Hafif Travmatik Beyin Hasarı takiben Hipokampal Devre İşlev değişimler üzerine araştırmalar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hafif travmatik beyin hasarının deneysel bir modelinden etkilenen beyin bölgelerinin ağ işlevindeki değişiklikleri araştırmaktır Deneyler, insan hafif travmatik beyin hasarının hem patolojisini hem de semptomolojisini taklit eden bir fareye lateral sıvı perküsyon yaralanması uygulayarak başlar. İkinci adım olarak, beyin hasarına bağlı bilişsel bozukluğu değerlendirmek için hipokampal bağımlı bir davranış, bağlamsal koşullu korku tepkisi kullanılır. Daha sonra, uyarıcı ve inhibitör sinaptik iletim arasındaki sinaptik dengedeki bölgesel olarak spesifik değişiklikleri belirlemek için voltaja duyarlı boyalarla birlikte hücre dışı ve hücre içi kayıtlar kullanılır İlgilenilen bölgede, hipokampusta, sonuçlar, açıklanan üç kayıt tekniği boyunca kontrol ve beyin hasarı olan fareler arasındaki farklılıklara dayalı olarak hipokampusta net sinaptik etkinlikte alt bölgeye özgü değişiklikleri göstermektedir.

Bu yaklaşımın temel avantajı, hem patolojik durumun hem de potansiyel terapötiklerin çoklu fizyolojik ölçekler üzerindeki etkilerini ayırt etme yeteneğidir ve bu devre eksikliklerinin daha tutarlı bir resmini sağlar. Bu yöntem, özellikle hangi nöronların yaralanmaya en duyarlı olduğu gibi travmatik beyin hasarı ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve bu nedenle yaralanma sonrası hipokampal disfonksiyona en büyük katkıyı sağlar. Yaklaşımımızın sonuçları, travmatik beyin hasarının tedavisine doğru uzanır, çünkü önce altta yatan mekanizmaları tanımlamamıza ve daha sonra beyin hasarından zarar görmüş alanlarda bir droid fizyolojisini eski haline getirmek için potansiyel tedaviler geliştirmemize izin verir.

Bu prosedürde, intraperitoneal verilen ketamin ve ksilazin karışımı kullanılarak fareyi uyuşturun. Daha sonra, üç milimetre dış çapa sahip bir çatal kullanarak sağ parietal alan üzerinde bir C kraniektomi gerçekleştirin. Ardından, siyanoakrilat ve diş akrilik kullanarak yem kilit iğnesi göbeğini C kraniektomi üzerine sabitleyin.

24 saat sonra, inhalasyon yoluyla isof flor kullanarak fareyi uyuşturun Normal solunum devam ettiğinde, ancak fare stimülasyona duyarlı hale gelmeden önce, sıvı perküsyon yaralanma cihazı aracılığıyla kafatasına 20 milisaniyelik bir salin darbesi verin. Yaralanmadan hemen sonra göbeği çıkarın. Daha sonra, fareyi flor kullanarak yeniden uyuşturun ve kafa derisini dikin.

Koşullu korku tepkisi eğitiminden önce fareyi art arda iki gün tutun. Eğitim gününde, 1.5 dakikalık bir uygulama yapmadan önce fareyi üç dakika boyunca kondisyon odasına yerleştirin. Ardından, çıkarmadan önce fareyi 30 saniye daha haznede bırakın.

24 saatlik bir gecikme süresinden sonra, fareyi beş dakika boyunca bakım odasına geri koyun, ardından yaralanmadan yedi gün sonra beş saniyelik aralıklarla donmayı değerlendirin. Bir litre yapay beyin omurilik sıvısı ve 250 mililitre sükroz kesme çözeltisi hazırlayın. Beyin dilimi hazırlama sırasında kullanılan tüm aletlerin ve solüsyonların buz gibi ve buz gibi olduğundan emin olun.

Fareyi flor kullanarak hızlı ve nazikçe uyuşturun. Beyni fareden çıkarın ve sakarozun içine yerleştirin. Sonra, beyni düzeltin.

Beynin yeni kesilmiş coddle yüzeyini, bir agar bloğunun önündeki Vibram sahnesinde bir damla süper yapıştırıcı üzerine yerleştirin. 350 mikron kalınlığında koronal dilimler kesin. Sağlam hipokampal devre ile dört veya beş dilim elde edebilmelisiniz.

Bundan sonra, dilimleri 37 santigrat derecede en az bir saat inkübe edin. Şimdi iki ila beş mega ohm bo silikat cam elektrot hazırlayın. Dikey çekiciyi kullanarak, hazneye bir dilim aktarın, ardından hücre dışı alan potansiyeli kaydı için elektrot tutucusuna bir elektrot yerleştirin.

Uyarıcı elektrodu, perent yolu veya Shafer teminatları gibi dilim üzerindeki aksonal kanalın üzerine yerleştirin. Ardından kayıt elektrodunu dilimin içine indirmeye devam edin. Ardından, hücre dışı postsinaptik potansiyeli uyandırmak için tek bir elektrik darbesi verin.

Maksimum yanıt elde edildiğinde uyaranlar arasında kayıt elektrodunun derinliğini değiştirerek stimülasyona devam edin. Bu, elektrotların aynı olduğunun bir göstergesidir. Z seviyesi analizi tipik olarak, pre-sinaptik aktivasyonu değerlendirmek için hem beyin hasarlı hem de sahte ameliyatlı farelerde fiber voleybolunun genliğini karşılaştıran ölçümlerden oluşur ve ayrıca yama klemp kaydı için post-sinaptik aktivasyonu değerlendirmek için F-E-P-SP'nin eğimini karşılaştırır, odaya bir dilim aktarın ve kayıt elektrodunu indirin.

Kayıt elektrodunun doku boyunca aşağı doğru hareket ederken tıkanmamasını sağlamak için elektrot üzerinde pozitif basınçla bir hücreye yaklaşın. Elektrot hücreye hafifçe dokunduğunda, elektrot ile plazma zarı arasında giga bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Ardından, tüm hücre konfigürasyonunu elde etmek için plazma zarını yırtmak için kısa süreli negatif basınç patlamaları uygulayın.

Amplifikatörü kullanarak geçici kapasitansı ortadan kaldırın ve doğru ölçümleri sağlamak için seri direnci telafi edin. Daha sonra, hem beyin yaralı farelerde hem de sahte olarak çalıştırılan kontrollerde spontan sinaptik akımların oranını ve boyutunu ölçün ve karşılaştırın. Bu adımda, bir miligram boya üç onap DHQ'yu 50 mikrolitre etanol içinde karıştırarak boya stoğunu hazırlayın.

İki mikrolitrelik alikotu folyo sarılı tüplere dağıtın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Çalışma boyası çözeltisini günlük olarak A BOS'ta bir ila 200 seyreltme şeklinde yapın. Daha sonra A BOS nemli filtre kağıdı üzerinde bir dilim inkübe edin ve 90 mikrolitre boya ile 16 dakika boyunca boyayın.

Bundan sonra, durulayın ve arayüz kayıt odasına yerleştirin. Uyarıcı ve kayıt elektrotlarını hücre dışı alanda tarif edildiği gibi yerleştirin. Potansiyel kayıt.

Yanıt kameranın ortasında ortalanana kadar ışık stimülasyon yoğunluğunu ayarlayın. Aralık görüntüleri genellikle saniyede 500 ila 1000 kare hızında elde edilir. İlk hızlı fotoğraf ağartmanın stabilize olmasını sağlamak için elektrik stimülasyonundan 200 milisaniye önce ışık stimülasyonu için deklanşörü tetikleyin.

Denemeler arasında 10 saniye duraklama. Elektriksel olmayan stimülasyon arka planının daha sonra çıkarılmasına izin vermek için elektriksel stimülasyon ve elektriksel olmayan stimülasyon arasındaki edinme denemelerini değiştirin. Ardından, deklanşörü açmadan önce dinlenme ışığı yoğunluğunu kaydedin.

Her VSD denemesi, floresan ölçümlerinin bir filmi olarak analiz edilebilir. Diğer bir deyişle, her deneme, zaman boyunca X ve Y uzamsal boyutlarında değerlere sahip üç boyutlu bir veri matrisidir. Her test koşulunda 10 ila 12 VSD denemesi kaydedin ve ekteki el yazmasına göre piksel içi ön aydınlatma normalleştirilmiş floresan değişimini hesaplayın.

Bu şekil, CA birinci alanındaki bir F-E-P-S-P kaydı örneğini göstermektedir. İlk aşağı doğru sapma, uyaran artefaktıdır, ardından presinaptik fiber voleybolu ve ardından F-E-P-S-P. gelir. Burada, sıvı perküsyon yaralanmasını takiben CA bir'de net sinaptik etkinlikte bir azalmayı gösteren giriş çıkış eğrileri verilmiştir.

Ve burada, FPI'yi takiben dentat girusta net sinaptik etkinlikte bir artışı gösteren giriş çıkış eğrileri verilmiştir. Burada, gösterilen bir CA bir parametal hücresinden spontan uyarıcı post-sinaptik akımın bir örneği verilmiştir. İşte bir CA bir parametal hücresinden ve hızlı sivrilen bir ca bir inter nörondan gelen aksiyon potansiyeli treninin bir örneği.

Bu, dendritik dikenleri olmayan bir Lucifer sarı dolgulu ca bir inhibitör inter nöron, ve burada dendritik dikenleri olan bir Lucifer sarı dolgulu ca bir parametal nöron. Bu rakamlar bir fare koronal hipokampal dilimini göstermektedir. Sarı ila kırmızı pikseller, afferent shafer kollateral stimülasyonundan yaklaşık 14 milisaniye sonraki alandaki uyarıcı aktiviteyi temsil eder.

Kırmızı, daha fazla depolarizasyonu gösterirken, sarı daha az ama yine de önemli bir depolarizasyonu gösterir. Mavi pikseller, aynı Afferent Shafer kollateral stimülasyonundan yaklaşık 1 56 milisaniye sonra alandaki inhibitör aktivite bölgelerini temsil ederken, daha koyu mavi daha fazla hiperpolarizasyonu gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, devre disfonksiyonunu içeren klinik olarak ilgili bir patolojik durumu ele almak için birden fazla ex vivo kayıt tekniğini nasıl birleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.