Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Klasik olarak, presinaptik ve postsinaptik elementler arasındaki iletişim, presinaptik terminale ulaşan ve kalsiyum artışıyla postsinaptik reseptörleri aktive eden glutamat salınımını tetikleyen bir aksiyon potansiyelini içerir. Ancak, astrositlerin sinapslarla yakın temas kurduğu ve nörotransmitter reseptörleri eksprese ettiği gözlemi, bu bakış açısını üçlü sinaps kavramına dönüştürmüştür. Bu nedenle, süregelen glutamaterjik iletim astrositi de aktive edecek ve hücre içi kalsiyum artışını tetikleyecektir.

Ardından ekstrasinaptik veya sinaptik reseptörlere bağlanabilen gliyotransmitörlerin salınımı, presinaptik ve postsinaptik aktiviteleri modüle eder. Ayrıca astrositler, sinaptik olarak salınan glutamat için ana geri alım sistemini eksprese ederler. Bunlara ek olarak, potasyum kanalları aracılığıyla, aksiyon potansiyeli ateşlemesi ve ardından gelen postsinaptik aktivasyon sırasında salınan potasyumu pre ve postsinaptik terminallerden temizlerler.

Bu potasyum daha sonra, hücre dışı potasyum seviyelerinin daha düşük olduğu bölgelere hücre içi yolla taşınır ve burada salınır veya gap junction'lar (boşluk bağlantıları) aracılığıyla komşu astrositlere difüze olur. Böylece astrositler, hem nöroaktif maddelerin hücre dışı konsantrasyonunu kontrol ederek hem de net ileticiler salgılayarak sinaptik aktivitenin gücünü belirlemede önemli roller oynarlar. Laboratuvarım, serebral fizyopatolojide nöroglial etkileşimlerin rolünü araştırmaktadır.

Bu nedenle, anlık sinaptik iletimde astrositlerin rolünü aydınlatmak için bu tekniği kapsamlı bir şekilde kullandık ve mükemmelleştirdik. Gerçekten de bu teknik, nöronların dinamik elektrofizyolojik yanıtlarının çevrimiçi ve eş zamanlı olarak izlenmesine olanak tanıdığı için oldukça güçlüdür. Bugün Osteocytes Evap kliniğinde, laboratuvar üyeleri Ash ve Jeremy Siebel bu tekniğin nasıl uygulanacağını gösterecek ve nöronlar ile astrositler arasındaki yakın diyaloğu anlamamıza nasıl yardımcı olduğunu açıklayacaklar.

Nöron aktivitesi ile astroglial potasyum ve glutamat transportu oluşumunun çift kayıtlarını gerçekleştirerek, astroglide ağlarının nöronlar, sinaptik iletim ve plastisite üzerindeki etkisini araştırdım ve astroglial ağların, nöral aktivite sırasında potasyum ve glutamatın hücre dışından uzaklaştırılmasını kolaylaştırdığını saptadım. Astroglial oluşumun nörofizyoloji ile ilişkili doğasını, özelliklerini ve plastisitesini inceledim. Astroglia ve nöronal uyarılmış aktivite kayıtları sırasında, astrositlerin nöronal aktivasyona verdiği yanıtın çoğunlukla potasyum akımları aracılığıyla gerçekleştiğini tespit ettim.

Bu akımların, nöral duyarlılığı ve plastisiteyi düzenlemeyen kendilerine özgü elektrofizyolojik plastisite özellikleri vardır. Diğer bir ifadeyle, astrosit sayımı oldukça heyecan vericidir. Nöronlar. Burada, presinaptik fiber stimülasyonu ile uyarılan astrositik membran akımları ve nöral alan potansiyellerinin çift kayıtlarını gerçekleştirerek, akut hipokampal kesitlerde nöronal ve astroglial aktiviteyi eş zamanlı olarak incelemek için önemli bir yöntemi sunacağız.

Ayrıca, nöronal aktivite sırasında ASTO glikojen yanıtlarını incelemek için tekil nöronlar ve komşu astrositlerin eşli kayıtlarını gerçekleştireceğiz. Hipokampusu seçtik çünkü bu bölge güçlü bir anatomik ve fonksiyonel bölmelenme sergilemekte olup, nöronal devrelerin yanı sıra sinaptik aktivite ve plastisite açısından da iyi tanımlanmıştır. Deneylere, hipokampal beyin kesitlerini hazırlayarak başlayın; bunun için öncelikle buz gibi soğutulmuş oksijenli solüsyon hazırlayın.

Yapay serebrospinal sıvı, farelerinizi derin şekilde anestezi altına alın, başlarını hızla kesin ve A CSF içerisine aktarın. Kafatasını üç kesiyle açarak iki hemisferi birbirinden ayırın. Son olarak, onları oksijenle zenginleştirilmiş A CSF içerisine aktarın.

Yaklaşık beş dakika boyunca eşit şekilde bekletin. Şimdi bir hemisfer ile başlayın. Hipokampüs diseksiyonu, orta beynin çıkarılmasıyla başlar.

Ayrıntılı hipokampus diseksiyonu şu anda bu şekilde gösterilmektedir. İlk olarak, orta beyne erişmek için ayrılmış hemisferi kortikal bölgesine yerleştirin. İki adet kaşık yardımıyla orta beyni çıkarın.

Şimdi hipokampus, kesikli çizgilerle belirtildiği üzere görünür olacaktır. Geniş bir yapı olarak görünen fia'dan başlayarak hipokampusu bir kaşık yardımıyla diseke edin. Hipokampusun altına bir kaşık yerleştirin ve ikinci bir kaşığın yardımıyla, hipokampusa komşu olan korteksi kesin.

Hipokampüsü oksijenlendirilmiş A CSF içeren küçük bir kültür kabına aktarın ve ikinci hemisfer ile devam edin. Her iki hipokampüsü de alveol tarafı yukarı gelecek şekilde küçük bir AGA bloğu üzerine yerleştirin. Şimdi DS A CSF'yi vakumla çekin. Hipokampüsü dilimleme odası cihazınıza yapıştırın.

Hippocampusu dilimleme haznesine aktarın ve 300 veya 400 mikrometre kalınlığında dilimler kesin. Dilimleri oksijenlendirilmiş bir saklama haznesinde toplayın ve tekil astrositlerin bütüncül kayıtlarını gerçekleştirmek için kayıt öncesinde oda sıcaklığında en az bir saat dinlendirin. Hippocampus diliminizi Polylysine kaplı bir lamelle aktarın.

Hipokampus kesitinin poli kaplı lamel üzerine yapışmasını sağlamak için fazla A CSF'yi kurulayın ve ardından kesitin üzerine tekrar A CSF ekleyin. Kesiti, dakikada bir ila iki mililitre perfüzyon hızıyla sürekli olarak oksijenlendirilmiş A CSF ile perfüze edilen kayıt haznenize aktarın. Astrositleri tanımlamak için, astroglia spesifik GFAP promotörü altında EGFP eksprese eden fareler patch clamp kayıtları için kullanılabilir.

Dört ila altı mega ohm dirençteki bir cam pipeti, rhodamine içeren hücre içi solüsyon kullanarak filtrelenmiş soğuk hücre içi solüsyonla doldurun; böylece patch yöntemiyle seçilen astrositi kırmızıda, diğerlerini ise yeşil renkte görebilirsiniz. EGFP eksprese eden komşu astrositleri görüyorsunuz. GFAP Promotörü altında astrositler, yaklaşık 10 mikrometre civarındaki küçük soma boyutları ve genellikle üç ila dört dal içeren ana proses dallanmalarıyla tanımlanabilir.

Pipete tüp aracılığıyla bağlanan bir şırınga, komut penceresinde dokuya doğru inerken pozitif basınç uygulanmasına olanak tanır; 10 millivolt'luk bir test darbesi tetikleyin ve tutma akımını sıfırlayın. Ardından, hücreye yaklaşmak için pipeti mikro manipülatör yardımıyla doku içerisine hareket ettirin. Hücre yüzeyine ulaştığımızda, hücre yüzeyini hafifçe deforme ettiğimizi gösteren bir ışık sapması şeklinde görülen bir çöküntü (dimpling) oluşana kadar ilerlemeye devam ederiz.

Pozitif basınç uygulaması nedeniyle, astrositik hücre membranı artık cam pipet ucu açıklığına sıkıca mühürlenecektir; bu durum, giga seal'e ulaşıldığında artan bir direnç ile gözlemlenebilir. Komut penceresindeki test kısımlarını gözlemlerken, negatif basıncı nazikçe uygulayarak genel konfigürasyona geçip kapasitans kompanzasyonunu gerçekleştirin. Hücrenin delinmesi, membran üzerinden akan akım ile görünür hale gelecektir.

Bir dizi hiperpolarize ve depolarize voltaj basamağının uygulanması, hücre membranı özelliklerinin karakterize edilmesine olanak tanır; astrositler normalde yalnızca pasif akım yanıtları sergiler. Akım klembi modunda akım enjeksiyonu aksiyon potansiyeli ile sonuçlanmaz. Ateşleme olmaması, gerçekten bir astrositi patch ettiğinizin ek bir teyididir. Patch pipetinize sülforin veya domanine B gibi bir izleyici eklemek, patch edilen astrositin görselleştirilmesini sağlar.

Ayrıca, mevcut klempe modunda 20 dakika boyunca izleyicinin pasif difüzyonu, nöronal eksitatör iletimin çift kayıtlarını ve ardından uyarılmış astrositik akımları gerçekleştirmek için gap junction ile birbirine bağlı komşu astrositlerin görselleştirilmesini sağlar. Öncelikle, GABAerjik iletimin yokluğunda meydana gelen hipereksitabiliteyi önlemek için prekordin ile inhibitör iletimi bloke ediyoruz. CS üç ve C bir arasındaki shaer kollateralleri aracılı bağlantıları küçük bir iris bıçağı ile kesiyoruz.

Ardından bir A CSF alan stimülasyon elektrodu, bir alan kayıt elektrodu ve astrositik patch clamp elektrodunu yerleştiriyoruz. Hipokampus kesitinde bir astrosit seçiyoruz ve alan elektrodunu, astrositin gerçekten kaydedilen aktiviteyi entegre ettiğinden emin olmak için ondan 200 µm uzağa konumlandırıyoruz; Schaffer kollaterallerinin alan elektrodu stimülasyonu eksitatör bir alan potansiyeli oluşturacaktır. Bu alan potansiyeli, stimüle edilen akson sayısını yansıtan fiber volüme ve nöronal alan potansiyelleri ile astroglia tüm hücre akım yanıtlarının çift kayıtlarını gerçekleştirmek için subsequent postsinaptik depolarizasyona dayanmaktadır.

İlk olarak, alan kayıt elektrodunu seçilen astrositten yaklaşık 50 µm uzağa konumlandırın. Ardından, patch elektrodunu astrositik somaya getirin ve patch clamp işlemini gerçekleştirin; seçilen hücrenin gerçekten bir astrosit olduğu pasif membran özellikleri ile doğrulanmalıdır. Artık Shaer Cs stimülasyonu yaparak, nöral aktiviteyi ve ardından gelen astrositik akımı eş zamanlı olarak kaydedebiliriz; bu akım, ağ bağlantısallığına ve bir astrositin 100 nörona kadar olan sinapslarla temas ettiği gerçeğine bağlı olarak 50 pA'e kadar süren uzun süreli bir yanıttan oluşur.

Bu hücreler, tekil nöronların ve komşu astrositlerin ikili tüm hücre kayıtlarını gerçekleştirmek için eş zamanlı olarak aktive edilen çok sayıda sinapsın aktivitesini entegre eder; iki patch elektrodu ile hipokampus diliminin stratum bölgesine inilir. C1 bölgesinde ilgilenilen bir nöronu ve aynı derinlikte, yaklaşık 20 ila 60 µm uzaklıkta bir astrositi tanımlayın, ardından pozitif basınç uygularken her iki pipeti de her bir hücrenin yaklaşık 10 µm üzerine konumlandırın. Astrositik kayıt pipeti, daha fazla mekanik hareketten kaçınmak için hedeflenen astrosite mümkün olduğunca yakın konumlandırılmalıdır.

İlk olarak, nöron üzerinde gga sızdırmazlığını sağlayın. Şimdi, genellikle nöronlardan daha yavaş sızdırmazlık sağlayan astrosit yamama işlemine geçin. Çift bütünsel kayıtlar gerçekleştirmek için yapılması gereken önemli adımları özetlemek gerekirse, önce iki kayıt pipetini dilimin içine indirin.

Astrositin somasına yaklaşın, ardından nöron üzerinde gga mühürlemesi gerçekleştirin ve işlemi astrosit üzerinde gga mühürlemesi yaparak tamamlayın; nöronlar genellikle astrositlerden çok daha yüksek membran direncine sahiptir ve piramidal nöronlar için bu değer her iki hücrede de yaklaşık 200 ila 500 mega civarındadır. Şimdi voltaj clamp modunda T ve hiperpolarize ederek, membranın nöronda geçici sodyum akımlarını ve astrositte pasif potasyum yanıtlarını aktive etmesini sağlayın. Burada, shaa kollaterallerinin uyarılmasıyla hızlı eksitatör postsinaptik alan potansiyellerinin indüklenmesinin, ardından uzun süreli bir akım yanıtı uyandırdığını gösteriyoruz.

Komşu astrositte remik asit ile iyonotropik glutamat reseptörlerinin inhibisyonu, astroglial akımın büyük çoğunluğunun eksitatör postsinaptik aktivasyondan kaynaklandığını ortaya koymaktadır. Geriye kalan B AIC yanıtı, TBOA'ya duyarlı hızlı geçici glutamat transport oluşumu ve muhtemelen aksiyon potansiyeli ateşlemesi sırasındaki presinaptik potasyum salınımından kaynaklanan küçük, uzun süreli akımdan oluşur. Astrositik akım, presinaptik aktivite artışıyla birlikte her ikisi de doğrusal olarak arttığı için postsinaptik aktiviteyi oldukça güvenilir bir şekilde izler.

Ayrıca, astrositik akımlar nöronal yanıtlar gibi çiftli uyaran kolaylaştırması sergiler. Schaffer kollaterallerinin orta düzeyde tekil uyarımı, aynı hücrede akım kenetleme modunda kaydedilen küçük evoke depolarizasyona kıyasla nispeten büyük bir sinaptik evoke astroglial akım oluşturur. Bu durum, astrositlerin düşük membran direncinden kaynaklanmaktadır.

Sinaptik olarak uyarılan TTO glia membran potansiyeli dinamiklerinin kaydedilmesi, bir nöron ve bitişik bir astrositin eşleşmiş kayıtlarının yapılmasıyla lokal hücre dışı potasyum seviyelerinin doğrudan bir ölçümüdür; nöron aksiyon potansiyelleri oluştururken herhangi bir astrositik akım yanıtı gözlemlemedik, bu da elektriksel olarak eşleşmediklerini göstermektedir, CS3 bölgesinde uyarılan eksitatör postsinaptik potansiyel aynı zamanda astrositik akım yanıtlarını da tetiklemektedir. Ayrıca, tekil stimülasyon CS3 bölgesindeki nöronal yanıtı güçlü bir şekilde potansiyelize etmiştir. Astrositik akımı ise yalnızca orta derecede artırmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, nöronların ve astrositlerin başarılı çift elektrofizyolojik kayıtlarının nasıl kurulacağı ve gerçekleştirileceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalıyız. Bu tekniği kullanarak, ilgilendiğiniz elektrofizyolojik yanıt için nöronlar ve astrositler arasındaki çevrim içi dinamik sinyallemeyi inceleyebilirsiniz. Özellikle, iyon kanalı fonksiyonlarını ve modülasyonlarını içeren yeni GL etkileşimlerinin fizyolojik veya patolojik durumların belirlenmesine katkıda bulunup bulunmadığını araştırabilirsiniz.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneyinizde başarılar dileriz.