Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma
25 Ekim 2012
Serbest yüzme nematod gibi mikroskobik organizmalar C. elegans, Yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Biz analiz sağlar yeni bir yaklaşımı üzerine rapor C. elegans Kırınım desenleri kullanılarak. Bu yaklaşım, bir küvet ile lazer ışığı yönlendirerek oluşturulan kırınım desenleri zamansal dönemsellik izleme oluşur.
Bu prosedürün genel amacı, serbestçe yüzen mikroskobik organizmaların çarpma frekanslarını ölçmektir. Bu, önce bir mikroskobik solucan örneği hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra optik kurulum hazırlanır.
Daha sonra canlı organizmalar tarafından tanıtılan kırınım modeli kaydedilir. Son olarak, kaydedilen veriler yüzme frekanslarını belirlemek için analiz edilir. Sonuç olarak, kırınım analizi, kısıtlanmamış solucanların hareket modellerindeki değişiklikleri göstermek için kullanılır.
Bu tekniğin geleneksel mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, türler üç boyutlu bir uzayda serbestçe hareket ederken yüzme desenlerinin gözlemlenebilmesidir. Bu yöntem, serbestçe yüzen deniz zarafeti hakkında fikir verebilse de, değişen koşullara maruz kalan diğer şeffaf, küçük ve mikroskobik organizmalara da uygulanabilir. Video analizi için C elegance'ı ayarlamak için, 10 ila 20 GR yetişkin nematodları taze NGM'ye taşımak için düzleştirilmiş bir platin tel kazma kullanarak başlayın.
Agar, küçük dairesel e coli lekeleri içeren Petri plakalarını doldurur. Nematodların üç ila beş saat yumurta bırakmasına izin verin ve ardından yetişkinleri çıkarın. Böylece, nematodları erken yetişkinliğe kadar büyütmek için 50 ila 150 nematoddan oluşan küçük, gelişimsel olarak senkronize bir kültür oluşturarak, Petri kaplarını dört ila beş gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.
Video analizinin yapıldığı gün, bir tabak genç yetişkin nematodunu yıkamak için bir mililitre deiyonize damıtılmış su kullanın, böylece senkronize kültürden 50 ila 150 solucan toplayın. Solucanları tüpün dibine döndürmek için bir mikro santrifüj kullanın veya yaklaşık 15 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin. Suyun çoğunu tüpten çıkarır ve nematodlardan yapışan bakterileri yıkamak için bir mililitre deiyonize damıtılmış su ile değiştirir.
Bir mikro pipet kullanarak, sudaki beş ila 10 nematodları bir kuvars tavaya aktarın. Lazer ışınını damardan geçirmek için kullanılan iki ön yüzey alüminyum aynası, bir vete tutucusu, bir projeksiyon perdesi ve saniyede yaklaşık 240 kare çekim yapabilen yüksek hızlı bir kamera ile yüksek hızda örnekleme için 543 nanometre helyum neon lazer kullanarak optik kurulumu burada gösterildiği gibi birleştirin. Ardından, vete'nin üstünü kaplamak için bir parça paraform kullanın ve nematodları su sütununa karıştırmak için ters çevirin.
Vete'yi bir vete tutucusuna yerleştirin, böylece solucanlar başlangıçta vete'nin tepesine yakın olur. Aynaları kullanarak lazer ışınını vete'nin merkezinden geçirin. Nematodlar sudan daha yoğun olduğu için, projeksiyon ekranındaki su sütunu içinde yüzerken yavaşça damarın dibine düşerler, iletilen ışın projeksiyon ekranıyla buluştuğunda saçılmayı azaltmak için iletilen lazer ışınına karşılık gelen noktayı siyaha boyarlar.
İletilen ışından saçılmayı ortadan kaldırmak veya azaltmak, kameranın CCD dizisinin iletilen ışın nedeniyle doygunluğunu önleyecektir. Kırınım deseninin boyutunun bir ölçüsünü yakalamak için, kırınımlı ışık görüntüsüne müdahale etmeden iletilen lazer ışını noktasının yanındaki projeksiyon ekranına yaklaşık beş santimetrelik bir çizgi çizin. Oda ışığını kapatın ve solucanlar lazer ışınından geçerken ekranda kırınım görüntüleri kaydedin.
Video verilerini hazırlamak için aşağıdaki video analiz programını kurun ve videoyu programa aktarın. Yazılımı kullanarak orijini, iletilen lazer noktasıyla çakışacak şekilde ayarlayın. Her nematod tarafından oluşturulan kırınım görüntüsünün açısal yer değiştirmesini izleyin.
Verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın ve tüm negatif açılar için 180 derece veya PI ekleyin. Sürekli bir grafik oluşturmak için. Video analiz kurulumunu kullanarak, bir USB bağlantı noktası aracılığıyla doğrudan projeksiyon ekranının önüne, kırınım düzeninde merkezden uzakta küçük bir alanı olan bir fotoğraf diyotu yerleştirin.
Fotoğraf diyotunu bilgisayara bağlanan dijital osiloskopa bağlayın. Bilgisayar ekranındaki çarpma desenlerini gözlemleyin. Verileri analiz etmek için veri kümelerini ASCI veya metin biçiminde kaydedin.
Verileri dalga formlarına sığdırabilen bir veri analiz programına aktarmak için video veya fotoğraf kullanın. Chiqua minimizasyonunu kullanarak, harmanlama frekansını belirlemek için sinüzoidal bir eğriye uydurun. Çeşitli örneklerden elde edilen yüzme frekanslarının ortalamasını alın ve varyansı belirleyin.
Bu çalışma için veriler, tek faktörlü bir Inova ve ardından Bon Ferran kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. Çoklu karşılaştırma testi 0,05'ten küçük bir P değeri, kırınım modellerini modellemek için istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir. Bir görüntüyü görselleştirmek için görüntü almak için mikroskop kullanarak başlayın.
Mathematica'nın içine sürükleyin. Siyah beyaza dönüştürmek için ikili gözler komutunu kullanın. Alternatif olarak, sondaki iki sayının elde edilen kenarların kabalığını kontrol ettiği siyah beyaz bir görüntü oluşturmak için kenar algılama komutunu kullanın.
Ardından, görüntü verileri komutunu kullanarak, görüntüyü sıfırlar ve birlerden oluşan bir matrise dönüştürün. Forer komutunu kullanarak forer komutunu kullanın, matrisi dönüştürün, ardından matrisin mutlak değerinin karesini alın ve orijinal görüntüye karşılık gelen kırınım deseni olan ortaya çıkan görüntüyü görüntüleyin. Ayrıca, görüntünün kontrastını ölçeklendirmek için günlük işlevini kullanın.
Son olarak, model kırınım desenlerini serbestçe yüzen solucanlardan elde edilen kırınım desenleriyle karşılaştırın. Bu örnekte, deniz zarafeti, bir santimetre genişliğinde, beş milimetre kalınlığında ve dört santimetre yüksekliğinde bir kuvars Q vet'te incelenmiştir. Video analizi kullanarak tek bir solucan örneklemesi.
Beş milimetre kalınlığındaki bir veterinerde video analizinden elde edilen ortalama yüzme sıklığı yaklaşık 2,5 hertz idi. Benzer şekilde, gerçek zamanlı veri toplama yöntemi ve dijital osiloskop kullanılarak tek bir solucanın örneklenmesi, yaklaşık 2,7 hertz'lik bir yüzme frekansı ile sonuçlandı. Bu prosedür birçok solucan için tekrarlanabilir.
Serbestçe yüzen solucanlar üzerinde yapılan detaylı bir çalışma, beş milimetrelik bir damarda ortalama 2.37 hertz'lik bir yüzme sıklığını ortaya çıkardı. Beklendiği gibi, yüzme sıklığı sürünen bir solucan için olandan daha yüksektir. Bu kırınım yöntemi kullanılarak, bir mikroskop lamı ile sınırlı olan bir deniz zarafetinin ortalama yüzme frekanslarının, daha önce yayınlanan iki hertz değeriyle eşleştiği bulunmuştur.
Videoyu takip ediyor. Bu videoda gösterilen kırınım modellerinin veri hazırlığı ve modellenmesi, yüzme kırınım modellerinin modellenmesine olanak tanır. Konvansiyonel bir mikroskopla elde edilen solucan görüntülerinin yardımıyla, modellenen kırınım desenleri, deniz zarafetinin yüzme döngüsünü simüle etmek için kullanılır.
Başarılı bir model, yüzme frekanslarına uygun, yüzme modellerinin fiziksel olarak uygulanabilir başarısından oluşur. Solucan, yüzme döngüsünün sonunda, yüzme döngüsünün başlangıcında olduğu gibi aynı şekilde olmalıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, bilgisayar ekranında yüzme döngülerini gözlemlerken hızlı fotoğraf diyetini kullanarak her solucan için bir dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, serbestçe yüzen nematodları nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu çalışma, difraksyon desenlerini kullanarak nematod C. elegans'ın yüzme davranışını analiz etmek için yeni bir yaklaşım sunar. Bu desenlerin zamansal periyodikliğini izleyerek, araştırmacılar bu mikroskobik organizmaların üç boyutlu bir ortamda hareketini daha iyi anlayabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Davranış Analizi
Arka Plan
- C. elegans, hareketliliği incelemek için bir model organizmadır.
- Geleneksel mikroskopi yöntemleri, üç boyutlu uzayda organizmaları gözlemlemeyi sınırlandırır.
- Difraksyon desenleri, hareket analizi için yeni bir yöntem sağlayabilir.
- Bu teknik, diğer şeffaf mikroskobik organizmalar için de uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Serbest yüzen C. elegans'ın çırpınma frekanslarını ölçmek.
- Difraksyon analizi kullanarak hareket desenlerini analiz etmek.
- Yüzme davranışı gözlemlemek için mevcut yöntemleri geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Senkronize edilmiş bir C. elegans kültürünün hazırlanması.
- Helyum neon lazer kullanarak bir optik sistemin kurulması.
- Nematodların bir lazer ışını içinden yüzerken difraksyon desenlerinin kaydedilmesi.
- Video analiz yazılımı ve istatistiksel yöntemler kullanılarak veri analizi.
Ana Sonuçlar
- C. elegans'ın ortalama yüzme frekansı yaklaşık olarak 2,37 Hz olarak ölçüldü.
- Yüzme davranışına kıyasla yüzme frekansında farklılıklar gözlendi.
- Teknik, üç boyutta hareketliliği gerçek zamanlı olarak gözlemlemenizi sağlar.
- İstatistiksel analiz, sonuçların önemini doğruladı.
Sonuçlar
- Bu difraksyon yöntemi, C. elegans'ın yüzme davranışını incelemek için değerli bir araç sağlar.
- Yaklaşım, diğer mikroskobik organizmalar için uyarlanabilir.
- Gelecek çalışmaları, çeşitli koşullardaki hareket desenlerinin etkilerini daha fazla genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
