Name: Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin CyTOF kütle sitometresinin günlük ayar ve hücre örneği analizi protokolünü. Optimum sinyal elde etmek için alet kurulumu, ayar optimizasyonu ve temizlik adımlarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz geribildirim Dr Evan Newell ve Dr Sean Bendall teşekkür etmek istiyorum. Biz de Multi-lantanit içeren polistiren boncuklar bir örnek için DVS Bilimler ve Doktor Sean Bendall teşekkür etmek istiyorum. Biz NIH hibe 2 U19 AI057229 fon için minnettarız.

CyTOF için tüm hücre örneklerinin sabitlenir ve permeabilize gerekir. Bu, iridyum içeren DNA enterkalatörün daha fazla giriş sağlar, ve aynı zamanda kütle sitometresi içine enjekte hemen önce MilliQ su ve yıkama adımları sırasında yeniden süspansiyon hücre parçalama önler. 1. Start-up Kütle Sitometre arasında <ol><li> CyTOF yazılım programını açın. Enstrüman Ayarları&#39;nı seçin. Kart Kafesini sekmesinde, sağ alt köşeye gidin ve düğmesine &quot;ON&quot; Isıtıcı tıklayın. 200 ° C&#39;ye ulaşması sprey haznesi manto için yeterli zaman tanımak için ısıtıcı üzerinde istenilen zaman önce en az 15 dakika çevirin </li><li> MilliQ su ile dolu taze bir şırınga ile şırınga pompası beyaz Norm-JECT 3 ml şırınga değiştirin. </li><li> Nebulizatör Temizleme. Küçük sıvı giriş portu ve büyük gaz giriş noktası hem de 5 ile% citranox 2-3 kez çekmek için şırınga ve tüp kullanarak nebulizatör Backflush. MilliQ su t su tutmanın tekrarlayınrezidüel citranox kaldır o. </li><li> CyTOF ön panelindeki ışıklar Şekil 1&#39;deki gibi yandığını teyit için kontrol edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Almadan önce Şekil 1. CyTOF paneli ışıkları. <ol start="5"><li> Argon gazı tank valfini açın. Bu açmak için ön &quot;ARGON&quot; ışığı neden olmalıdır. </li><li> Gaz girişi makyaj nebulizatör takın. Sökün gaz boru sistemi bağlayıcı makyaj ve siyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça kaldırın. Nebulizer gaz giriş noktası kök üzerinde daha geniş bir &quot;knuckle&quot; unutmayın. Gaz giriş noktası konektörü yerleştirin. Gaz bağlantı ucuna siyah o-ring yerleştirin ve liman kök geniş kısmı geçmiş o-ring zorlamak. Make-up gaz boru üzerine beyaz konik plastik işaret dar ucu ile üst parça ve vida yerleştirin. </li><li&gt; Sıvı giriş hortumuna nebulizatör takın. Dikkatle nebulizer sonunda deliğe küçük boru yerleştirin. Bir mikropipet üzerinde durur hissediyorum benzer iki durak olacaktır. Eğer ışık direnci karşılayacak kadar Birincisi, basın; küçük hortumun ucu cam düz bölüm sonunda olmalıdır. İkincisi, uydurma içine daha fazla camın düz bölüm sonuna zorlamak için sert basın ve mühür rakoru sıkın. Isıtma manto beyaz boşluğa nebulizer sokun. </li><li> Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, &quot;Başlat Plazma&quot; tuşuna basın. Nebulizatör önceden takılmış olduğundan, &quot;OK&quot; tuşuna basın. Yazılım, chiller açın gaz akışını başlatmak ve bir plazma tutuşturmak olacaktır. Dedektör gerilimi kadar rampa olacak. Bittiğinde &quot;Plazma başlangıç ​​süreci başarıyla tamamladı&quot; söyleyerek bir pop-up penceresi olacak; basın &quot;Tamam&quot;. Yeni ışıkları (Şekil 2 ön panelde olmalıdır </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Şekil 2. Plazma ateşlenir ve start-up başarıyla tamamlandı CyTOF paneli ışıkları sonra. <ol start="9"><li> Şırınga pompası açma. Sağ üst köşesinde, şırınga pompası başlatmak ve borular yoluyla sıvı akan ve nebulizatör dıarıya başlamak için yeşil &quot;play&quot; tuşuna basın. Varsayılan şırınga ayarları 3 mL su içindir. Bu su bittiğinde örnek örnek döngü akan edilmesi için için, şırınga pompası belirli aralıklarla değiştirilmesi gerekir. Ekranın üst kısmında, sıvı şırınga pompası dışarı akıyordu ne kadar gösteren bir sayaç var. Şırınga pompası bu sayaç şırınga sonunda isabet &quot;3000&quot; ya da piston ulaştığı zaman durur. Şırınga doldurma zaman, &quot;dur&quot; yerine sayacını sıfırlamak için mavi &quot;pause&quot; düğmesine vurmalıdır. </li></ol>Kitle Sitometre e &quot;&gt; 2. Günlük Kalibrasyon <ol><li> Kitle sitometresinin kalibrasyon önce sıcak, kararlı plazma elde etmek için yaklaşık 20 dakika gerekir. Yüksek değerin% 3 altında sinyal; ayar adımların amacı &quot;Gd155&quot; (La139 + O16 oksit) tutarak Tm169 veya Tb159, istenen sinyali maksimize etmektir. Veri Toplama Ayarları penceresini açmak için Acquisition Ayarlar düğmesini tıklatın. Analitler sekmesinde, izotop seçim panelini açmak için periyodik tabloyu tıklatın. Kılavuzunda listelenen DVS Bilimleri ayarlama çözüm izotoplar seçin, ardından &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklatın. </li><li> Okuma penceresi Başına Kütle (es) açmak için düğmeye Okuma Başına İzotoplar tıklayın. Yeni bir numara girerken ve &quot;enter&quot; tuşuna basarak &quot;Bakliyat Count&quot; ve rescale y ekseni seçin. </li><li> Ayar solüsyonu ile yeşil 1 ml Norm-jesi şırınga doldurun. &quot;LOAD&quot; için örnek bağlantı noktası düğmesini çevirin, tuning çözüm 450 ul enjekte, sonra &quot;eklemesine&quot; düğmesini çevirin. Veri Acquisit ve Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki<html> iyon Ayarlar penceresinde, kitleler tarafından akan hangi izlemek için &quot;Çalıştır&quot; tuşuna basın. Sağ tarafta yüksek kütle ise, pencerenin sol tarafında, düşük değerli bir kütledir. Not: önceden argon gazı içinde ksenon izotopları (Şekil 3) bağlı TOF 9400-9800 bölgede sinyalleri olacaktır. Akort çözüm izotoplar Bu ekranda çizgiler (Şekil 4) gibi görünmeye başlayacaktır kadar bekleyin. </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Yıkama solüsyonu ve su durulama sonra çeşitli izotopları için arka plan düzeyini gösteren Şekil 3. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF 9400-9800 çevresindeki bölgeye argon gazı xenon izotoplar karşılık gelir ve her zaman mevcut olmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Kütle kalibrasyon sekme penceresi, DVS ayarlama çözüm çeşitli izotopları dikey çizgiler gösteren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol start="4"><li> Penceresi Okuma Başına Kütle (es) geri dönün ve sol üst köşede yeşil &quot;Oynat&quot; düğmesine basın. Adım 2.1 &#39;de seçilen her izotop farklı bir renkli çizgi ile temsil edilir. Varsayılan x-ekseni sn, &quot;Zaman&quot; dır. Onlar sabit oluncaya kadar farklı izotopların düzeyleri izleyin. </li><li> Akım ayarlama. Veri Toplama Ayarları penceresinin Parametre sekmesinde, açılan menüden &quot;Current&quot; seçeneğini seçin. = 0, bitiş = 10, adım değeri = 0.5, yerleşme zamanı = 200 başlayalım ve &quot;Kaydet&quot; tuşuna basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) geri tıklayınız. X-ekseni şimdi &quot;Güncel&quot; dir. Not nerede izotopları zirve (Şekil 5), ve r sinyalleri<html> ecord. Enstrüman Setup penceresinin DAC Kanallar Kurulumu sekmesi altında, &quot;Mevcut&quot; aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın &quot;Gerçek akım değeri ayarlama&quot;, sonra &quot;Kaydet&quot;. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Şekil 5. Akım ayar profili. <ol start="6"><li> Makyaj gaz Tuning. Açılır menüsüne gidin &quot;Make-up gaz.&quot; = 0.95, adım değeri = 0.05, yerleşme zamanı = 200 = 0.55, son başlayalım. Kaydetmek basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) dönün. X-ekseni şimdi &quot;Make-up gaz&quot; akış oranıdır. Kayıt burada izotopları tepe sinyaller. Sonuna &quot;Gd155&quot; sinyali (Şekil 6) hızlı artış dikkat edin. DAC Kanallar Kurulum sekmesine dönmek için &quot;Make-up gaz&quot; aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın &quot;Gerçek akım değeri ayarlama&quot;, sonra &quot;Kaydet&quot;. </li></ol>ŞEKIL 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Make-up gaz ayar profili. <ol start="7"><li> Kaydedilmesi oranı izotop vs oksit istenen. Ayarlama çözüm ikinci bir 450 ul enjeksiyonu olun. Parametre sekmesinde, açılan menüden &quot;Time&quot; öğesini, süre = 200 yerleşmeden, = 0, bitiş = 10, adım değeri = 1 başlayalım. &quot;Tasarruf&quot; a basın. Penceresinde Okuma Başına Kütlesindeki &quot;play&quot; (es) Hit. Hatları (Şekil 7) stabilize sonra, Tm169 veya Tb159 (daha yüksek bir değer) için üst sol kutulara değeri okumak için imleci kullanımı ve ayrıca &quot;Gd155&quot; değeri (daha yüksek bir değer arasında &lt;% 3). Bu değerler aynı zamanda ileride bir ayar dosyasına kaydedilebilir. </li></ol><img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Şekil 7. Akım ve Make-up gaz optimize sonra ayar çözümü sinyal intensitesi ölçümü. <ol start="8"><li> Sam temizlenmesiple döngü. DVS Yıkama Çözeltisi 500 ul ardından, örnek döngü MilliQ 3 mL su enjekte edilir. Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki &quot;run&quot; düğmesine basarak temizleme ilerleme izleyin. Çizgiler yoğunluğunu (Şekil 4) arka plan düzeyleri (Şekil 3) aşağı kadar MilliQ su ve monitör 3 ml uygulayın, sonra azalmaya başlayana kadar yıkayın. </li></ol> 3. Koşu Örnekleri <ol><li> Toplama penceresini açın. Varsayılan ayarlar:-The-Fly Analizi = Do = Çift, Çift Sayım Kalibrasyon = Veri Analiz Sinyal. Gürültü Azaltma seçilir. İstenirse, bu herhangi bir değiştirilebilir. Dosya adını girin. Tüm dosyaları E :/ / diskinize GEREKIR. </li><li> Edinimi Gecikmelerin ayarlanması. Örnek döngü ve nebulizatör arasındaki boru uzunluğu nedeniyle yaklaşık 30 sn hücre olayları kaydederken bir gecikme olacaktır. Bu nedenle, toplam &quot;Toplama gecikmesi&quot; toplam ve &quot;Dedektör styetenek gecikmesi &quot;, en az 30 saniye olmalıdır. Detektör kararlılık gecikme en az 20 saniye olmalıdır. </li><li> Veri toplama süresinin ayarlanması. &quot;Toplama zaman&quot; size örnek çalıştırmak istediğiniz saniye sayısıdır. Tüm 450 mikrolitre numune döngü Dolum 600 sn tamamlamak için gerektirir. Bu 50-100 sn numune taşınmasını en aza indirmek için çalışma süresi sonuna eklenecek önerilmektedir. </li><li> Örnek yeniden süspanse. Makine içinde tuzların birikmesi en aza indirmek için, MilliQ su içinde son bir yeniden süspansiyon, ardından hücre boyama sonunda, MilliQ su içinde en azından iki yıkamadan yapılması önerilmektedir. MilliQ su hacmi pelet Eğer ile başladığı hücre ile tüm boyama işlemi sonrası iyileşme hücre sayısına bağlı olarak değişecektir hücre süspansiyonu kullanılır. Iyi bir başlangıç ​​yeri 10 6 (başlangıç) hücre / ml &#39;dir. Tabanda sonra, agrega kaldırmak için bir hücre süzgecinden filtre. </li><li> Başlangıç ​​örnek çalıştırın. Geçerli örnek için yeni bir dosya adı girin.<html> , &quot;LOAD&quot; örnek enjekte, Toplama penceresinde o vurdu &quot;Çalıştır&quot; &quot;INJECT&quot; geri dönmek için örnek döngü valfi açın. </li><li> Hücre olayları kaydediliyor. Hücreler her dikey izotop / işaretleyici kanalı (Şekil 8) işaretleri yatay koleksiyonları gibi anlık penceresinde temsil edilecek. Kitle sitometresinin 1.000 hücre / sn kayıt olurken, hücre olaylar arasında daha iyi çözünürlük, genellikle 300-500 hücre / sn elde edilir. Bu ~ 1 hücre / ekran tazeleme bir ortalama karşılık gelir. Hücre olay sayacını tırmanmaya başlamadan önce yaklaşık 30 saniye kadar sürebilir. Bu &quot;On-the-fly&quot; veri işleme nedeniyle, herhangi bir hücre olay bilgileri kaybolur. </li></ol><img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Şekil 8. Örnek sırasında Kazanç penceresi üç ayrı hücre olaylar ile ilişkili öğelere karşılık gelen noktalar yatay satırları gösteren, çalışıyor.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın. <ol start="7"><li> Hücre olayların Kalitesi. Her bir izotop kanal, aynı zamanda, hücre olay oranında çizgiler Herhangi bir arka plan dikkat edin. Kitle sitometresinin bir arka plan üzerinde sinyal belirli bir artış olarak &quot;hücre olay&quot;, yani serbest metal veya ilişkisiz antikor &quot;hücre olayı&quot; sayısı değiştirebilir arka plan sinyali tanır. Ayrıca, çok yüksek bir konsantrasyonda hücrelere çalışan çifti olay daha fazla sayıda neden olabilir. Arkaplan ek yıkar veya daha hücre seyreltme ile azalmış olabilir. Çiftlerin artan çalışma zamanı pahasına, büyük hücreli seyreltme ile minimize edilebilir. </li><li> Örnek veri toplama tamamlanması. Toplama zamanı ulaşıldığında, veri toplama sona erecektir. Ile bir pop-up penceresi önce biraz gecikme olacak &quot;Tamam&quot; düğmesi belirir ve yine bu &quot;On-the-fly&quot; veri işleme kaynaklanmaktadır. Örnek satın alma aynı zamanda Premat durdurulabilirurely &quot;Stop&quot; düğmesine basarak. Bu durumda, zaten kayıtlı tüm hücre olaylar çıktı dosyalarına sayılır ve işlenecektir. </li><li> Her numune arasındaki MilliQ su en az 500 ul Enjeksiyon ayrıca numune taşınmasını en aza indirir. </li></ol> 4. Kullanım sonrası Temizleme Makinesi <ol><li> Çözüm yıkayın. Son örneği çalıştırın ve su ile yıkanmalıdır örnek döngü örnek döngüye yıkama solüsyonu 450 ul enjekte edildikten sonra. Adım 2.8 olarak Veri Toplama Ayarlar penceresinde (Şekil 9) Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki serbest metal serbest izleyin. Serbest metal sinyali azalmaya başladığında, MilliQ 3 mL su ile yıkayın ve arka plan düzeyi elde edilinceye kadar izlenmesi. </li></ol><img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> DVS Yıkama solüsyonu ile post-run temizlik sırasında Şekil 9. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF bölgede 9800-11000 yılında dikey çizgiler makineden temizlendi antikor-etiket izotopları vardır. TOF 11500 çevresindeki dikey çizgiler iki Ir enterkalatörün izotopu karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . 5. Makine Kapatma <ol><li> Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, &quot;Plazma durdur&quot; seçeneğini seçin. Işlemi tamamlandığında, nebulizatör kaldırmak isteyen bir pop-up penceresi olacak. &quot;Tamam&quot; tuşuna basın. Kart Kafesini sekmesinde, ısıtıcıyı kapatın. Argon kaynağı vanasını kapatın. </li><li> Nebulizer Kaldırma. Dikkatle geriye çekerek sprey odasından nebulizatör çıkarın. Sökün numune tanıtım Adım 1.6 hortumu ve bir kenara koyun. Biraz gevşetmek için sökün makyaj gaz giriş bağlantısı, sonra nebulizatör çekin. Birlikte vidalı montaj Leaving l şansını azaltacaktırsiyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça osing. </li><li> Nebulizatör Temizleme. Adım 1.3 olarak şırınga ve tüp kullanarak% 5 citranox ile nebulizer iki port Backflush. Mağaza, sonraki kullanıma kadar% 5 citranox içinde kaplı. </li></ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

İnsan İmmün İzleme Merkezi, kitlesel sitometri dahil testlerin maliyeti kurtarmak için sadece kullanıcı ücretleri ücretleri Stanford Üniversitesi&#39;nde bir hizmet merkezinde yazarlar her iki çalışma.

Son birkaç yıldır, floresans akış sitometri yüzey ekspresyonu açısından ve fonksiyonel testleri, hem tek hücre analizi için bir beygir yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar spektral örtüşme sorunları eşzamanlı belirteçlerin sayısını sınırladı. 12&#39;den fazla eşzamanlı işaretleyiciler kullanılarak deneyler bildirilmiştir ederken, gerekli tazminat miktarı bu teknik zorlaştırmaktadır. Bunun yerine florofor, kitle sitometri antikorları için etiket gibi metaller için şelat siteleri ile polim...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CyTOF TM kitle sitometresinde </td><td> DVS Bilimleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Çözüm yıkayın </td><td> DVS Bilimleri </td><td> 201071 </td><td> Su içinde% 0.05 hidroflorik asit </td></tr><tr><td> Çözüm Tuning </td><td> DVS Bilimleri </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, iz nitrik asit </td></tr><tr><td> Eu içeren polistiren boncuklar </td><td> DVS Bilimleri </td><td> 201073 </td><td> Yaklaşık 1 milyon / mL &#39;de verilen boncuklar; doğal bolluk Eu izotoplar içerir </td></tr><tr><td> Multi-lantanit içeren (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polistiren boncuklar </td><td> DVS Bilimleri </td><td> Henüz piyasada bulunan </td><td> Listelenen lantanitler doğal bolluk izotoplar içerir </td></tr><tr><td> Nitrik asit (konsantre) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima iz-metal saf ICP-MS dereceli </td></tr><tr><td> Polistiren yuvarlak tabanlı tüp hücre süzgeç kap-5ml ile </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> Enjeksiyon öncesi hücre örneklerinin filtrelemek için kullanılır </td></tr><tr><td> Norm-JECT tuberkulin şırınga 1ml </td><td> Henke Sass Wolf, </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikonsuz, lateks içermeyen </td></tr><tr><td> Norm-JECT şırınga-3 mL </td><td> Henke Sass Wolf, </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikonsuz, lateks içermeyen </td></tr><tr><td> MilliQ su </td><td></td><td></td><td> 18 MΩ saf su, cam veya ticari deterjan (baryum mevcut yüksek düzeyleri nedeniyle) ile yıkanmış plastik şişelerde muhafaza edilmemelidir. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> asit deterjan </td></tr><tr><td> Argon gazı </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999% Ultra yüksek saflıkta </td></tr></tbody></table>

kütle sitometri: bir cytof kütle sitometre daily tuning ve koşu hücre Örnekleri için protokol

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Son yıllarda, tek hücrelerin hızlı analiz genellikle akış sitometrisi ve floresan-etiketli antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, fluorofor emisyon spektral örtüşme sorunu eşzamanlı probların sayısını sınırladı. Buna karşılık, daha çok floroforlar göre bir ICP-MS. 1 bir sıvı tek hücreli giriş sistemi DVS Sciences çiftler tarafından yeni CyTOF kütle sitometresinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metal şelatlama izotopları ihtiva eden polimerler, antikorlar ya da başka özel problar ile birleştirilir. 2-5 Çünkü metal saflık ve kitle sitometresinin kütle çözünürlüğü, komşu izotoplar hiçbir &quot;spektral örtüşme&quot; olduğunu ve bu nedenle tazminat matrisler gerek. Buna ek olarak, lantanit metallerinin kullanımına bağlı olarak, otoflöresans herhangi bir eşdeğer bu nedenle hiçbir biyolojik arka plan ve. Atomik kütle 103-203, teorik olarak en fazla 100 etiket eşzamanlı ayırtedilebilecektir kapsayan kitlesel bir pencere bulunmaktadır. Şu anda, 35&#39;ten fazla kanalı örneklerin immünolojik profili görülmemiş diseksiyonu izin DVS Bilimler edinilebilir şelatlama reaktifler kullanılarak kullanılabilir. 6-7 Kitle sitometri için Dezavantajları prob başına ayrı bir metal izotop (ileri veya yan dağılım hiçbir eşdeğeri) ve yıkıcı bir tekniktir (kurtarma sıralama ihtimalinin) olması için sıkı gereksinimi vardır. Kütle sitometresinin akım konfigürasyonu, aynı zamanda tek bir hücre iletim hızı ~% 25, ​​ve böylece hücrelerin daha yüksek giriş numarası gerektiren sahiptir. Kitle sitometresinin Optimal günlük performans birkaç adım gerektirir. Optimizasyon temel hedefi M sinyal yoğunluğu azaltmak ve M +16 de istenilen sinyal ile müdahale edeceğini oksitler (M +16) oluşumunu azaltırken istenen metal izotopları (M) ölçülen sinyal yoğunluğunun maksimize etmektir. İlk adım, makinenin çok sıcak, istikrarlı Ben ısınmak içinCP plazma kurulmuştur. İkincisi, güncel ve makyaj gaz akış hızı ayarlarına günlük olarak optimize edilmelidir. Numune toplama sırasında yüksek hücre olay hızı detektörü verim ve işlem hızı 1000 hücre / dakika ile sınırlıdır. Bununla birlikte, daha düşük bir hücre olay oranı (300-500 hücre / saniye), örnek kalitesine bağlı olarak, genellikle hücre olaylar arasında ve böylece daha iyi bir çözünürlüğe çiftler çifti ve kalıntı fazla bozulmadan singlet en üst düzeye izin vermek için arzu edilir. Son olarak, günün sonunda makinenin uygun temizleme serbest metale bağlı olarak arka plan sinyali en aza indirir.

Yukarıdaki protokolü takiben dört şeyi başarmak gerekir. İlk olarak, kitle sitometresi için yeterli ısınma süresi sağlayan optimal sinyal ve minimal oksit oluşumu için gerekli bir sıcak, kararlı plazma üretecek. MilliQ su ve DVS Yıkama solüsyonu (Şekil 9) ile kitle sitometresinin İkincisi, yeterli yıkama (Şekil 8) örnek toplama sırasında arka plan azaltmaya yardımcı, metal adsorpsiyon düzeyleri tüp ve makinenin diğer parçaları azaltmaya yardımcı olacaktır. Ayrıca makinede sıkışmış ve bö...

Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on tartışılır

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Son yıllarda, tek hücrelerin hızlı analizi yaygın olarak akış sitometrisi ve floresan işaretli antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, ...

Bu prosedürün genel amacı, bir CyTOF cihazının günlük kalibrasyonunun ve örnek analizinin doğru şekilde nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. İlk olarak, cihaz kurulur ve açılır. Ardından, cihaz ayarları maksimum sinyali alacak şekilde kalibrasyon için optimize edilir.Cihaz artık örnekleri çalıştırmaya hazırdır. Son adımda, cihaz temizlenir ve kapatılır. Nihayetinde, belirli zaman gereksinimlerine göre optimal hücre verileri elde edilebilir.Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Günlük kurulum, ayarlama ve temizleme prosedürlerinin kılavuzdan öğrenilmesi zordur; çünkü süreçte eş zamanlı olarak yürütülmesi gereken birden fazla yazılım adımı bulunmaktadır.Uygun arka plan seviyeleri ve sinyal yoğunlukları hakkında bir fikir edinmek için deneyim kazanmanız gerekir. Deneye başlamadan en az 15 dakika önce CyTOF yazılım programını açın ve instrument setup seçeneğini belirleyin. Ardından card cage sekmesinde, sprey odası kılıfının 200 °C sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için heater on düğmesine tıklayın.Şırınga pompasındaki şırıngayı, milli cube su ile doldurulmuş yeni bir şırıngayla değiştirin. Ardından, her porttan ikişer kez %5 Citron ile geri yıkama yaparak nebülizatörü temizleyin. Kalan Citron kalıntılarını gidermek için geri yıkama işlemini Milli Q su ile tekrarlayın.Ardından, cihazın önündeki argon ışığının yanmasını sağlayacak şekilde argon gaz tankı valfini açın. Daha sonra nebulizörü taşıyıcı gaz girişine ve nebulizörü sıvı giriş borusuna bağlayın. Nebulizörün ucunu, cihaz kurulum penceresindeki RFG kontrol sekmesinde bulunan ısıtıcı kılıfın beyaz açıklığına yerleştirin.Plazmayı başlat (start plasma) düğmesine, ardından tamam (okay) düğmesine tıklayın. Başlatma işlemi bittikten sonra, açılan pencerede tekrar tamam (okay) düğmesine tıklayın. Şimdi şırınga pompasını açın.Enjektörü yeniden doldururken, hacim sayacını sıfırlamak için duraklatma düğmesi yerine durdurma düğmesine basın. Kütle sitometresini kalibre etmeden önce, cihazın 20 dakika boyunca ısındığından emin olun. Makine stabilize olduğunda, veri toplama ayarları penceresini açmak için veri toplama ayarları düğmesine tıklayın. Analitler sekmesinde.İzotop seçim panelini açmak için periyodik tabloya tıklayın. Ardından, kılavuzda listelenen DVS sciences kalibrasyon çözeltisindeki izotopları seçin ve kaydet'e tıklayın. Sonrasında, okuma başına kütleler penceresini açmak için okuma başına izotoplar butonuna tıklayın.Yeni bir sayı girip ardından enter tuşuna basarak darbeler sayısını seçin ve y eksenini yeniden ölçeklendirin. Şimdi, bir mililitrelik yeşil bir norm enjektör şırıngasını ayar çözeltisiyle doldurun. Numune port seçicisini load konumuna getirin.450 µL ayarlama solüsyonu enjekte edin ve ardından seçiciyi enjekte konumuna getirin. Ayarlama solüsyonu izotopları bu ekranda çizgiler şeklinde görünmeye başlayana kadar bekleyin. Uçuş süresi 9.400 ile 9.800 bölgesi arasındaki sinyaller, argon gazındaki xenon izotoplarından kaynaklanmaktadır.Şimdi okuma penceresi başına kütlelere geri dönün ve yeşil oynatma düğmesine tıklayın. Her renkli çizgi, analitler sekmesinden seçilen izotopları temsil eder. İzotop seviyeleri sabitlendiğinde, veri toplama ayarları penceresinin parametre sekmesindeki açılır menüden mevcut akımı ayarlayın.Başlangıç penceresinde, bitiş için sıfır, bitiş için ise 10 girin. Adım değeri için 0,5 ve yerleşme süresi için 200 girin. Ardından kaydet'e tıklayın.Ardından, okuma başına kütleler (masses per reading) penceresine geri tıklayın ve oynat düğmesine basın. İzotopların sinyallerinin nerede zirve yaptığını not ettikten sonra, cihaz kurulum penceresinin DAC kanal kurulum sekmesine gidin. Akım (current) kısmına kadar aşağı kaydırın ve izotop pik değerini girin.Gerçek akım değerini ayarla (set actual current value) seçeneğine tıklayın ve ardından kaydedin. Sonrasında, açılır menüyü gaz oluşturma (make up gas) olarak değiştirin. Başlangıç penceresine 0.55, bitiş penceresine 0.95, adım değeri penceresine 0.05 ve yerleşme süresi penceresine 200 girin.Kaydet'e tıklayın. Okuma başına kütleler penceresine dönüp tekrar oynat'a tıkladıktan sonra, x ekseni artık tamamlayıcı gaz akış hızını görüntüleyecektir. İzotop sinyallerinin tepe yaptığı değerleri not edin ve sona doğru GD 1 55 sinyalindeki hızlı artışı gözlemleyin.Ardından DAC kanal kurulum sekmesine geri dönün. Makeup gaz bölümüne aşağıya inin ve yeni izotop pik değerini girin. Set actual current value seçeneğine tıklayın.Ardından, istenen izotopun oksite oranını kaydetmek için tekrar kaydete tıklayın. İlk olarak, 450 µL'lik ikinci bir ayar çözeltisi enjeksiyonu yapın. Daha sonra parametre sekmesinde, açılır menüden zamanı seçin ve başlangıç penceresine sıfır, bitiş penceresine 10, adım değeri penceresine bir ve oturma penceresine 200 girin.Okuma başına kütleler penceresinde oynat düğmesine tıkladıktan sonra, imleci kullanarak TM 1 69 veya TB 1 59 için daha yüksek değeri ve ayrıca GD 1 55 değerini okuyun. Şimdi numune döngüsü üzerinden üç mililitre Milli Q su, ardından 500 mikrolitre DVS yıkama çözeltisi enjekte edin. Kütle kalibrasyonu sekmesinde, çizgilerin şiddeti azalmaya başlayana kadar temizleme yıkamasının ilerlemesini izlemek için çalıştır'a tıklayın.Ardından üç mililitre milli cube su ekleyin ve çizgiler arka plan seviyelerine düşene kadar izleyin. Ayarlama çözeltisi izotopları için az önce gösterilen örnek izotoplarını girerek başlayın ve ardından kaydete tıklayın. Sonrasında, veri toplama penceresini açın ve veri toplama ayarlarını örnek hacmine göre gerektiği şekilde değiştirin.Örneğin, 450 µL'lik bir örnek örnek döngüsünü dolduracak ve hücre verilerinin elde edilmesindeki gecikmeleri tolere etmek için 600 saniyede çalışacaktır. Çalıştırmadan önce veri toplama gecikmesini en az 30 saniye ve detektör stabilite gecikmesini en az 20 saniye olarak ayarlayın. Hücre örneklerini milli cube su ile en az iki kez yıkayın ve ardından örneği mililitre başına maksimum 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve elde edilen hücre çözeltisini 35 µm'lik bir hücre süzgecinden filtreleyin.Herhangi bir agregatı gidermek için. Şimdi mevcut örnek için yeni bir dosya adı girin. Tüm dosyaların E sürücüsüne kaydedilmesi gerektiğini unutmayın.Ardından numune döngü valfini yükleme konumuna getirin, numuneyi enjekte edin, numune döngü valfini tekrar enjekte konumuna getirin ve ardından çalıştır'a tıklayın. Kazanım penceresinde, hücreler anlık görüntü penceresinde her bir dikey izotop kanalındaki yatay işaret toplulukları şeklinde temsil edilecek ve burada gösterildiği gibi saniyede 300 ila 500 hücre civarında en iyi çözünürlüğü sergileyecektir.Numunenin veri toplama işlemi tamamlandığında bir açılır pencere görünecektir. Numune analizinin tamamlandığını onaylamak için tamam'a tıklayın ve ardından makineyi temizlemek ve numune taşınmasını minimuma indirmek için her numune arasında en az 500 µL MQ su enjekte edin. Kullanım sonrası, numune döngüsüne 450 µL yıkama solüsyonu enjekte edin. Serbest metal salınımını izleyin ve ardından arka plan çizgi seviyeleri elde edilene kadar yıkamayı takip ederek numune döngüsünü üç mL milli Q su ile yıkayın.Ardından cihazı kapatmak için, enstrüman kurulum penceresinin RFG kontrolcü sekmesini seçin ve plazmayı durdur (stop plasma) seçeneğine tıklayın. İşlem tamamlandığında, kart kafesi sekmesi altındaki nebulizatörün çıkarılmasını öneren açılır pencerede tamam (okay) düğmesine tıklayın. Isıtıcıyı kapatın, argon beslemesi üzerindeki valfi kapatın ve ardından nebulizatörü püskürtme odasından çıkarmak için dikkatlice geriye doğru çekin.Ardından, numune giriş tüpünü vidalarını gevşeterek çıkarın ve kenara koyun. Yardımcı gaz giriş bağlantısını hafifçe gevşeyene kadar sökün ve ardından nebülizörü çekerek çıkarın. Son olarak, daha önce gösterilen şırınga ve tüpü kullanarak nebülizörün her iki portunu %5 Citron ile temizleyin ve nebülizörü bir sonraki kullanıma kadar %5 Citron ile kaplı şekilde saklayın.Kütle sitometresinin UE suyu ve DVS yıkama solüsyonu ile yeterince yıkanması, tüplere ve makinenin diğer parçalarına metal absorbsiyon seviyelerini düşürerek bu grafiklerde görülen arka plan gürültüsünün azaltılmasına yardımcı olacaktır. Macenta renkli çizgi ile temsil edilen hatalı ayarlama, koyu mavi çizgi ile gösterilen düzgün ayarlanmış örneğe kıyasla m artı 16'daki oksit oluşumunu önemli ölçüde artırmıştır. Bu durum, m'deki istenen sinyallerin hafifçe azalmasına ve m artı 16'daki istenmeyen arka plan girişiminin önemli ölçüde artmasına neden olur.Numunelerin uygun şekilde yıkanması ve Milli Q suyu ile uygun şekilde seyreltilmesi, hız gereksinimi ile dengelenirken minimum arka plan ve maksimum hücre çözünürlüğü sağlayacaktır. Burada gösterilen temsili bir deneyden elde edilen verilere benzer şekilde, bu deneyde doğal bollukta lantanum 1 39 ODIUM bir 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 ve LUTETIUM 1 75 içeren polistiren boncuklar hücre kazanım modunda çalıştırılmıştır. Veriler FlowJo kullanılarak analiz edilmiş ve kırılmış boncuklardan kaynaklanan kalıntılar kapı ayarlarıyla (gating) dışlanmıştır.Doğru şekilde ayarlanmış numunenin, koyu mavi çizgi ile temsil edilen dakikada 0,74 litrelik akış hızında olduğu belirlenmiştir. Bu akış hızında, daha düşük akış hızlarına kıyasla daha yüksek sinyal yoğunlukları gözlemlenmiş ve doğru şekilde ayarlanmış bu numunenin, yanlış ayarlanmış sinyallere göre M metal kütlelerinde daha yüksek sinyal, m artı 16 oksit kütlelerinde ise daha düşük sinyal verdiğinin görülmüştür. LANTHANUM 1 39 ve THULIUM 1 69 M Kütlesindeki sinyalin yakın plan görünümü burada gösterilmiştir.Tamamlama gazı akış hızının LANTHANUM 1 39 sinyal yoğunluğunu, thulium 1 69 sinyal yoğunluğundan daha fazla etkilediğine dikkat edin. Bu grafikler, sırasıyla LANTHANUM 1 39 artı oh 16 ve thulium 1 69 artı oh 16 oksitlerine karşılık gelen m artı 16 oksit kütleleri 1 55 ve 180 5'teki sinyalleri göstermektedir. Lanthanum 1 39, thulium 1 69'dan daha kolay oksitlendiği için, tamamlama gazı akış hızının kütle 1 55 sinyalini, kütle 180 5 sinyaline göre çok daha fazla artırdığına dikkat edin.Burada, m ve m artı 16 sinyal yoğunluklarının tamamlayıcı gaz akış hızına bağlı fonksiyonu gösterilmiştir. Dolu simgeler MASS M'yi temsil ederken, boş simgeler m artı 16 kütlesini temsil etmektedir; çizgilerin renkleri ise ilgili kütle M'ye karşılık gelmektedir. LANTHANUM 1 39 ve price ODIUM 1 41 sinyal yoğunluklarının tamamlayıcı gaz akış hızından yüksek derecede etkilendiğine dikkat edin. Hatta m artı 16 oksit kütlesinin, M kütlesinden daha fazla olduğu bir noktaya ulaşılabilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, CyTOF cihazını nasıl düzgün şekilde başlatacağınız, doğru şekilde kalibre edeceğiniz, ardından numunelerinizi nasıl analiz edeceğiniz ve son olarak günlük analizlerinizin sonunda cihazı nasıl uygun şekilde temizleyip kapatacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, farklı hücre barkodlaması için ağır metal konjuge antikorlar kullanan tek hücreli bir proteomik yöntemi vurgulamaktadır. Daha sonra, insan tam kan kaynaklı immün hücrelerdeki immün fenotipik ve fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için immün boyama ve kitle sitometrisi uygulanır.

İmmün Hücrelerin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu için Bir Barkodlama Testi

Bu video, çift yaşlanma belirteçleri ile tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Yaşlanan hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi, bir β-galaktosidaz substratının kullanılmasını içerir. Substrat, yaşlanan hücreler içindeki aktif lizozomal β-galaktosidaz ile parçalanır ve otofloresan lipofusin granülleri ile birlikte yaşlanan kanser hücrelerini işaretleyen bir floresan ürün üretir.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinin Akış Sitometrisine Dayalı Miktar Tayini

Bu makale, kütle sitometrisi analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklamaktadır.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini bir kütle sitometri platformunda kullanılmak üzere uyarlar. Kütle sitometrisinin çok parametreli yetenekleriyle, iyot katılımının doğrudan ölçümü, S-fazındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verirken, hücre içi döngü belirteçleri, her bir hücre döngüsü durumunun bir dizi deneysel koşulda karakterizasyonunu sağlar.

Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Öğrenin CyTOF kütle sitometresinin günlük ayar ve hücre örneği analizi protokolünü. Optimum sinyal elde etmek için alet kurulumu, ayar optimizasyonu ve temizlik adımlarını keşfedin.

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Daha fazla video keşfet