Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Klasik olarak postsinaptik öncesi ve sonrası elemanlar arasındaki iletişim, presinaptik terminale gelen ve kalsiyumu artırarak, glutamat aktive edici postsinaptik reseptörlerin salınmasını tetikleyen bir aksiyon potansiyelini içerir. Bununla birlikte, astrositlerin nörotransmitter reseptörlerini yakından temas ettiği, özetlediği ve eksprese ettiği gözlemi, görüşünü üç parçalı sinap kavramına dönüştürmüştür. Devam eden glutamaterjik iletim bu nedenle astrositi de aktive edecek ve hücre içi kalsiyum artışını tetikleyecektir.

Daha sonra ex ekstra sinaptik veya sinaptik reseptörlere bağlanmayı bağlayabilen glio vericilerinin serbest bırakılması, sinaptik öncesi ve sonrası aktiviteleri modüle eder. Ayrıca, astrositler sinaptik olarak salınan glutamat için ana alım sistemini ifade etti. Ek olarak, potasyum kanalları aracılığıyla pre ve postsinaptik terminalden eylem, potansiyel ateşleme ve müteakip postsinaptik aktivasyon sırasında salınan potasyumu temizlerler.

Bu potasyum daha sonra hücre içi olarak, salındığı veya boşluk bağlantıları yoluyla bitişik astrositlere yayıldığı daha düşük hücre dışı potasyum seviyelerinin bölgelerine taşınır. Bu nedenle, nöroaktif maddelerin hücre dışı konsantrasyonunu kontrol ederek ve berrak vericileri serbest bırakarak, astrositler sinaptik aktivitenin güçlü yönlerini tanımlamada önemli roller oynar. Laboratuvarım nöroglial etkileşimlerin serebral fizyopatolojideki rolünü araştırıyor.

Bu nedenle, an be an sinaptik iletimde astrositlerin duvarını çözmek için bu tekniği yaygın bir şekilde kullandık ve mükemmelleştirdik. Gerçekten de bu teknik, nöronların dinamik elektrofizyolojik tepkilerinin çevrimiçi ve eş zamanlı olarak izlenmesine izin verdiği için güçlüdür. Ve bugün Osteositler Evap kliniği olarak, laboratuvarın üyeleri Ash ve Jeremy Siebel size bu tekniği nasıl uygulayacağınızı gösterecek ve bize, cing'e, nöronlar ve astrositler arasında samimi bir diyaloga nasıl yardımcı olduğunu açıklayacak.

Astroglid ağlarının nöronlar, sinaptik iletim ve plastisite üzerindeki etkisini, nöron aktivitesi ve astroglif potasyum ve glut taşıma oluşumunun ikili kayıtlarını yaparak araştırdım ve asline ağının, nöral aktivite sırasında potasyum ve glutamatın hücre dışı uzaklaştırılmasını kolaylaştırdığını buldum. Astroglia oluşumunun doğasını, özelliklerini ve plastisitesini nörofizyoloji ile ilişkili olarak araştırdım. Astroglia ve nöronal evok aktivitesinin kaydı sırasında, çoğunlukla potasyum akımları ile nöronal aktivasyona astrosit tepkisini tanımlamama izin verin.

Bu akım, nöral kabul edilebilirliği ve plastisiteyi düzenlemeyen kendi elektrofizyolojik plastisitesine sahiptir. Başka bir deyişle, astrosit geri sayımı, çok heyecanlı olanı. Nörolar. Burada, presinaptik lif stimülasyonu ile uyarılan astrositik membran akımlarının ve pisuar besleme potansiyellerinin ikili kayıtlarını gerçekleştirerek akut hipokampal dilimlerde eş zamanlı idrar ve astroglia aktivitesini araştırmak için önemli bir yöntem sunacağız.

Ayrıca, nöronal aktivite sırasında ASTO glily yanıtlarını araştırmak için tek nöronların ve bitişik astrositlerin eşleştirilmiş kayıtlarını gerçekleştireceğiz. Hipokampusu seçtik çünkü bu bölge güçlü bir anatomik ve fonksiyonel bölümlendirme sergiliyor ve nöro devre, sinaptik Aktivite ve plastisite açısından iyi karakterize ediliyor. Bunun için önce Hipokampal beyin dilimleri hazırlayarak deneylere başlayın, oksijenli adı verilen buzları hazırlayın.

Yapay beyin omurilik sıvısı, farelerinizi derinlemesine uyuşturur ve hızlı bir şekilde kafayı kesin ve bir BOS'a aktarın. Kafatasını üç kesikle açın, şimdi iki yarım küre ayrıldı. Son olarak, onları oksijenli A BOS'a aktarın.

Yaklaşık beş dakika eşit şekilde örülmesine izin verin. Şimdi Bir yarım küre ile başlayın. Hipokampusun diseksiyonu orta beynin çıkarılmasıyla başlar.

Ayrıntılı hipokampus diseksiyonu şimdi bu şekilde gösterilmiştir. İlk olarak, orta beyne erişmek için ayrılan yarım küreyi kortikal bölgesine yerleştirin. İki kaşık yardımıyla orta beyni çıkarın.

Şimdi hipokampus, çizgi çizgileri ile gösterildiği gibi görünür olacaktır. Geniş bir yapı olarak görünen fia'dan başlayarak hipokampusu bir kaşıkla diseke edin. Hipokampusun altına bir kaşık yerleştirin ve ikinci bir kaşık yardımıyla hipokampusun bitişiğindeki korteksi kesin.

Hipokampusu oksijenli A BOS içeren küçük bir kültür kabına aktarın ve devam edin İkinci yarım küre ile her iki su aygırını alveo tarafı yukarı bakacak şekilde küçük bir AGA bloğuna yerleştirin. Şimdi DS A CSF'yi emmek. Su aygırını dilimleme odası cihazınıza yapıştırın.

Hipokampusu dilimleme odasına aktarın ve 300 veya 400 mikrometrelik dilimler kesin. Dilimleri oksijenli bir saklama odasında toplayın ve tek astrositlerin toptan kayıtlarını yapmak için oda sıcaklığında ön kayıt yaparak en az bir saat dinlendirin. Hipokampus diliminizi Polilisin kaplı bir kapak fişi üzerine aktarın.

Hipokampus diliminin poli kaplı kapak kızağına bağlanmasına izin vermek için fazla A BOS'u kurutun ve ardından dilimin üzerine tekrar A BOS ekleyin. Dilimi, dakikada bir ila iki mililitre perfüzyon hızında oksijenli A BOS ile sürekli perfüze edilen kayıt odanıza aktarın. Astrositleri tanımlamak için, astroglia spesifik GFAP promotörü altında EGFP'yi eksprese eden fareler, yama kelepçesi kayıtları için kullanılabilir.

Dört ila altı mega ohm dirençli bir cam boruyu, rodda dron içeren hücre içi çözelti kullanarak filtrelenmiş soğuk hücre içi çözelti ile doldurun, yamalı astrositi yeşil renkte kırmızı renkte görselleştirebilirsiniz. EGFP'yi ifade eden komşu astrositleri görüyorsunuz. GFAP Promotörü altında, astrositler yaklaşık 10 mikrometrelik küçük soma boyutları ve genellikle üç ila dört dal dahil olmak üzere ana işlem dallanmaları ile tanımlanabilir.

Tüp ile pipete bağlanan bir şırınga, komut penceresinde dokuya inerken pozitif basınç uygulamasına izin verir, 10 milivoltluk bir test darbesini tetikler ve tutma akımını yeniden başlatır. Daha sonra hücreye yaklaşmak için Mikro manipülatör yardımıyla pipeti dokuya doğru hareket ettirin. Hücre yüzeyine ulaştığımızda, hücre yüzeyini biraz deforme ettiğimizi gösteren bir ışık sapması olarak görünen bir çukurlaşma görene kadar ilerleriz.

Pozitif basınç uygulaması nedeniyle, astrositik hücre zarı artık cam boru ucu açıklığına sıkıca yapışacaktır, bu da bir giga contaya ulaşıldığında artan bir dirençle gözlemlenebilir. Kapasitans kompanzasyonunu gerçekleştirin, komut penceresinde test parçalarını gözlemlerken nazikçe negatif basınç uygulayarak toptan konfigürasyona girin. Hücreye girme, zardan geçen akımla görülebilir.

Bir dizi hiperpolarize edici ve depolarize edici voltaj adımının uygulanması, hücre zarı özelliklerinin karakterizasyonuna izin verir, astrositler Normalde sadece pasif akım tepkileri sergiler. Akım kelepçesi modunda akım enjeksiyonu, aksiyon potansiyeli ile sonuçlanmaz. Yamanıza kükürt veya domin B gibi bir İzleyici içeren bir astrosit ilavesini gerçekten Yamaladığınıza dair başka bir onay veren pipet, yamalı astrositin görselleştirilmesini sağlar.

Ayrıca, akım kelepçe modunda 20 dakika boyunca izleyicinin pasif difüzyonu, nöronal uyarıcı iletimin ikili kayıtlarını gerçekleştirmek için boşluk bağlantısına bağlı komşu astrositlerin görselleştirilmesini ve ardından ortaya çıkan astrositik akımları görüntülemeyi sağlar. GABAerjik iletimin yokluğunda ortaya çıkan hipereksitabiliteyi önlemek için önce inhibitör iletimi precortoin ile bloke ediyoruz. CS üç ve C bir arasındaki shaer teminat aracılı bağlantıları küçük bir iris bıçağıyla kestik.

Daha sonra bir A BOS alan stimülasyon elektrodu, bir alan kayıt elektrodu ve astrositik yama kelepçe elektrodu konumlandırıyoruz. Hipokampus diliminde, bir astrosit seçeriz ve astrositin Shafer teminatlarının alan elektrodu stimülasyonu ile kaydedilen aktiviteyi gerçekten entegre etmesini sağlamak için alan elektrodunu 5, 200 mikrometre uzağa yerleştiririz, uyarıcı bir alan potansiyeli uyandırır. Bu alan potansiyeli, uyarılmış aksonların sayısını yansıtan lif duvarından ve nöronal besleme potansiyellerinin ve astroglia tüm hücre akımı tepkilerinin ikili kayıtlarını gerçekleştirmek için müteakip postsinaptik depolarizasyondan oluşur.

İlk olarak, alan kayıt elektrodunuzu seçilen astrositten yaklaşık 50 mikrometre uzağa yerleştirin. Daha sonra yama elektrodunuzu astrositik soma ve yama kelepçesine taşıyın, seçilen hücre pasif zar özellikleriyle gerçekten bir astrosit olduğunu doğruladı. Şimdi Shaer C'leri uyararak, ağ bağlantıları ve bir astrositin 100 nörona kadar sinapslarla temas etmesi nedeniyle 50 pic oum yanıtına kadar uzun süreli bir nöral aktiviteyi ve müteakip bir astrositik akımı aynı anda kaydedebiliriz.

Bu hücreler, tek tek nöronların ve bitişik astrositlerin çift tam hücre kayıtlarını gerçekleştirmek için aynı anda aktive edilen çok sayıda Sinapsın aktivitesini entegre eder, iki yama elektrotu ile hipokampus diliminin tabaka alanına iner. C'de bir bölgede ilgilenilen bir nöronu tanımlayın ve aynı derinlikte yaklaşık 20 ila 60 mikrometre uzakta ve astrosit daha sonra pozitif basınç uygularken her iki pipeti de her hücrenin yaklaşık 10 mikrometre üzerine yerleştirin. Astrositik kayıt pipeti, daha fazla mekanik hareketi önlemek için hedeflenen astrosite mümkün olduğunca yakın yerleştirilmelidir.

İlk olarak, nöron üzerindeki gga mührünü elde edin. Şimdi, genellikle nöronlardan daha yavaş kapanan astrositi yamalamaya devam edin. Toptan İkili kayıt gerçekleştirmenin önemli adımlarını özetlemek için, önce iki kayıt kanalını dilime indirin.

Astrositin soma'sına yaklaşın, daha sonra nöron üzerinde gga contasını gerçekleştirin ve astrosit nöronları üzerinde gga contasını gerçekleştirerek sonlandırın, bu da astrositlerden çok daha yüksek bir membran direncine sahiptir, bu da her iki hücreye sahip 200 ila 500 mega civarında piramidal nöronlar içindir. Şimdi voltaj kıskaç modu T ve hiperpolarizasyonda, zar nörondaki geçici sodyum akımlarını ve astrositteki pasif potasyum Tepkilerini aktive eder. Burada, shaa teminatlarını uyararak hızlı uyarıcı postsinaptik alan potansiyellerinin indüksiyonunun, müteakip uzun süreli bir akım tepkisini uyandırdığını gösteriyoruz.

Bitişik astrositte, iyonotropik glutamat reseptörlerinin remik asit ile inhibisyonu, asto glikat akımının çoğunun uyarıcı postsinaptik aktivasyona bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. Kalan B AIC yanıtı, TBOA'ya duyarlı hızlı geçici glutamat taşıma oluşumundan ve büyük olasılıkla etki sırasında presinaptik potasyum salınımına bağlı küçük uzun süreli akımdan oluşur. Potansiyel ateşleme, asitik akımı çok güvenilir bir şekilde izler, çünkü her ikisi de presinaptik aktiviteyi arttırırken doğrusal olarak artar.

Ayrıca, astrositik akımlar nöronal tepkiler, eşleştirilmiş nabız kolaylaştırması gibi sergiler. Shaer teminatlarının orta derecede tek stimülasyonu, akım kelepçesi modunda aynı hücrede kaydedilen küçük uyarılmış depolarizasyona kıyasla nispeten büyük sinaptik olarak uyarılmış bir asto gli akımını indükler. Bu, astrositlerin düşük zar direncinden kaynaklanmaktadır.

Sinaptik olarak uyarılmış TTO gli membran potansiyel dinamiklerinin kaydedilmesi, bir nöronun ve bitişik bir astrositin eşleştirilmiş kayıtlarını gerçekleştirerek yerel hücre dışı potasyum seviyelerinin doğrudan bir ölçüsüdür, nöron elektriksel olarak bağlı olmadıklarını gösteren aksiyon potansiyellerini ateşlerken hiçbir astrositik akım tepkisi gözlemlemedik, CS üç bölgesinde uyarılan uyarıcı postsinaptik potansiyel de astrositik akım tepkilerini ortaya çıkarır. Ayrıca, birincisi, onun stimülasyonu, CS üç bölgesindeki nöronal yanıtı güçlü bir şekilde güçlendirdi. Astrositik akımı sadece orta derecede arttırdı.

Bu videoyu izledikten sonra, nöronların ve sitlerin başarılı ikili elektrofizyolojik kayıtlarının nasıl kurulacağını ve gerçekleştirileceğini daha iyi anlamalıyız. Bu tekniği kullanarak, ilgilendiğiniz elektrofizyolojik tepkiniz için nöronlar ve astrositler arasındaki çevrimiçi dinamik sinyallemeyi inceleyebilirsiniz. Özellikle, demir kanal fonksiyonlarını ve modülasyonlarını içeren yeni GL etkileşimlerinin fizyolojik veya patolojik durumları tanımlamaya katkıda bulunup bulunmadığını araştırabilirsiniz.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve denemenizde iyi şanslar.