Name: Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Öğrenin, C. elegans'ın yüzme davranışını lazer kırınım desenleriyle analiz etmeyi. Bu yöntem, mikroskobik organizmaların üç boyutlu ortamdaki lokomosyonunu gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz teknik yardım için Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello ve Karl Spuhler ederim. Bu çalışma Vassar Koleji Lisans Araştırma Yaz Enstitüsü (URSI), Lucy Maynard Salmon Araştırma Fonu ve NASA ödülü # NX09AU90A, Bilim ve Teknoloji Araştırma Mükemmellik Ulusal Bilim Vakfı Merkezi (NSF-CREST) ​​ödülü # 0630388 ve NSF tarafından desteklenmiştir Ödül # 1058385.

1. C. Video Analizi için elegans Hazırlık <ol><li> Bir ince, düzleşmiş platin tel çekme kullanarak taze NGM agar dolu Petri plakalarına 10-20 gravid erişkin nematodlar taşıyın. NGM agar ile dolu petri E. küçük dairesel noktayı içerecek coli yemek nematodlar için (bir büyüme sınırlı zorlanma, OP50, iyi sonuç verir). Nematodlar 3-5 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin ver ve sonra böylece 50-150 nematod küçük, gelişimsel-senkronize kültürünün oluşturulması, yetişkin çıkarın. Nematodlar 4-5 gün süre ile 20 ° C&#39;de Petri plakalar inkübe ederek erken yetişkinlik büyümek için izin ver. Bu kültür yöntemleri, oluşturulan prosedürlere (Stiernagle 2006) dayanmaktadır. 5 </li><li> Video analiz gününde, dolayısıyla senkronize kültürü 50-150 solucanlar toplama, deiyonize, distile su 1 ml genç yetişkin nematod bir tabak yıkayın. M9 veya PBS gibi bir tampon çözelti de kullanılabilir. W spin için bir mikrosantrifüj kullanıntüpün alt ya da bunların, yaklaşık 15 dakika için yerçekimi ile yerleşmek için izin vermek için ORMS. Tüpten suyun çoğunluğu çıkarın ve nematodların dan herhangi yapışan bakterilerin yıkamak için deiyonize su, damıtılmış su, 1 ml ile değiştirin. </li><li> Bir mikropipet kullanarak kuvars küvetine su veya tampon nematodlar aktarın. Bir seferde bir nematod lazer ile aydınlatılmış olması muhtemeldir ki böylece bir kez ya da daha az, toplam 5-10 nematodlar hakkında küçük bir sayı ile çalışmak önemlidir. Kültür plakalar üzerinde nematod sayısı çok büyükse, istenilen yoğunluğa ulaşana kadar su veya tampon solucanlar seyreltin. Bu yıkayın ve küvet bireysel solucanlar aktarmak için taze bir agar plaka üzerine su veya tampon bir damla bireysel nematod almak da mümkündür. Bizim çalışmamızda, davranış yüzme fiziksel kısıtlamaların etkilerini incelemek için 1 mm, 2 mm ve 5 mm küvet boyutları kullanılabilir. </li></ol> 2. Video analysi için Optik Kurulumus <ol><li> Yetenekli bir 543 nm (yeşil) Helyum-Neon (HeNe) lazer, iki ön yüzeyi alüminyum aynalar, bir küvet tutucusu, bir projeksiyon ekranı ve yüksek hızlı kamera (Casio High Speed ​​Exilim) kullanarak Şekil 1&#39;de gösterildiği kurulumu gerçekleştirin ~ 240 fps filme. Iki ayna vasıtasıyla küvet lazer ışını yönlendirmek için kullanılır. Küvetlerin farklı boyutlarda çalışma doğasına bağlı olarak kullanılabilir. Bir örnek olarak, biz yüzme frekanslarda mekansal kısıtlar etkilerini göstermek için 5 mm kalınlığında olan küvetler kullanılmıştır. Lazer ışını örnekleme için şartları yerine getirmelidir;. Yani organizmanın lazer ışını fazla bir üçüncü engel olmalıdır. C. için Bir nematod ile etkileşime geçtiğinde elegans, lazer ışınının çapı yaklaşık 2 mm olmalıdır. Kırınım deseni bulmak zor olacağından lazer ışını çapı 5 mm&#39;den büyük olmamalıdır. Ekrana difraksiyon organizmadan mesafe çok daha büyük olmalıdırorganizmanın kendisi. </li><li> Yeri küvetin üst üzerinde parafilm ve su kanallarının içine nematod karıştırmak için onu çevirin. Solucanlar küvet üst kısmında başlangıçta böylece bir küvet tutucu küvet yerleştirin. Aynalar kullanarak, küvetin merkezi aracılığıyla lazer ışını yönlendirmek. Nematodlar su daha yoğun olduğu için aynı zamanda su sütunu içinde yüzerken, yavaş yavaş, küvet altına düşecek. </li><li> Iletilen ışın projeksiyon ekranı (Şekil 2) uygun olarak projeksiyon ekranı, renk üzerine siyah iletilen lazer ışını karşılık noktaya saçılma azaltmak için. Alternatif olarak iletilen ışın ekranı geçmesine izin vermek için projeksiyon ekranına bir açılış koydu. Giderilmesi veya iletilen ışını saçılması azaltarak iletilen ışın nedeniyle ıslatmasını kameranın CCD dizisi tutacak. </li><li> Sapma örüntüsünün boyut ölçümü yakalamak için, bir çizgi çizmekkırınan ışık görüntü engel olmadan iletilen lazer ışını nokta yanındaki projeksiyon ekranında yaklaşık 5 cm. </li><li> Oda ışığı yüzden 5 cm lik çizgi difraksiyon görüntülerle aynı görüntüleri üzerinde olduğunu ise kamera ile kayda başlayın. Oda ışığı kapatın. Kamera ile ekranda Record kırınım görüntüleri solucanlar lazer ışını geçerken. </li></ol> 3. Video Verileri Hazırlama <ol><li> : Video analiz programı (Logger Pro Install <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> bilgisayarda). Video analiz programı içine video alma </li><li> Iletilen lazer nokta denk kökenli ayarlayın. Projeksiyon ekranında 5 cm satırını kullanarak ölçeği ayarlayın. </li><li> Görüntü analiz yazılımı kullanılarak her bir nematod ile oluşan kırılma görüntüsü açısal yer değişimi (Şekil 3) Takip </li><li> Angula bulmak içinBir elektronik tablo (Excel) arctan (x / y), kopyalama ve yapıştırma verileri alarak ve sürekli bir grafiği (Figure. 4) üretmek için tüm negatif açılar için 180 derece veya π ekleyin tarafından r deplasman. </li></ol> 4. Yüzme Frekanslar Anında Gözlem için Gerçek Zamanlı Veri Toplama <ol><li> Video analizi için olduğu gibi, aynı ayar kullanarak, doğru projeksiyon ekranı önünde sapma örüntüsünde, merkez dışı bir küçük bir alana (~ 1 mm 2) ile bir foto diyot (ThorLabs itibaren DET10A) yerleştirin. </li><li> USB portundan bilgisayara bağlanan dijital osiloskop (Pico Technology tarafından yapılan PicoScope) için fotodiyot bağlayın. Bilgisayar ekranında thrashing şablonlarını inceleyin. </li><li> ASCII veya metin biçiminde alınan veri setleri kaydedin. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Verilerin analizinde ki-kare minimizasyonu kullanarak uydurma dalga yeteneğine sahip bir veri analizi programı içine video veya fotodiyot kullanılarak elde alma. Burada kullanılan program (Kökeni <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Dayak frekans (Şekil 4 ve 5) belirlemek için bir sinüsoidal eğri yerleştirin. </li><li> Ortalama yüzme çeşitli örneklerinden frekansları ve uyuşmazlığını belirler. Bu çalışma için, verilerin istatistiksel Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile takip tek faktörlü ANOVA kullanılarak analiz edildi. &lt;0.05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. </li></ol> 6. Örneği Mathematica kullanarak model Kırınım Desenleri Not: Kırınım desenleri birçok farklı hesaplama araçlarını kullanarak modellenebilir. Bu yordam, Matlab, Excel gibi farklı hesaplama araçları, Menşe vs için farklı olacaktır <ol><li> Görüntü Oluşturma: geleneksel mikroskop kullanarak bir mikroskop lamı üzerine nematod fotoğraf çekebilirsiniz. </li><li> Görüntü Binarize: İthalat solucan görüntüyü &#39;Worm&#39; iMathematica içine görüntüsünü sürükleyerek nto Mathematica. Siyah beyaz bir görüntü (binarize) içine görüntü dönüştürün. Bu Mathematica &#39;Binarize&#39; komutu ile elde edilebilir: BlackandWhiteImage = Binarize [Sonsuz]. Görüntü sonra bir siyah beyaz resim olarak görülebilir. EdgeDetect [Solucan, 6.0,0.035], iki takip eden sayı edilen kenarların hoyratlık kontrol: Alternatif olarak, bir BlackandWhiteImage oluşturmak için &#39;EdgeDetect &quot;komutunu kullanarak. </li><li> Sıfır ve birlerin bir matris içine resim dönüştürme: Bu Mathematica &#39;ImageData&#39; komutu ile elde edilebilir: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Fourier matrisi: Belirtilen FourierParameters kullanarak matris dönüşümü Fourier Mathematica &#39;Fourier&#39; komutunu kullanın: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Matrisinin Meydanı modülü kırınım matris elde edilir ve görüntü kontrastı artırmak için: mutlak Meydanımatris değeri ve orijinal görüntü karşılık gelen kırınım modelidir çıkan görüntü görüntüleyebilir. Ayrıca, görüntünün kontrastını ölçeklendirmenize &#39;Log&#39; işlevini kullanın: ImageContrast = Resim [Günlükler [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Kolay görüntüleme için görüntüyü yeniden boyutlandırma: Mahsul merkezi kırınım deseni ve istenilen şekilde yeniden boyutlandırmak: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Serbestçe yüzme solucanlar alınan kırınım desenleri ile modellenen kırınım desenleri karşılaştırın. (Şekil 6) </li></ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz gerçek zamanlı hareket ölçme ve mikroskopların kullanımı gerektirmez nematod gibi mikroskobik organizmaların basit lokomotor davranışlar için yeni bir yaklaşım geliştirdik. 8 Bu metodolojik yaklaşım da tek hücreliler gibi çok sayıda mikroskobik organizmaların incelemek için yararlanılabilir. Bu yöntem, yalnızca kullanılan ışık dalga boyu ile sınırlıdır. Organizma ışığın dalga boyundan daha küçük olmaması gerekir. Ihtiyaç duyulan donanım ve maliyet tasarrufu ve taşınabilirlik ek olarak, bu yaklaşım, bir önemli avantajı, bir mikroskop altında görüntü düzlemlerinin dar kısıtlama olmaksızın, gerçek zamanlı olarak ve üç boyutlu olarak davranış ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik mikroskop bazlı yaklaşımlar kullanılarak çalışılabilir bir davranış üzerinde yerçekimi kuvvetleri veya çok sayıda diğer koşulların etkilerini incelemek ile de mümkündür. 9 Böylece, mikroorganizmanın doğal lokomotor davranış bozuklukla daha iyi anlaşılmasını sağlamak içinmikroskop lamı damlacıkları veya özel mikroakışkan odaları (Park ve ark, 2008) sınırlarından kurtulmuş viors. 10. Kırınım deseninin faz bilgi eksikliği uzak-alan kırınım deseni Fourier dönüşümünün mutlak değer karesi ile orantılı olduğundan Kırınımlı nesneye karşılık görüntünün doğrudan alımı için izin vermez. Onlar serbestçe yüzme nematod (Şekil 6) kırınım desenleri ile uyumlu olabilir, böylece Biz bu nedenle solucan görüntüleri kırınım desenleri hesaplıyoruz. Bu yöntem gerçekten özgürce C. yüzme için sonuçlar vermiştir elegans ve hiçbir mikroskobik tür uygulanabilir ki su ya da birçok farklı iyonik çözeltiler gibi bir optik olarak transparan bir ortam içinde manevralar. Konvansiyonel mikroskoplar mikrometre sipariş üzerine bir odak derinliğinde çalışmalara izin verir. 11. Bu Sınırlı nedeniyleışık odaklama alan derinliği: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> Bu kırınım yöntemi kesinlikle geleneksel mikroskopi için bir yedek değil iken N kısa bir odak uzaklığı bir büyük c ile ilişkili olduğunu böylece karışıklık (c) daire karşılıklı bir ilişki vardır f-sayısı. 12,13, bunun mümkün olduğu hızlı bir şekilde türlerin bile düşük maliyetli gerçek zamanlı olarak manipüle edilebilir kantitatif sonuçlar sunmak için. Kırınım desenleri herhangi bir lazer pointer ile elde edilebilir. Kırınım desenleri normal bir dijital kamera kullanarak azaltılmış bir zamansal çözünürlükte filme olabilir. Kullanıcının kolayca kullanılabilir bir mikroskop veya fotodiyot sahip olmasa da, böyle bir dayak frekansları ölçme ve kırınım desenleri değerlendirerek bu denemenin önemli parçaları son derece düşük maliyetle tamamlanabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 543 nm HeNe Lazer </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> En az 5 mW&#39;a ile görülebilir aralığındaki herhangi bir lazer kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 2 Ön Yüzey Alüminyum Aynalar </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim Kamera </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kuvars Cuvette </td><td> Starna Hücreler </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Yazılım) </td><td> Verniyer </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Volfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

serbestçe mikro-organizmalar yüzme kantitatif locomotion eğitim lazer kırınım kullanma

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Toprak ve su mikroskobik organizmalar yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Mikroskobik organizmanın davranışının çalışmaların çoğu, aksine, biz gerçek zamanlı analiz sağlar yeni bir analitik yaklaşım sunmak dar, yaklaşık iki boyutlu odak alanına hareket ve davranış sınırı mikroskop-temelli yaklaşımlar. 1 kullanılarak yapılmıştır serbestçe C. yüzme mikroskop tabanlı donanım bağımlı olmadan bir küvet içinde elegans. Bu yaklaşım, küvet aracılığıyla lazer ışık yönlendirilmesi ile oluşturulan kırınım desenleri geçici periyodiklik izleme oluşur. Biz serbestçe yüzme nematodlar için salınım frekansları ölçer. Uzak-alan kırınım desenleri Analiz nematodların dalga hakkında ipuçları ortaya koymaktadır. Difraksiyon bir nesnenin etrafında bükme ışık işlemidir. Bu durumda ışık organizmalar tarafından kırıldıkları olduğunu. Işık dalgaları müdahale ve reklam oluşturabiliriffraction desen. Ekran-nesne mesafe Kırınımlı nesnenin daha büyük ise, bir uzak-alan veya Fraunhofer, kırınım deseni oluşur. Bu durumda, sapma örüntüsü, bir Fourier transform kullanılarak (örnek alınarak) hesaplanabilir. 2 C. elegans üç boyutta gezinmek serbest yaşayan Toprakta yaşayan nematodlar vardır. Onlar tarama denilen bir sinüzoidal lokomotor desen ve yüzme denen farklı bir desen sıvı toprak veya agar gibi bir katı matris üzerinde her iki hareket. 3 rolleri mechanosensory, kimyasal duyusal ve lokomotor plastik değişiklikler yöneten thermosensory hücreleri tarafından sağlanan duyusal bilgi oynadığı desen desen ve anahtarlar sadece aydınlatılamamış başlıyor. Biz bir mikroskop gerektirmez ve bize farklı işbirliği altında nematodu lokomosyon karmaşıklığı keşfetmek için başlamanızı sağlayacak üç boyutlu nematod lokomosyon ölçmeye yarayan bir optik yaklaşımı açıklamak 4şulları.

<html> Bir örnek olarak, C incelenmiştir geniş bir kuvars küvetine 1 cm, 5 mm kalınlığında ve 4 cm boyunda küvet içinde elegans. Video analizi kullanarak tek bir solucan Örnekleme, 5 mm kalınlığında küvet içinde video analizi elde edilen ortalama yüzme sıklığı yaklaşık 2.5 Hz (Şekil 4). Benzer şekilde, gerçek zamanlı veri toplama yöntemi kullanılarak tek bir solucan örnekleme, biz yaklaşık 2,7 Hz (Şekil 5) bir yüzme frekansı elde dijital osiloskop (PicoScope) kullanarak. Bu prosedür birçok solucanlar için tekrar edilebilir. Serbestçe yüzme solucan detaylı bir çalışma, 5 mm küvet içinde 2.37 Hz ortalama yüzme sıklığı saptandı. 6 Beklendiği gibi, yüzme frekansı bir tarama solucan (~ .8 Hz) daha yüksektir. 3, bu kırınım yöntemi kullanarak Bir C. ortalama yüzme frekansları bir mikroskop slaydı ile sınırlı elegans, 2 Hz önceden yayınlanmış değeri ile eşleştirmek için tespit edilmiştir. 1.7 ve_content &quot;&gt; Aşağıdaki prosedürler. 3) ve daha sonra 6). geleneksel bir mikroskop ile elde edilen solucan görüntü yardımıyla kırınım desenleri yüzme modellenmesi için olanak sağlar. modellenen kırınım desenleri C. elegans yüzerek döngüsü (simüle etmek için kullanılırlar Şekil 6). başarılı bir model yüzme frekansları uygun fiziksel olarak uygulanabilir ardışık yüzme desen meydana gelir. bir yüzme döngüsünün başlangıcında olduğu gibi solucan yüzebilir döngüsünün sonunda aynı şeklinde olmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Şekil 1. Yeşil HeNe lazer canlı C. kullanarak dinamik bir kırınım deseni oluşturmak için kullanılan elegans. Bu kırınım deseni 240 fps&#39;de çekildi. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Şekil 2. Dra<html> kanat siyah bir nokta iletilen ışının emilimini artırır. Dağınık ışık nedeniyle kameranın Doygunluk azaltılmış ve kırınım deseni görünür hale gelir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Şekil 3. Izlenmekte olan bir solucan kırınım deseni ile video analiz yazılımı ekran görüntüsü (Logger Pro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Şekil 4. 5 mm küvet bir nematod yüzmek döngüsü karşılık gelen video veri. Eğri fit ~ 2.5 Hz&#39;lik bir yüzme frekansını gösterir. &quot;/&gt; Şekil 5. 5 mm küvet bir nematod yüzmek döngüsü karşılık gelen gerçek zamanlı veri. Eğri fit ~ 2.7 Hz&#39;lik bir yüzme frekansını gösterir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Şekil 6. Üst satırı gerçek kırınım desenleri temsil ve alt satırında modellenen kırınım desenleri ile eşleştirilir. Modellenen kırınım desenleri bir mikroskop lamı (orta sıra) üzerinde solucanlar kullanılarak üretilmiştir.

Serbest yüzme nematod gibi mikroskobik organizmalar<em&gt; C. elegans</em&gt;, Yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Biz analiz sağlar yeni bir yaklaşımı üzerine rapor<em&gt; C. elegans</em&gt; Kırınım desenleri kullanılarak. Bu yaklaşım, bir küvet ile lazer ışığı yönlendirerek oluşturulan kırınım desenleri zamansal dönemsellik izleme oluşur.

Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma

Toprak ve su ortamındaki mikroskobik organizmalar, karmaşık üç boyutlu bir ortamda yaşar ve hareket ederler. Mikroskobik organizma davranışlarına yönelik çalışmaların çoğu, ...

Bu prosedürün genel amacı, serbestçe yüzen mikroskobik organizmaların çırpınma frekanslarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle mikroskobik solucanlardan oluşan bir örnek hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, optik düzenek hazırlanır.Ardından, canlı organizmalar tarafından oluşturulan difraksiyon deseni kaydedilir. Son olarak, yüzme frekanslarını belirlemek için kaydedilen veriler analiz edilir. Nihayetinde, kısıtlanmamış solucanların lokomosyon modellerindeki değişiklikleri göstermek için difraksiyon analizi kullanılır.Bu tekniğin geleneksel mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, türün üç boyutlu bir alanda serbestçe hareket ederken yüzme modellerinin gözlemlenebilmesidir. Bu yöntem, serbestçe yüzen C. elegans hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, farklı koşullara maruz bırakılan diğer şeffaf, küçük ve mikroskobik organizmalar için de uygulanabilir. Video analizi için C. elegans kurulumu yapmak üzere, 10 ila 20 adet yetişkin nematodu taze NGM ortamına taşımak için düzleştirilmiş bir platin tel piket kullanmaya başlayın.E. coli'nin küçük dairesel lekeler şeklinde bulunduğu agar dolgulu Petri plakları. Nematodların üç ila beş saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin ve ardından yetişkinleri uzaklaştırın. Böylece, 50 ila 150 nematoddan oluşan gelişimsel olarak senkronize küçük bir kültür oluşturun; nematodları erken yetişkinlik evresine kadar büyütmek için Petri kaplarını 20 °C'de dört ila beş gün inkübe edin.Video analizinin yapılacağı gün, senkronize kültürden 50 ila 150 adet solkanla toplamak için genç yetişkin nematodların bulunduğu bir plakayı bir mililitre deiyonize distile su ile yıkayın. Solkanları tüpün dibine çöktürmek için bir mikro santrifüj kullanın veya yaklaşık 15 dakika boyunca yerçekimi ile çökmelerini bekleyin. Tüpteki suyun büyük kısmını uzaklaştırın ve nematodlara yapışmış olan bakterileri temizlemek için yerine bir mililitre deiyonize distile su ekleyin.Bir mikropipet kullanarak beş ila 10 nematodu su içinde bir kuvars vete içerisine aktarın. Optik düzeneği burada gösterildiği gibi; aşırı örnekleme için 543 nanometre helyum neon lazer, lazer ışınını vete üzerinden yönlendirmek için kullanılan iki ön yüzey alüminyum ayna, bir vete tutucu, bir projeksiyon ekranı ve saniyede yaklaşık 240 kare hızında kayıt yapabilen yüksek hızlı bir kamera kullanarak kurun. Ardından, vete'nin üst kısmını kapatmak için bir parça parafilm kullanın ve nematodları su sütununda karıştırmak için vete'yi ters çevirin.Solucanların başlangıçta vete'nin üst kısmına yakın olması için vete'yi bir vete tutucuya yerleştirin. Aynaları kullanarak lazer ışınını vete'nin merkezinden geçirin. Nematodlar sudan daha yoğun oldukları için, projeksiyon ekranındaki su sütunu içinde yüzerken yavaşça vete'nin tabanına çökeceklerdir; iletilen lazer ışınına karşılık gelen noktayı, iletilen ışın projeksiyon ekranıyla buluştuğunda saçılmayı azaltmak için siyaha boyayın.İletilen ışından kaynaklanan saçılmanın ortadan kaldırılması veya azaltılması, kameranın CCD dizisinin iletilen ışın nedeniyle doygunluğa ulaşmasını önleyecektir. Kırınım deseninin boyutunu ölçebilmek için, kırılan ışık görüntüsüne müdahale etmeyecek şekilde, projeksiyon ekranı üzerinde iletilen lazer ışını noktasının yanına yaklaşık beş santimetrelik bir çizgi çizin. Oda ışığını kapatın ve solucanlar lazer ışınının içinden geçerken ekrandaki kırınım görüntülerini kaydedin.Video verilerini hazırlamak için aşağıdaki video analiz programını kurun ve videoyu programa aktarın. Yazılımı kullanarak başlangıç noktasını, iletilen lazer noktasıyla çakışacak şekilde ayarlayın. Her bir nematode tarafından oluşturulan difraksiyon görüntüsünün açısal yer değiştirmesini takip edin.Verileri bir elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın ve sürekli bir grafik elde etmek için tüm negatif açılara 180 derece veya PI ekleyin. Video analiz düzeneğini kullanarak, projeksiyon ekranının hemen önüne USB portu aracılığıyla, difraksiyon deseninin merkez dışında kalan küçük bir alanına bir fotodiyot yerleştirin.Fotodiyodu, bilgisayara bağlı olan dijital osiloskoba bağlayın. Bilgisayar ekranındaki çırpınma modellerini gözlemleyin. Verileri analiz etmek için veri setlerini ASCI veya metin formatında kaydedin.Dalga formlarını sığdırabilen bir veri analiz programına verileri aktarmak için videoyu veya fotoğrafı kullanın. Ki-kare minimizasyonu kullanarak, çırpınma frekansını belirlemek için sinüzoidal bir eğri sığdırın. Çeşitli örneklerden elde edilen yüzme frekanslarının ortalamasını alın ve varyansı belirleyin.Bu çalışma için veriler, tek faktörlü ANOVA ve ardından Bonferroni çoklu karşılaştırma testi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Kırınım desenlerini modellemek için 0,05'ten küçük P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Bir görüntü elde etmek için mikroskop kullanarak görüntüleri çekerek başlayın.Bunu Mathematica'ya sürükleyin. Siyah beyazla dönüştürmek için binary eyes komutunu kullanın. Alternatif olarak, sondaki iki sayının ortaya çıkan kenarların kaba düzeyini kontrol ettiği siyah beyaz bir görüntü oluşturmak için edge detect komutunu kullanın.Ardından, image data komutunu kullanarak görüntüyü sıfırlardan ve birlerden oluşan bir matrise dönüştürün. Matrisi dönüştürmek için forer komutunu kullanın, ardından matrisin mutlak değerinin karesini alın ve orijinal görüntüye karşılık gelen kırınım deseni olan sonuç görüntüsünü inceleyin. Ayrıca, görüntünün kontrastını ölçeklendirmek için log fonksiyonunu kullanın.Son olarak, model kırınım desenlerini, serbestçe yüzen solucanlardan elde edilen kırınım desenleriyle karşılaştırın. Bu örnekte, bir santimetre genişliğinde, beş milimetre kalınlığında ve dört santimetre yüksekliğinde bir kuvars Q kabında sea elegance incelenmiştir. Video analizi kullanılarak tek bir solucanın örneklenmesi.Beş milimetre kalınlığında bir vet üzerinden yapılan video analizinden elde edilen ortalama yüzme frekansı yaklaşık 2,5 hertz idi. Benzer şekilde, gerçek zamanlı veri toplama yöntemi ve dijital bir osiloskop kullanılarak tek bir solucandan örnekleme yapıldığında, yaklaşık 2,7 hertz'lik bir yüzme frekansı elde edilmiştir. Bu prosedür birçok solucan için tekrarlanabilir.Serbestçe yüzen solucanlar üzerinde yapılan ayrıntılı bir çalışma, beş milimetrelik bir vete içinde ortalama 2,37 hertz'lik bir yüzme frekansı ortaya çıkarmıştır. Beklendiği üzere, yüzme frekansı sürünerek ilerleyen bir solucanınkinden daha yüksektir. Bu difraksiyon yöntemi kullanılarak, bir mikroskop lamıyla sınırlandırılmış bir sea elegance'in ortalama yüzme frekanslarının, daha önce yayınlanmış olan iki hertz değeriyle eşleştiği saptanmıştır.Videoyu takiben. Bu videoda gösterilen kırınım desenlerinin veri hazırlığı ve modellemesi, yüzme kırınım desenlerinin modellenmesine olanak tanır. Geleneksel bir mikroskopla elde edilen solucan görüntüleri yardımıyla, modellenmiş kırınım desenleri sea elegance'in bir yüzme döngüsünü simüle etmek için kullanılır.Başarılı bir model, yüzme frekanslarıyla eşleşen, fiziksel olarak uygulanabilir yüzme paternlerinin başarısından oluşur. Solucan, yüzme döngüsünün sonunda, döngünün başlangıcındakiyle aynı şekilde olmalıdır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, bilgisayar ekranında yüzme döngüleri gözlemlenirken hızlı fotoğraf diyeti kullanılarak her solucan için bir dakikadan kısa sürede tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, serbestçe yüzen nematodların nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kayma akışı içinde derme çatma bir besin bir deniz manzarası ve yüzme davranışı içinde bakteri deniz mikropların kemotaktik toplayıcı davranış eğitimi için mikroakışkan kanalları ve deneylerde bunların uygulanmasını imalat açıklanmıştır.

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

Kaynak: Scheidweiler, D. ve diğerleri. Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilerek Gözenekli Ortamlarda Mikrobiyal Taşınımı Mekansal Ölçeklerde İncelemek. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, rastgele düzenlenmiş sütunlardan oluşan gözenekli bir matriks aracılığıyla bakteri hareketliliğini ölçmek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Fluoresan etiketli bakteriler cihaza dahil edilir, gözenekli matriksin içinden gözlem kanalına ilerlerken mikroskopi ile...

Mikrofluidik Cihaz Kullanarak Bakteriyel Hareketliliğin Değerlendirilmesi

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan...

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Burada sunulan tekniği özgürce tek dalga boyu maruz kullanılarak mikroskobik türler yüzme yolunu ölçer. C. elegans pahalı mikroskoplar için ucuz bir alternatif olarak gölge görüntüleme göstermek için kullanılır. Bu teknik yönü, hız, ivme ve güçlerini ölçmek için çeşitli yönelimleri, ortamları ve türler karşılamak için adapte edilebilir.

Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion dahil Kuvvetleri Tahminleri

Sıvılarda "yüzebilen" ve 3B yörüngelerini belirleyebilen katalitik olarak aktif Janus kolloidlerini hazırlamak için bir yöntem sunulmaktadır.

Katalitik Yüzme Cihazların Hazırlanması ve 3D İzleme

Bu makale farklı nematodlar uzakta-tarla kırınım imza kullanma ayırmak nasıl açıklar. Biz hareket 139 vahşi türü ve 108 "Roller" C. elegans frekansları sürekli dalga bir lazer kullanarak tek bir yerde geçici Fraunhofer bükülmesi imzayla ilişkili sayı ortalaması alınarak karşılaştırın.

Kırınım Analizi hayatın Caenorhabditis elegans Fourier tabanlı

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

Burada, aynı anda çoklu konsantrasyon tepkileri elde ederken bakteriyel kaynama hareketliliğini değerlendirmek için indükleyici gradyan plakalarının kullanımını açıklıyoruz.

İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Bu prosedür, Acanthamoeba spp.'  nin nasıl görselleştirileceğini, izleneceğini ve ölçüleceğini açıklar.Motilite.

Acanthamoeba spp.'nin miktar tayini Motilite

Bu çalışma, en büyük Lyapunov üssünü (LLE) ölçerek C. elegans'ta yaşın hareket üzerindeki etkisini incelemektedir. Yaşlandıkça, C. elegans motor kontrolünde bir artış ve ardından düşüş gösterir. Sonuçlar, beş günde LLE'nin zirve yaptığını ve ardından solucanlar yaşlandıkça bir düşüş olduğunu gösteriyor.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşa Bağlı Hareket Dinamiği: Bir Lyapunov Üs Analizi

Öğrenin, C. elegans'ın yüzme davranışını lazer kırınım desenleriyle analiz etmeyi. Bu yöntem, mikroskobik organizmaların üç boyutlu ortamdaki lokomosyonunu gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma

Daha fazla video keşfet