Name: Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Öğrenin, tavuk embriyosunda in ovo elektroporasyon ile mikroRNA tabanlı plazmidler kullanarak gen ekspresyonunu hücre tipine özgü şekilde düşürme ve nöral tüp gelişiminde komissüral akson kılavuzluk kusurlarını değerlendirme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ES laboratuarında Çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından destekleniyor. Biz filme yardım için Dr bitirin Kunz teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific%2C+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).</li>
<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu basit, vektör tabanlı bir yapay stratejinin miRNA ifade tavuk nöral tüp içinde devirme endojen gen ekspresyonu için kullanılabilir. Bu fonksiyonel araçlar karmaşık bir gelişimsel yolların aydınlatılmasında kolaylaştırmak için, birden fazla gen susturulması, zamansal kontrolü ve hücre tipi özgüllük sunuyoruz. Plazmitler commissural nöronlar ya da kendi ara hedef, zemin plakası 3 devirme gen için kullanılır dolayısıyla ayrıntılı olarak,, commissural akson yönlendirme, bu plazmid yarar göstermiştir. <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 0,5 mm cam kapilerleri </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Cam iğne çektirme </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard silikon elastomer </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Tungsten tel, 0.075 mm </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Böcek iğne, 0,20 mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Böcek iğne, 0,10 mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Bahar makas </td><td> Için Güzel Bilimols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Hızlı DII </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Floresan mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

open-kitap hazırlıklarında dii enjeksiyon tarafından geliştirilmesi nöral tüp ve fenotipleri değerlendirilmesinde mirna tabanlı plazmidler arasında ovo elektroporasyon yılında

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural DI1 nöronlar yoğun gelişim 1,2 sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları aydınlatmak çalışılmıştır. Bu nöronlar dorsal omurilikte bulunan ve basmakalıp yörüngeleri boyunca aksonları gönderebilirsiniz. Commissural akson başlangıçta yönünde ve daha sonra zemin plakası üzerinde ventral proje. Midline geçtikten sonra, bu aksonlar uzunlamasına beyin doğru keskin bir dönüş rostral ve proje yapmak. Bu adımların her biri çekici ve itici rehberlik ipuçlarının koordineli faaliyetler düzenlenir. Bu ipuçlarının doğru yorumlanmasını kendi sınırları çizilmiş yol boyunca akson rehberlik için çok önemlidir. Böylece, kılavuz commissural akson için belirli bir molekülün fizyolojik katkı ideal olarak canlı embriyo bağlamında incelenmiştir. Buna göre, in vivo gen demonte hassas dikkatle birden oynayabilir genlerin akson rehberlik faaliyetleri ayırt etmek için kontrol edilmelidirgelişimi sırasında rolleri. Burada, bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde tavuk nöral tüp knockdown gen ekspresyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz 3 hücre tipine özgü yararlanıcı / Bir floresan protein marker ekspresyonu sürücü arttırıcılar, barındıran bir miR30-RNAi transkript 4 (cDNA floresan protein 3&#39;-UTR içinde bulunan) (tarafından doğrudan takip roman plazmid vektörler kullanın Şekil 1). Gelişmekte olan nöral tüp içine electroporated, bu vektörlerin gen ifadesinin verimli baskılanması ortaya çıkarmak ve demonte 3 karşılaştığınız hücrelerin izleme doğrudan etkinleştirmek için parlak floresan işaretleyici proteinleri ifade. Elektroporasyon önce farklı RNAi vektörler Karıştırma omurilik bağımsız bölgelerinde iki ya da daha fazla genin eşzamanlı devirme izin verir. Bu hızlı bir şekilde, s, geliştirme aşamasında ele alınacak kompleks hücresel ve moleküler etkileşimler izin, uygu hassas ve ucuz. Açık kitap hazırlıkları 5 commissural akson yörünge Dii izleme ile birlikte, bu yöntem commissural akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmalar in vivo çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ilke olarak, herhangi bir hızlandıncı / kuvvetlendirici potansiyel olarak geliştirme 6 sırasında gen fonksiyonu in vivo çalışmaları için yöntem daha geniş çapta uygulanabilir hale kullanılabilir. Bu video ilk nasıl işleneceğini gösterir ve pencere yumurta, nöral tüp içine DNA plazmid enjeksiyon ve elektroporasyon prosedürü. Commissural akson rehberlik araştırmak için, spinal kord, açık-kitap hazırlanması gibi embriyo kaldırılır sabit ve akson yollar izlenebilir sağlamak için Dii ile enjekte edilir. Omurilik lamelleri arasına monte ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlandırılmaya çalışılır.

Nöral tüp içinde gen ekspresyonunu bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde aşağı regüle olabilen göre bir yöntem tarif edilmektedir. Biz nasıl gösterilmektedir<em&gt; Ovo</emSpatiotemporally kontrollü bir RNA girişim ortaya microRNA tabanlı bir plazmid&gt; elektroporasyon gelişen nöral tüp içinde commissural akson kılavuz araştırmak için kullanılabilir.

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Gelişim sırasında akson kılavuzluğunun altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için komissural dI1 nöronları kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır1,2. Bu nöronlar...

Bu prosedürün amacı, hücre tipine özgü izlenebilir bir şekilde gen ekspresyonu aşağı düzenlendikten sonra civciv nöral tüpündeki akson kılavuzlama kusurlarını değerlendirmektir. Bu işlem, yumurta kabuğuna bir pencere açılarak döllenmiş tavuk yumurtalarının in ovo elektroporasyon için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, mikroRNA'ları kodlayan DNA konstrüktlarının nöral tüpe enjekte edilmesi ve elektroporasyon uygulanmasıdır.Ardından, elektro-derecelendirilmiş spinal kordonlar diseke edilir ve düz montajlı açık kitap preparatları şeklinde sabitlenir. Son adım, aksonal projeksiyonları görselleştirmek için floresan bir boya enjekte etmektir. Nihai olarak, hem gen susturulması yaşayan hücreleri göstermek hem de komissür akson yönlendirmesi üzerindeki sonraki etkileri değerlendirmek için floresan mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genlerin hücre tipine özgü olarak susturulabilmesidir. Plazmidlerin hazırlanması için yazılı protokoldüki talimatları kontrol edin. Yumurtaları, istenilen gelişim evresine ulaşılana kadar 38.5 °C sıcaklıkta ve yaklaşık %45 nemde inkübe edin. Komissüral nöronların akson yönelimini incelemek için embriyoları, Hamburger ve Hamilton Evre 17 ile 18'e ulaşana kadar yaklaşık üç gün boyunca inkübe edin.İstenen gelişim aşamasına ulaşıldığında ve ilgilenilen protein embriyo içerisinde birikmeden önce, yumurtaları inkübatörden çıkarın ve embriyonun yumurta üst kısmındaki vitellusun üzerine yeniden konumlanması için 20 dakika boyunca sabit yatay pozisyonda bekletin. Embriyolar vitellusun üzerine yeniden konumlandıktan sonra, yumurtaları inkübatörden çıkarın ve %70 etanol ile silin. Ardından, yumurtanın uzun ekseni boyunca bir bant şeridi yerleştirin ve bir skalpel kullanarak yumurtanın küt ucunda küçük bir delik, pencere açılacak alanın köşesinde ise başka bir delik açın.Ardından, 18 gauge iğne takılmış bir şırıngayı yumurtanın küt ucundaki deliğe 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve sarısına zarar vermemeye dikkat ederek yaklaşık üç mililitre albümin aspire edin. Embriyoya zarar vermeden yumurta üzerinde pencere açmak için yatay tutulan küçük makaslar kullanın. Daha sonra pencereyi bant kullanarak kapatın.Son olarak, yumurtanın küt ucundaki deliği kapatmak için bir fırça yardımıyla eritilmiş parafin mumu uygulayın ve yumurtadaki tüm çatlakları aynı şekilde mühürleyin. Ardından yumurtayı inkübatöre geri yerleştirin. Elektroporasyon yapılacak tüm yumurtalar için işlemi tekrarlayın.Pencereli yumurtalardan birindeki bandı çıkarın ve embriyoyu Hamburger ve Hamilton'a göre evreleyin. Ardından, sağ ve sol ana vitellin venlerin bulunduğu bölgede, embriyonun kordal yarısındaki ekstra embriyonik membranları kaldırmak için pens kullanın. Gövdeye girerek membranları yaylı makasla nazikçe yırtın veya kesin ve bunları kuyruk tarafına doğru itin.Şimdi, elektroporasyon yapılacak DNA karışımını, tüp takılı bir cam mikro kapilere hafif emiş uygulayarak yükleyin. Mikro kapileri, arka ekstremitelerin hemen üzerindeki nöral tüpün merkezi kanalına yerleştirin ve enjeksiyon hacmini ağızla kontrol ederek DNA solüsyonunu enjekte edin. Mavi boya, kuyruk ucundan gelişmekte olan beynin ventrikülüne kadar yayılmalıdır.Embriyonun üzerine birkaç damla steril PBS ekleyin ve elektrotları, embriyoya veya herhangi bir kan damarına temas etmeden ön-arka aksına paralel olacak şekilde yerleştirin. Ardından elektrotları sabit tutup elektroporasyon uygulayın. Elektroporasyonun ardından elektrotları çıkarın ve yumurta akındaki denatüre proteinleri temizlemek için steril su ile hızlıca durulayın.Son olarak, embriyonun üzerine biraz daha steril PBS damlatın ve ardından yumurtayı bantla tekrar mühürleyin. Daha önce olduğu gibi, embriyonun dehidrasyonunu önlemek için düzgün mühürleme yapılması kritik önem taşır. Ardından, istenen gelişim aşamasına ulaşılana kadar embriyoyu inkübatöre geri yerleştirin.Embriyo Hamburger Hamilton 25 ila 26. evreye ulaştığında, bir pens yardımıyla embriyoyu yumurtadan çıkarın ve sil guard elastomer kaplı bir Petri kabına yerleştirin. Ekstra embriyonik membranları temizlemek için pens kullanın ve embriyoyu dorsal tarafı aşağı gelecek şekilde yatırın. Şimdi, embriyoyu boyun ve kuyruk kısımlarından nazikçe germek ve sabitlemek için 0,2 milimetrelik böcek iğneleri kullanın.Ardından, sonraki diseksiyona engel olmayacakları şekilde iğneleri açıyla yerleştirerek embriyonun ekstremitelerini sabitleyin. Doku yoğunluğunun algılanabilmesi için embriyoyu içeren kabı alttan aydınlatın. Karın boşluğunu açmak için yaylı makas kullanın ve kalp ile iç organları çıkarmak için pens yardımıyla nazikçe kazıyın.Tüm organlar tamamen çıkarıldığında, segmentlere ayrılmış omurlar ve omurilik görünür hale gelecektir. Ardından, embriyoyu 180 derece döndürün ve boyun bölgesinde omuriliğin üzerinde yer alan omurlardan sığ bir kesi yapmak için yaylı makas kullanın. Daha sonra, boyundan kuyruğa kadar omuriliğin her iki yanındaki omurlardan iki kısa boylamsal kesi yapın.Flap şeklinde açılan vertebraları spinal korddan uzaklaştırmak için pens kullanın ve ardından vertebraları kuyruk yönünde tek bir şerit halinde soyun. Sonrasında embriyoyu kuyruk ve ekstremitelerinden nazikçe gererek yeniden iğneleyin. Şimdi, nöral tüp ile dorsal kök ganglionları arasında koyu, yoğun bir doku hattı şeklinde görünmesi gereken spinal kord meningelerini belirleyin ve ardından bir ster iğne veya ince mikrocerrahi bistüri kullanarak meningeleri, boyundan kuyruğa kadar kordun her iki yanından boylamsal olarak kesin.İğnelenmiş embriyonun gerilmesi sayesinde meningesler omurilikten kolayca ayrılmalıdır. Son olarak, omuriliği kanat tomurcuğu seviyesinden ve ekstremite tomurcuğuna doğru kesin. Ardından, omuriliğin PBS içinde kalmasını sağlayarak, omuriliği rostral-kaudal bir hareketle pens yardımıyla dışarı çıkarın.İzole edilen spinal kordu bir spatula üzerine yayın ve PBS içinde %4 paraformaldehit içeren, syl guard kaplı yeni bir kaba aktarın. Ardından, düz bir preparat elde etmek için spinal kordu 0,1 milimetre boyutundaki böcek iğneleriyle dikkatlice medyal ve kuarter yönlerde sabitleyin ve paraformaldehit içinde 30 dakika ile bir saat arasında inkübe edin. Aşırı fiksasyondan kaçınmaya dikkat edin.Bu durum arka planı artıracak ve diyot difüzyonu verimliliğini azaltacaktır. Ardından paraldehiti dikkatlice dökün ve yerine PBS ekleyin. Etanol içinde 5 mg/mL fast di hazırladıktan sonra, plastik tübe bağlı küçük çaplı bir cam mikro pipetin ucunu kırın ve çözeltiyi pipet içerisine çekin.Doldurulmuş iğneyi bir PBS kabına daldırın ve boyanın iğneden sızmadığını kontrol edin. Sızıntı varsa, çap çok geniştir ve yeni bir iğne hazırlanmalıdır. Açık kitap preparatının alttan aydınlatıldığından ve Hemi kitabın lateral kenarından yaklaşık beşte bir genişlikte bulunan daha yoğun boyuna doku şeridinin konumlandırıldığından emin olun; komissural nöronların hücre gövdeleri bu koyu hattın hemen dorsalindedir.Cam mikro pipetin ucunu dokuya yerleştirin ve iğne geri çekilirken ağız pipeti kullanarak az miktarda D eye püskürtün; açık kitap boyunca her 0,5 milimetrede bir işlemi hızla tekrarlayın. Enjeksiyonlar tamamlandığında, fazla di miktarını aspire etmek ve uzaklaştırmak için bir transfer pipeti kullanın; aksi takdirde yüksek arka plan oluşacaktır.İşlemi tüm açık kitap preparatları için tekrarlayın. Ardından, boyanın aksonlar boyunca yayılmasını sağlamak için enjekte edilen preparatların bulunduğu kabı yaklaşık üç gün boyunca dört santigrat derecede bekletin. Bu sürenin sonunda, preparatları yazılı protokoldeki talimatlara göre monte edin.Enine kesitler ve açık kitap preparatları, Hamburger Hamilton Evre 18'de elektrotransfected olan Hamburger Hamilton Evre 25 ila 26 arası tavuk embriyolarından elde edilmiştir. Burada enine kesitte görüldüğü üzere, beta aktin promotörü yaygın ekspresyonu yönlendirmektedir. Ok, dorsal-ventral yönü göstermektedir.Bu görüntü, plazmit vektörlerin elektroporasyonunun ardından elde edilen floresan protein ekspresyon paternlerine bir örnek göstermektedir. Burada, açık kitap preparasyonunda beta aktin promotöründen kaynaklanan yaygın ekspresyon görülmektedir. Ok, rostral kordal yönü göstermektedir.Bu görüntü, math one enhansaı içeren bir konstrükt ile elektroporasyondan sonraki bir kesiti göstermektedir. Bu, di one nöronlarında ekspresyonu yönlendirir. Burada, math one enhansa konstrüktünden kaynaklanan ekspresyon, açık kitap preparasyonunda görülmektedir.Bu kesit, konstrüktun bilateral elektroporasyonundan sonra hawk, A one enhancer'dan kaynaklanan ekspresyonu göstermektedir. Hawk A one enhancer, ekspresyonu spesifik olarak taban plakasında (floor plate) yönlendirir. Bu açık kitap preparatı, hawk a one konstrüktünün taban plakasındaki ekspresyon paternini göstermektedir.Bu görüntü, Dai enjeksiyon bölgelerinin uygulandığı aydınlık alan görüntüsünü göstermektedir. Açık kitap hazırlığında Dai, açık kitabın lateral kenarına yakın, noktasal bir düzende enjekte edilmiştir. Elektroporasyon yapılan tarafta bu görüntü, aynı hazırlıktaki GFP ekspresyonunun görselleştirilmesini göstermektedir ve burada Dai görselleştirilmiştir.Üç günlük difüzyonun ardından, traktoryalar üzerindeki komissür gevşemeleri floresan mikroskobu altında görselleştirilebilmelidir. Normal akson traktoryaları taban plağına (floor plate) doğru büyüyecek, taban plağını geçecek ve ardından dönerek büyümeye devam edecektir. Burada görüldüğü gibi.Burada gösterilen örneğe benzer şekilde, gen susturma sonucu ortaya çıkan anormal fenotipler, arketipsel yörünge ile karşılaştırılabilir. Örnekte, bazı aksonların taban plakasında durakladığı veya karşı tarafta hatalı dönüş kararları verdiği görülmektedir. Bu prosedürü uygularken, hassas enjeksiyon ve diseksiyon basamakları boyunca dikkatli ve sabırlı olmak önemlidir.Bunlar biraz pratik gerektirir. Bu videoyu izledikten sonra, nöral tüp gelişimi sırasında gen fonksiyonlarını hücre tipine özgü bir şekilde araştırmak için RNAI plazmidlerinin nasıl enjekte edileceği ve uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl...

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Dış ifade beyin gelişiminde microRNA rolünü izah etmek için bir tekniktir. Ancak, ovo elektroporasyon kullanarak belirli alanları hedefleyen zordur. Burada, biz verimli bir şekilde seçici electroporate ventral ve dorsal orta beyin bölgeleri göstermek.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Biz Ciona intestinalis, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleri kullanarak omurgalılar bir kordalısı kardeş grubunda, geçici transgenesis ve gen demonte sunuyoruz. Bu tür yöntemler Notokordun ve baş duyusal epitel ve insan hastalıklarla ilişkili genlerin pek ortologlar dahil omurgalıların ilkel özellikleri, özellikleri bu basit omurgasız fonksiyonel genomik kolaylaştırır.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Öğrenin, tavuk embriyosunda in ovo elektroporasyon ile mikroRNA tabanlı plazmidler kullanarak gen ekspresyonunu hücre tipine özgü şekilde düşürme ve nöral tüp gelişiminde komissüral akson kılavuzluk kusurlarını değerlendirme yöntemini.

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında (Video) | JoVE Journal

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Daha fazla video keşfet