, dinlenme durumuyla karşılaştırıldığında, farklı işitsel uyaranlar tarafından uyarılan primer işitsel bölge alan L ve bitişik sekonder işitsel bölgelerdeki bir fMRI BOLD yanıtı örneğini görebiliriz.

T değerleri, şekilde gösterilen ölçeğe göre renklerle kodlanmıştır ve yalnızca T-testinin anlamlı bulunduğu vokselleler görüntülenmiştir. Bu, zebra ispinozlarında gerçekleştirilen bir fMRI deneyinin başka bir örneğidir. Görüntüler, beynin XMLD ve HVC bölgelerinde kuşun kendi şarkısına verilen seçici yanıtları göstermektedir.

Görüntülerin altındaki sayılar, orta hattan milimetre cinsinden koordinatları belirtmektedir. Pozitif işaret, kesitlerin ve istatistiksel sonuçların sağ hemisferden olduğunu gösterir. Bu videoda açıklanan protokol, sığırcıklar gibi diğer şarkıcı kuşlardaki uygulamalara kolayca uyarlanabilir.

Bu, böyle bir fMRI deneyinin sonuçlarına bir örnektir. Bir Sığırcıkta şekil, aynı bireyde mevsimler boyunca işitsel uyaranlar ile dinlenme durumu arasında tetiklenen aktivasyonları göstermektedir. Şarkıcı kuşlarda fonksiyonel MRI'nın uygulanması ve optimizasyonu, şarkıcı kuş araştırmaları alanında yeni araştırma yolları açmaktadır.

Bu tekniğin, bu hayvan modellerindeki vokal iletişimin temelini oluşturan karmaşık duyusal motor ve bilişsel süreçlerin deneysel analizi için değerli bir yöntem olduğu halihazırda gösterilmiştir. Ayrıca, invaziv olmaması ve tüm beyni kapsayan yaklaşımı sayesinde, fMRI'ın tamamı daha yaygın olarak uygulanan lokal ve invaziv yöntemleri destekleyici tamamlayıcı bir metod olarak kullanılabilir. SUNBIRDS'teki fMRI deneylerinin artan sayısı, yöntemin bilişsel araştırma sorularına uygulanabilirliğini kanıtlamaktadır; MRI deneylerini daha da genişletmek için gelecekte yapılması gereken çalışma ise, anestezi altında aktif kalmaya devam eden bir süreç olan işitsel işlemenin ötesine geçerek, görüntüleme protokolüne alıştırılmış uyanık deneklerin kullanılmasıdır.

Bu durum, kuşların EMI deneylerine aktif olarak katılabileceği ve kuşların dikkatinin deneysel olarak kontrol edilebileceği yeni araştırma olanakları sunabilir.