Diseksiyon, Kültür ve Analizi

Bu prosedürün genel amacı, xenopus retinal hücrelerinin primer hücre kültürünü hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle retinayı açığa çıkarmak için çevre dokuların uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinal dokunun eksize edilmesidir.

Ardından, retinal doku tekil hücrelere ayrıştırılır. Son adım, retinal hücrelerin bir UnCloned kaba ekilmesi ve kalsiyum görüntüleme için flu oh 4:00 AM eklenmesidir. Nihayetinde, retinal hücre kültüründeki kalsiyum aktivitesini tespit etmek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem; retinal gelişimde kalsiyum ve elektriksel aktivitenin rolü ile tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu gibi gelişimsel biyoloji, nörobiyoloji ve hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu prosedürde yeni olan kişiler, zamanında ve doğru diseksiyonlar için ince motor hareketler gerektiğinden zorluk yaşayacaklardır. Karmaşık el-göz hareketleri temel olduğundan ve diseksiyon basamakları zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Bu prosedüre çeker ocak içerisinde başlamak için, diseksiyon plakası olarak kullanılacak, 10 mL hücre kültür ortamı içeren bir adet 60 mm'lik plastik Petri kabını hazırlayın ve etiketleyin. İsteğe bağlı olarak, evre 25 veya daha genç embriyoların diseksiyonunda doku tabakalarının ayrılmasını kolaylaştırmak için, diseksiyon plakasına son konsantrasyonu 1,0 mg/mL olacak şekilde 10 mg kollagenaz B eklenebilir.

Ayrıca, kültür plakası olarak kullanılmak üzere iki mililitre hücre kültür ortamı içeren bir adet 35 milimetrelik yüzey kabı, eksplant disosiyasyon tüpü olarak kullanılacak bir adet boş 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü ve içinde 15 mililitre bulunan bir adet 15 mililitrelik konik falcon tüpü hazırlayın.

Hücre kültürü ortamı. Ardından, diseksiyon için iki adet 35 milimetrelik plastik Petri kabını, her birini iki mililitre CMF içerecek şekilde hazırlayın; bunlardan biri eksplan disosiyasyon plakası, diğeri ise çeker ocak dışında eksplan durulama plakası olarak kullanılacaktır. İçinde 10 mililitre bulunan iki adet 60 milimetrelik plastik Petri kabı hazırlayın.

Biri tutma plakası, diğeri kardeş plaka olarak kullanılmak üzere iki adet 0.1 XMMR ve ayrıca 10 milliliters, 0.1 XMMR artı 0.5 milligrams per milliliter MS 2 22 içeren bir adet 60 millimeter plastik Petri kabı. Ardından, açıklama disosiasyon plakasına 40 microliters, %5 tripsin (CMF içinde) ekleyin.

Karıştırmak için dairesel hareketlerle çalkalayın, ardından kenara alın. Daha sonra, iki çift ince pens kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla diseksiyona geçin. Embriyonun ventral tarafında, posterior uçtan başlayarak embriyonun anterior kısmındaki çimento bezinden geçecek şekilde orta sagital bir kesi yapın.

Kesinin her iki yanını açarak embriyoyu dikkatlice açın. Bu işlem sonucunda embriyonun dorsal tarafı diseksiyon plakasına bakacaktır. Ardından, endoderm ve mezodermi ortaya çıkarmak için ventral ektodermi açın.

Ardından, bu dokunun ilk ve en geniş tabakası olan endoderm ve mezodermi çıkarın. Endoderm, büyük hücreli ve belirgin bir organizasyonu olmayan, oldukça tüylü bir görünüme sahiptir. Bu tabaka çıkarıldıktan sonra, somitler ve Noor görünür hale gelecektir.

Daha iyi kontrast elde etmek için embriyoyu, 10 mililitre hücre kültürü besiyeri ve 100 mikrolitre %1'lik Nile blue sulfate çözeltisi içeren ayrı bir 60 milimetrelik plastik Petri kabına aktarın ve iki ila üç dakika inkübe edin. Ardından, embriyoyu tekrar diseksiyon plakasına geri aktarın. Bu işlem; ektodermi, somitleri ve Noor'u boyayarak tanımlamayı ve yönlendirmeyi kolaylaştıracaktır.

Embriyonun ön kısmına odaklanarak, beyni ve optik vezikülleri açığa çıkarmak için Nöral plak ve kalan mezodermi dikkatlice temizleyin. Beyin ve optik veziküller tamamen açığa çıktığında, pens yardımıyla beynin hemen arkasından nöral tüpü ve altındaki ektodermi kesin. Ektoderm üstte kalacak şekilde bu kısmı ters çevirin.

Alttaki optik veziküllere zarar vermemeye dikkat ederek ektodermi dikkatlice çıkarın. Son olarak, 25. evreden daha yaşlı bir embriyoyu diseke etmek için optik vezikülleri pens yardımıyla beyinden ayırın. İlk olarak, anestezi tablasındaki embriyonun ventral kısmını pensle çıkarın.

Daha iyi kontrast sağlamak için embriyoyu, ektodermi boyamak amacıyla 10 milliliters 0,1 XMMR ve 100 microliters %1 Nile blue sulfate içeren 60 millimeter plastik bir Petri kabına iki ila üç dakika boyunca aktarın. Ardından embriyoyu diseksiyon plakasına transfer edin. Daha sonra embriyoyu sabit tutarak, üstteki ektodermin hemen altında yer alan retinayı veya optik vezikülü dikkatlice çıkarın.

Optik vezikül veya retina diseke edildikten sonra, aerosol dirençli bir uç takılmış P 100 mikro pipet kullanarak dokuyu dikkatlice X eksplan durulama plakasına aktarın. Dokunun hava-sıvı sınırlarına temas etmemesine özen gösterin. Ardından, eksplanın 30 saniye boyunca beklemesini sağlayın.

Ardından, explan ayrıştırma plağındaki %0,1'lik CMF içerisindeki tripsinden 80 µL'yi explan ayrıştırma tüpüne aktarın. Daha sonra, retinayı veya optik vezikülü, explan durulama çözeltisini aktarmamaya dikkat ederek, explan durulama plağından explan ayrıştırma tüpüne aktarın.

Ardından, dokunun eksplan disosiasyon tüpünde oda sıcaklığında bir saat boyunca ayrışmasına izin verin. Deney boyunca hücrelerin birden fazla görüntüsü alınacaksa, kültür plağının alt kısmına küçük süper yapıştırıcı damlalarıyla bir ızgara sabitleyin. Bu, hücrelerin plağa ekim prosedürünün farklı aşamalarında, aynı hücrelerin aynı yönelimlerdeki görüntülerinin alınmasını sağlayacaktır.

Öncelikle, explan disosyasyon tüpünden 40 µL çözeltiyi yavaşça çekip atın. Ardından, hücreleri kültür plağına yavaşça aktarmak için aerosol dirençli uç takılmış P 100 pipetini kullanın. Hücreleri plağa aspire ederken pipetlemeyi yavaşça yapın ve hücreleri plağın merkezindeki küçük bir alanda tutun.

Bu şekil, tek bir hücrenin bir saatlik görüntüleme süresi boyunca kalsiyum aktivitesine bir örnek göstermektedir. Bu şekiller, farklı gelişim aşamalarında analiz edilen embriyonik retinal hücrelerdeki kalsiyum görüntüleme deneylerinin temsili sonuçlarını sunmaktadır. Kısaca sonuçlar, kalsiyum aktivitesinin belirli bir prob için pozitif olan hücrelerle ilişkilendirilmesi açısından, evre 35'teki sıçrama pikleri ile gelişimsel olarak düzenlendiğini göstermektedir.

Balık deneylerinde, istatistiksel olarak anlamlı farklar olmasa da, GABAerjik marker pozitif hücrelerin, glutamaterjik marker pozitif hücrelere veya GABAerjik fenotipi teşvik etme ile ilişkili bir transkripsiyon faktörünü kodlayan PT F1 A.A genine pozitif hücrelere kıyasla daha yüksek düzeyde kalsiyum spiking aktivitesi gösterme eğiliminde olduğu görülmüştür. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde tek bir plaka için işlem yaklaşık üç saat 30 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, hangi hücrelerin spesifik fenotipik markerları eksprese ettiğini belirlemek veya elektrofizyolojik kayıtları analiz etmek gibi ek soruları yanıtlamak için hücre kültürü, C iki hibridizasyonu veya elektrofizyolojik kayıtlar gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, retinal dokunun nasıl diseke edileceği, retinal dokunun nasıl dissosiye edileceği ve retinal hücrelerin nasıl plakalanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.