Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, adherent hücrelerde bölgeye özgü transfeksiyon sağlamaktır. Bu, bir mikro elektrot dizisi üzerinde tek tabakalı hücre kültürü yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, seçili elektrotlara elektrik palsı uygulanması, elektrotların üzerinde yapışık olan hedef hücrelerin elektroporasyonuna yol açar.

Bu durum, hücre membranında eksojen moleküllerin hücre içine girişine izin veren porların oluşmasına yol açar. Ardından, hedef hücreler uygun bir analiz kullanılarak ortaya çıkan fenotipi tespit etmek amacıyla taranabilir. Burada tanımladığımız mikroölçekli transfeksiyon tekniği, toplu elektroporasyon veya kimyasal transfeksiyon gibi geleneksel transfeksiyon tekniklerine göre birkaç temel avantaja sahiptir.

A, transfeksiyon sürecinin kendisi üzerinde mükemmel bir uzamsal kontrol sağlamamıza olanak tanır ve transfeksiyona dirençli hücre hatlarında bile tekil hücrelerin veya hücre kümelerinin yüksek verimlilikle transfekte edilmesine yardımcı olur. B, kolayca ölçeklendirilebilen ve yüksek verimli moleküler analizler gerçekleştirmemize yardımcı olan bir yaklaşımdır. Bölgeye özgü transfeksiyon için bir mikro elektrot dizisi kullanmanın temel avantajlarından biri, kantitatif elektrofizyoloji ve morfolojik değişiklikler gibi hedeflenen hücrelerin eş zamanlı fonksiyonel değerlendirmesine imkan tanımasıdır.

Prosedüre başlamak için MEA'yı bir otoklavda sterilize edin, ardından otoklavlanmış MEA'yı laminer akışlı kabine aktarın ve hücreleri MEA üzerine ekmeden önce standart steril bir polistiren Petri kabına yerleştirin; laminer akışlı kabini UV ışığını 20 dakika boyunca açarak sterilize edin. Eğer MEA UV ışığına karşı hassassa, akışlı kabin UV aydınlatması altındayken MEA içeren Petri kabını steril alüminyum folyo ile örtün. Ardından, helo hücreleri için MEA yüzeyini 10 µg/mL fibronectin ile bir ila iki saat boyunca işleme tabi tutun.

DI su ile yıkama yapın ve MEA'nın laminar akışlı kabin içinde havada kurumasını bekleyin. Ardından, yapışkan memeli hücrelerinden oluşan aktif bir hücre hattından tripsin ETTA kullanarak hücreleri toplayın ve ekim için hücre besiyerinin bir mililitresinde konsantrasyonlarını mikrolitre başına 100 ila 200 hücreye yükseltin. Daha sonra, hücre içeren besiyerinden 20 ila 30 mikrolitrelik bir damlayı MEA üzerine yerleştirin.

MEA üzerindeki tüm elektrotları kapatacak kadar büyük olduğundan emin olun. Ardından, MEA içeren Petri kabını 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. İki ila dört saat bekletin.

Hücre ekimini yaptıktan sonra, MEA içeren Petri kabını inkübatörden laminer akışlı kabine aktarın. Ardından, MEA kuyucuğuna 37 °C'ye önceden ısıtılmış ortamdan 400 ila 500 µL dikkatlice ekleyin ve ardından hücrelerin hâlâ yapışık olduğunu ve MEA yüzeyine eşit şekilde dağıldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Sonrasında MEA'yı tekrar inkübatöre aktarın; hücre ekiminden 8 ila 12 saat sonra, ölü hücreleri uzaklaştırmak için PBS ile bir ila iki kez yıkama işlemi gerçekleştirin.

Tipik bir deneyde, hücreler genellikle ekimden 24 ila 48 saat sonra transfeksiyon için hazır hale gelir. Elektroporasyon verimliliklerinde tutarlılığı sağlamak için, elektroporasyondan önce kültürün konfluens düzeyine yaklaşana kadar beklenmesi önerilir. Yüksek verimli sRNA transfeksiyonu gerçekleştirmek için, öncelikle belirli bir MEA için optimal elektroporasyon voltaj darbe parametrelerinin belirlenmesi gerekir.

Burada, elektroporasyon öncesinde optimal elektroporasyon parametrelerini belirlemek için propidyum iyodür kullanımını içeren bir dizi deneysel adımı tanımlıyoruz. Buz gibi soğuk elektroporasyon tamponunda 30 micrograms per milliliter PI içeren 300 ila 500 microliter çözelti ve PBS içinde four micromolar kalsiyum AM çözeltisinden 400 microliters hazırlayın. Ardından MEA'yı inkübatörden laminar akışlı kabine transfer edin.

Hücre besiyerini MEA'dan uzaklaştırın ve PBS ile yıkama işlemi gerçekleştirin. Ardından, 300 ila 500 µL buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu ekleyin. Sonrasında, MEA'ya bir milimetre yüksekliğinde bir ara parçası yerleştirin.

MEA'nın merkezindeki hücrelere temas etmediğinden emin olmak son derece önemlidir. Ardından, MEA'yı elektrik ara bağlantısına bağlayın ve elektroporasyon için istenen elektrotları seçin. Sonrasında, elektroporasyon adımı için hedef elektrotlara istenen pals genliği ve süresindeki elektrik palslerini uygulayın.

Alüminyum folyo ile kaplanmış çelik katodu, bir milimetrelik ara parçaya temas edene kadar MEA kuyusuna indirin. Hemen ardından, hedeflenen elektrotlara elektrik darbeleri uygulayın. Sonrasında, deney tasarımına bağlı olarak bu adımı farklı bir elektrot setiyle tekrarlayın.

HEK293 hücreleri ile yaptığımız deneylerde, 3 V ile 9 V arasında genliğe ve 1 ms ile 10 ms arasında süreye sahip tek bir voltaj palsının, 100 µm boyutundaki bir elektrot ile minimum hücre ölümüyle başarılı elektroporasyon sağladığını gözlemledik. Voltaj palslarını uyguladıktan hemen sonra, MEA'yı beş dakika boyunca inkübatöre aktarın.

Beş ila 10 dakikalık bir inkübasyon süresinin ardından, ara parçayı MEA'dan nazikçe çıkarın. Daha sonra MEA kuyucuğundaki elektroporasyon tamponunun %75'ini boşaltın ve yerine ılık hücre besiyeri ekleyin. Ardından MEA'yı tekrar inkübatöre yerleştirin.

İki ila dört saatlik bir inkübasyon süresinin ardından, MEA kuyucuğundaki hücre besiyerini 300 ila 500 µL 4 µM PBS içinde kalsiyum AM çözeltisi ile değiştirin. Hücrelerin kalsiyum AM ile inkübasyonunu takiben, MEA'yı 30 dakika daha inkübatöre geri yerleştirin. Bir yıkama adımından sonra kuyucuktaki kalsiyum AM'yi PBS ile değiştirin, ardından pi filtrelerine sahip bir optik mikroskop kullanarak hücrelerin floresan görüntülerini elde edin.

Elektroporasyon nedeniyle PI alımı hücrelerin kırmızı floresan yaymasına, kalsiyum am ise canlı hücrelerin yeşil floresan yaymasına neden olur. Her bir elektrot için hücre canlılığı bu denklemle ve her bir elektrot için elektroporasyon verimliliği bu denklemle tahmin edilebilir. Optimal elektroporasyon parametreleri belirlendikten sonra, bunlar bir a molekülünün bölgeye özgü iletimi için kullanılabilir ve siRNA molekülleri için uygulanan elektroporasyon prosedürü, pi için uygulanan elektroporasyon prosedürü ile aynıdır.

Burada, 200 µm'lik bir elektrot üzerindeki HeLa hücrelerinde propidyum iyodürün bölgeye özgü iletimi gösterilmektedir. Kalsiyum tabanlı canlılık analizi, elektroporasyondan iki saat sonra gerçekleştirilmiştir. Canlı hücreler burada yeşil floresan ile belirtilmiş olup, buradaki kırmızı floresan ise elektrot üzerindeki hücreler tarafından PI alımını göstermektedir.

İşte üst üste bindirilmiş görüntü. Bu hücreler elektropore edilmiş ve canlıyken, bu hücreler ölüdür. Bu şekil, 200 µm çaplı bir elektrot üzerinde rumine etiketli irna transfeksiyonunu göstermekte olup, bu şekil ise 100 µm çaplı bir elektrot üzerinde hela hücrelerinin Alexa 4 88 etiketli irna ile transfeksiyonunu göstermektedir.

Beyaz oklar irna ile transfekte edilmiş hücreleri, siyah oklar ise ölü hücreleri göstermektedir. Burada gösterdiğimiz teknik, transfeksiyona dirençli primer hücre hatları da dahil olmak üzere farklı hücre hatlarına uygulanabilir ve bu hücrelerin plazmitler ve proteinler gibi daha büyük moleküllerle transfekte edilmesi için genişletilebilir.