Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Bu prosedürün revizyon amacı, bir CyTOF cihazında uygun günlük ayarlamayı ve numune analizini göstermektir. İlk olarak, makine monte edilir ve açılır. Ardından, cihaz ayarları maksimum sinyale ayarlamak için optimize edilir.

Makine daha sonra numuneleri çalıştırmaya hazırdır. Son adımda, makine temizlenir ve kapatılır. Sonuç olarak, optimum hücre verileri belirli zaman gereksinimlerine göre elde edilebilir.

Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir. Günlük kurulum, ayarlama ve temizleme prosedürlerini kılavuzdan öğrenmek zordur. Birden fazla eşzamanlı yazılım adımı söz konusu olduğundan.

Bir deneye başlamadan en az 15 dakika önce uygun arka plan seviyeleri ve sinyal yoğunlukları hakkında bir fikir edinmek için deneyim kazanmanız gerekir. CyTOF yazılım programını açın ve cihaz kurulumunu seçin. Ardından kart kafesi sekmesinde, püskürtme odası mantosunun 200 santigrat dereceye ulaşmasını sağlamak için ısıtıcı açık düğmesine tıklayın.

Şırınga pompasındaki şırıngayı, milli küp su ile doldurulmuş yeni bir şırınga ile değiştirin. Ardından nebulizatörü, erişim portundan iki kez %5 Citron ile geri yıkayarak temizleyin. Kalan Citron'u çıkarmak için, Milli Q suyu ile geri yıkamayı tekrarlayın.

Ardından, argon gazı deposu vanasını açın ve makinenin önündeki Argon ışığının yanmasına neden olun. Ardından nebulizatörü tamamlama gazı girişine takın ve nebulizatörü sıvı giriş borusuna takın. Nebulizatörün ucunu, cihaz kurulum penceresinin RFG kontrol cihazı sekmesindeki ısıtma mantosundaki beyaz açıklığa sokun.

Plazmayı başlat'a tıklayın, ardından Tamam'a tıklayın. Başlatma işlemi tamamlandıktan sonra, açılan pencerede tekrar Tamam'ı tıklayın. Şimdi şırınga pompasını açın.

Şırıngayı yeniden doldururken, ses sayacını sıfırlamak için duraklatma düğmesi yerine durdur düğmesine basın Kütle sitometresini kalibre etmeden önce 20 dakika ısındığından emin olun. Makine stabilize olduktan sonra, veri toplama ayarları penceresini açmak için edinme ayarları düğmesine tıklayın. Analitler sekmesinde.

İzotop seçim panelini açmak için periyodik tabloya tıklayın. Ardından, kılavuzda listelenen DVS bilimleri ayarlama çözümündeki izotopları seçin ve kaydet'e tıklayın. Ardından, okuma başına kütle penceresini açmak için okuma başına izotoplar düğmesine tıklayın.

Darbe sayısını seçin ve yeni bir sayı girip enter tuşuna basarak y eksenini yeniden ölçeklendirin. Şimdi yeşil bir mililitre norm enjekte edilen şırıngayı tuning solüsyonu ile doldurun. Yüklemek için örnek bağlantı noktası seçiciyi çevirin.

450 mikrolitre ayar solüsyonu enjekte edin ve ardından enjekte etmek için seçiciyi çevirin. Ayarlama çözeltisi izotopları bu ekranda çizgiler olarak görünmeye başlayana kadar bekleyin. Uçuş sırasındaki sinyaller, 9, 400 ila 9, 800 bölgesi, argon gazındaki ksenon izotoplarından kaynaklanmaktadır.

Şimdi okuma penceresi başına kitlelere dönün ve yeşil oynat düğmesine tıklayın. Her renkli çizgi, analitler sekmesinden seçilen izotopları temsil eder. İzotop seviyeleri sabit olduğunda, veri toplama ayarları penceresinin parametre sekmesindeki açılır menüden mevcut seçim akımını ayarlayın.

Başlangıç penceresinde, bitirmek için sıfır girin, 10 girin. Adım değeri için 0,5 girin ve yerleşme süresi için 200 girin. Ardından kaydet'i tıklayın.

Ardından, okuma penceresi başına kitlelere geri tıklayın ve oynat'a tıklayın. İzotopların sinyallerinin nerede zirve yaptığını not ettikten sonra, cihaz kurulum penceresinin DAC kanal kurulumu sekmesine gidin. Akıma doğru aşağı kaydırın ve izotop tepe değerini girin.

Gerçek geçerli değeri ayarla'ya tıklayın ve ardından kaydet'e tıklayın. Ardından, gaz oluşturmak için açılır menüyü değiştirin. Başlangıç penceresine 0,55, bitiş penceresine 0,95, adım değeri penceresine 0,05 ve uzlaşma süresi penceresine 200 girin.

Kaydet'i tıklayın. Okuma penceresi başına kütlelere döndükten ve tekrar oynat'a tıkladıktan sonra, x ekseni şimdi telafi gazı akış hızını gösterecektir. İzotopların sinyallerinin zirve yaptığı değerlere dikkat edin ve sona doğru GD 1 55 sinyalinin hızlı artışını gözlemleyin.

Ardından DAC kanal kurulumu sekmesine dönün. Makyaj, gaz için aşağı kaydırın ve yeni izotop tepe değerini girin. Gerçek geçerli değeri ayarla'ya tıklayın.

Ardından, istenen izotopun okside karşı oranını kaydetmek için tekrar kaydet'e tıklayın. İlk olarak, ikinci bir 450 mikrolitre ayar çözeltisi enjeksiyonu yapın. Ardından parametre sekmesinde, açılır menüden zamanı seçin ve başlangıç penceresine sıfır, bitiş penceresine 10, adım değeri penceresine bir ve yerleşim penceresine 200 girin.

Okuma penceresi başına kütlelerde oynat'a tıkladıktan sonra, TM 1 69 veya TB 1 59 için daha yüksek değeri ve ayrıca GD 1 55 değerini okumak için imleci kullanın. Şimdi numune döngüsünden üç mililitre Milli Q suyu enjekte edin, ardından 500 mikrolitre DVS yıkama solüsyonu uygulayın. Kütle kalibrasyonu sekmesinde, çizgilerin yoğunluğu azalmaya başlayana kadar temizleme yıkamasının ilerlemesini izlemek için çalıştır'a tıklayın.

Ardından üç mililitre mililitre mili küp su ile devam edin ve çizgiler arka plan seviyelerine düşene kadar izleyin. Ayarlama çözeltisi izotopları için az önce gösterilen örnek izotopları girerek başlayın ve ardından kaydet'e tıklayın. Ardından, alım penceresini açın ve numune hacmi için gereken alım ayarlarını değiştirin.

Örneğin, 450 mikrolitrelik bir numune, numune döngüsünü dolduracak ve hücre verilerinin elde edilmesinde gecikmelere izin vermek için çalışması 600 saniye sürecektir. Çalıştırmadan önce alım gecikmesini en az 30 saniyeye ve dedektör kararlılık gecikmesini en az 20 saniyeye ayarlayın. Hücre örneklerini en az iki kez mili küp su ile yıkayın ve ardından örneği mililitrede en fazla 10 ila altı hücrede yeniden süspanse edin ve elde edilen hücre çözeltisini 35 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün.

Herhangi bir agregayı çıkarmak için. Şimdi geçerli örnek için yeni bir dosya adı girin. Tüm dosyaların E sürücüsüne kaydedilmesi gerektiğini unutmayın.

Ardından yüklemek için numune döngü valfini değiştirin, numuneyi enjekte edin, numune döngü valfini enjekte etmek için tekrar değiştirin ve ardından çalıştır'a tıklayın. Edinme penceresinde. Hücreler, anlık görüntü penceresinde her dikey izotop kanalında yatay işaret koleksiyonları olarak temsil edilecek ve burada gösterildiği gibi saniyede yaklaşık 300 ila 500 hücre arasında en iyi çözünürlüğü sergileyecektir.

Numunenin veri alımı bittiğinde, bir açılır pencere görünecektir. Numune çalışmasının tamamlandığını onaylamak için Tamam'a tıklayın ve ardından makineyi temizlemek için herhangi bir numune taşınmasını en aza indirmeye yardımcı olmak için her numune arasına en az 500 mikrolitre MQ su enjekte edin Kullandıktan sonra, numune döngüsüne 450 mikrolitre yıkama solüsyonu enjekte edin. Serbest metal salınımını izleyin ve ardından numune halkasını üç mililitre mililitre mili Q su ile yıkayın ve arka plan çizgi seviyeleri elde edilene kadar yıkamayı izleyin.

Ardından makineyi kapatmak için cihaz kurulum penceresinin RFG kontrolörü sekmesini seçin ve plazmayı durdur'a tıklayın. Prosedür tamamlandığında, açılır pencerede Tamam'a tıklayın ve kart kafesi sekmesi altındaki nebulizatörün çıkarılmasını önerin. Isıtıcıyı kapatın, argon beslemesindeki vanayı kapatın ve ardından püskürtme odasından çıkarmak için nebulizatörü dikkatlice geriye doğru çekin.

Ardından, numune giriş borusunu sökün ve bir kenara koyun. Tamamlama gazı giriş bağlantısını hafifçe gevşeyene kadar sökün ve ardından nebulizatörü çekerek çıkarın. Son olarak, daha önce gösterildiği gibi aynı şırınga ve hortumu kullanarak, nebulizatörün her iki portunu da %5Citron ile temizleyin ve nebulizatörü bir sonraki kullanıma kadar %5Citron ile kaplı olarak saklayın.

Kütle sitometresinin UE suyu ve DVS yıkama solüsyonu ile yeterli şekilde yıkanması, boruya ve makinenin diğer parçalarına metal emilim seviyelerini azaltacak ve bu grafiklerde görüldüğü gibi herhangi bir arka planı azaltmaya yardımcı olacaktır. Eflatun çizgi tarafından temsil edilen yanlış ayarlama, koyu mavi çizgi ile gösterildiği gibi uygun şekilde ayarlanmış numuneye kıyasla m artı 16'da oksit oluşumunu önemli ölçüde artırdı. Bu, m'de istenen sinyalleri hafifçe azaltma ve m artı 16'da istenmeyen arka plan girişimini önemli ölçüde artırma etkisine sahiptir.

Numunelerin Milli Q suyunda uygun şekilde yıkanması ve uygun şekilde seyreltilmesi, hız ihtiyacını dengelerken minimum arka plan ve hücrelerin en yüksek çözünürlüğünü sağlayacaktır. Bu deneyde gösterilen temsili bir deneyden elde edilen verilere benzer şekilde, doğal bolluk lantan 1 39 ODIUM one 40, TERBIYUM 1 59, DIUM 1 69 ve LUTESIUM 1 75 içeren polistiren boncuklar hücre edinme modunda çalıştırıldı. Veriler FlowJo kullanılarak analiz edildi ve herhangi bir kırık boncuktan kaynaklanan döküntüler dışarı çıkarıldı.

Düzgün ayarlanmış numunenin, koyu mavi çizgi ile temsil edildiği gibi dakikada 0.74 litre akış hızında olduğu belirlendi. Bu akış hızında, daha düşük akış hızlarına göre daha yüksek sinyal yoğunlukları gözlendi ve bu uygun şekilde ayarlanmış numunenin, yanlış ayarlanmış sinyallere göre M metal kütlelerinde daha yüksek sinyale ve m artı 16 oksit kütlelerinde daha az sinyale sahip olduğu gözlemlendi. M Kütlesi LANTAN 1 39 ve THULIUM 1 69'daki sinyalin yakın çekimi burada gösterilmektedir.

Tamamlama gazı akış hızının LANTAN 1 39 sinyal yoğunluğunu thulium 1 69 sinyal yoğunluğundan daha fazla etkilediğini unutmayın. Bu grafikler, sinyali m artı 16 oksit kütlesi 1, 55 ve 180 5'te gösterir, sırasıyla LANTAN 1 39 artı oh 16 ve thulium 1 69 artı oh 16 oksitlere karşılık gelir. Makyaj gazı akış hızının kütle 1 55 sinyalini kütle 180 5 sinyalinden çok daha fazla arttırdığına dikkat edin, çünkü lantan 1 39 thulium 1 69'dan daha kolay oksitlenir.

Tamamlama gazı akış hızının bir fonksiyonu olarak m ve m artı 16 sinyal yoğunluğu burada gösterilmiştir. Açık simgeler M artı 16 kütlesini temsil ederken, çizgilerin renkleri ilgili M kütlesine karşılık gelir.LANTAN 1 39 ve fiyat ODIUM 1 41 sinyal yoğunluklarının makyaj gazı akış hızından oldukça etkilendiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, CyTOF'u nasıl başlatacağınızı, düzgün bir şekilde ayarlayacağınızı, ardından numunelerinizi nasıl çalıştıracağınızı ve son olarak günlük çalışmalarınızın sonunda makineyi nasıl düzgün bir şekilde temizleyeceğinizi ve kapatacağınızı iyi anlamalısınız.