Name: Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Öğrenin, MHC tetramer ve manyetik mikroboncuklar kullanarak nadir epitop-spesifik T hücrelerini fare lenfoid hücrelerinden izole etme yöntemini. Bu teknik, endojen T hücre yanıtlarını incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi için yardım Jenkins laboratuar Andre Han ve Lawrence Yen teknik yardım ve üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

1. Lenfoid Doku gelen Hücre İzolasyonu <ol><li> Bir küçük kare ihtiva eden bir 60 mm kültür çanağı, buz cEHAA (EHAA +% 10 FBS, pen / strep, gentamisin, 2 mM L-glutamin, 55 mM 2-merkaptoetanol) ya da diğer eşdeğer T-hücresi orta 1 ml ekleyin buz üzerinde 100 mikron naylon örgü ve yer. </li><li> Fare Euthanize. </li><li> Dalak ve mümkün olduğunca çok sayıda kolayca erişilebilir lenf düğümleri kaldırın. Bunlar en az inguinal, aksiller, brakial, servikal ve mezenterik lenf düğümleri içermelidir. Kültür çanak naylon örgü üstüne yerleştirin. </li><li> Yavaşça püre lenfositler kurtarmak için naylon örgü üzerinde, kapalı bir 1,5 ml mikrofuge&#39;de tüpünün üst kısmı düz lenfoid doku kullanma. Bir süspansiyon içine hücre çalışması için cEHAA ve pipet aşağı ve yukarı başka bir 1 ml ekleyin. 15 ml polipropilen santrifüj tüpünün üst üzerine yerleştirilen naylon örgü başka bir parça ile hücreleri aktarın. Buz cEHAA, po başka bir 1 ml çanak ve örgü durulayınaynı tüp içine miktarlar oling. 4 ml arasında bir nihai hücre süspansiyonu hacmi elde etmek için tekrarlayın. </li><li> 15 ml&#39;lik bir son hacim için (PBS +% 2 FBS,% 0.05 azid) sıralayıcı soğuk tampon ilave edin ve 4, 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj tüpü ° C. </li><li> Dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak süpernatant aspire. Yaklaşık olarak iki kat daha pelet kendisi ile eşit bir son hacim Fc blok (sıralayıcı tamponu + 2.4G2 antikor) olarak hücre pelet yeniden süspanse edin. Örneğin, saf bir fare dalak ve lenf düğümleri genellikle yaklaşık 100 ul hücre peleti üretir. Bu durumda, 200 ul hacim getirmek için Fc blok 100 ul ilave edin. Hücre topaklanma büyük ölçüde meydana gelmiş ise, dikkatli bir pipet ucu ile bu noktada cep tutam çıkarın. </li></ol> 2. Tetramer Boyama <ol><li> 10 nM (ya da deneysel olarak optimum konsantrasyon) bir son konsantrasyon için PE-veya APC-etiketli pMHC tetramer ekleyin. </li><li> Mix ve inkübasyonOda sıcaklığında (ya da deneysel olarak optimum süre ve sıcaklığı) 1 saat boyunca te. </li><li> 15 ml&#39;lik bir hacme kadar soğuk tampon sıralayıcı ekleyin ve 300 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle santrifüj tüpü Buz üzerinde veya ° C andan itibaren 4 numune tutun. </li><li> Dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak süpernatant aspire. 200 ul son hacim için sıralayıcı tampon içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Çift tetramer zenginleştirme için, 150 ul nihai hacim için tekrar süspansiyon. </li></ol> 3. Manyetik Zenginleştirme <ol><li> Miltenyi anti-PE ya da anti-APC mikroboncuk 50 ul ekle. Çift tetramer zenginleştirme için, her ikisi de 50 ul ilave edin. </li><li> 4&#39;te karıştırın ve 20 dakika için inkübe ° C </li><li> 15 ml&#39;lik bir hacme kadar soğuk tampon sıralayıcı ekleyin ve 300 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle santrifüj tüpü </li><li> Beklerken, bir MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs bir Miltenyi LS manyetik sütun kurdu. Bir açık bir 15 ml polipropilen santrifüj tüpüne yerleştirinsütununun altında doğrudan rafa. </li><li> O 15 ml tüp içine akabilmesi için, sütunun tepesine sıralayıcı tampon 3 ml ilave edilir. </li><li> Sütunun üstüne bir 100 mikron naylon örgü kare yerleştirin. </li><li> Hücreler iplik bitirdiğinizde, dikkatlice süpernatant aspirat ve sıralayıcı tampon 3 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Sütunun üst üzerine naylon ağ yoluyla hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Hücre süspansiyonu tamamen sütun içine boşalttıktan sonra, sıralayıcı tampon başka bir 3 ml&#39;lik tüp orijinal durulama ve sütun içine naylon ağ üzerinden aktarmak tampon, süreç içinde ağ durulama. Naylon örgü atın. </li><li> Tampon tamamen sütun içine boşalttıktan sonra, kolona sıralayıcı tampon başka bir 3 ml eklenir. </li><li> 3 x 3 ml yıkama toplam 10 adımı yineleyin. </li><li> Yeni bir 15 ml polipropilen santrifüj tüpü üzerinde mıknatıs ve yerden sütun çıkarın. </li><li> T sıralayıcı tampon 5 ml ekleyino sütun. </li><li> Hemen sütunun üst içine piston takın ve bir sürekli hareket halinde, tüpe kolonu tampon zorlayarak, piston tüm yol aşağı doğru itin. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca yıkandı bağlı fraksiyonu ve akan ilişkisiz bir fraksiyonu, 4 ° C&#39;de santrifüje içeren tüpler </li><li> Ayrıca herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak bağlı fraksiyondan süpernatan dikkatlice aspire. Tam olarak 95 ul son hacim için sıralayıcı tampon içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Aspire ve 2 ml arasında bir nihai hacim için bağlanmamış kısmı tekrar süspansiyon. </li></ol> 4. Akış Sitometri <ol><li> Her bir fraksiyonu için, 5 ul kaldırmak ve bir 5 ml FACS tüp içinde sayım boncuk 200 ul (sıralayıcı tampon içinde 200,000 / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile ayarlanmış olarak) eklenir. 4 at kenara ° C analizi için geç. Zamandan tasarruf etmek için, boncuklar deney başlamadan önce etiketli tüpler önceden aliquoted edilebilir. </li><li> Ben hazırlayınAntikorların aster karışımı hücreleri yüzey işaretleyicileri (Tablo 1) leke. Zamandan tasarruf etmek için, bu deney başlamadan önce yapılabilir. </li><li> Bağlı fraksiyonu için, tüp içinde hücrelerin ~ 90 ul doğrudan antikor kokteylinin bir doz ekleyin. Bağsız fraksiyonunun analiz istenirse, bir 5 ml FACS tüp için hücre 90 ul aktarımı ve antikor kokteyli bir doz ekleyin. </li><li> Akış sitometresi için tek renk telafisi denetimlerin paneli yukarı ayarlayın. Kullanılmak üzere her florokrom için, karşılık gelen florokrom ile konjuge anti-CD4 antikoru ile bir 1 ul FACS 5 ml tüp içinde kalan bağsız fraksiyonu hücreleri 50 ul ilave edilir. Bunun yanı sıra bir boyanmamış kontrol ayarlamayı unutmayın. </li><li> Girdap ve 4, 30 dakika için tüm örnekler inkübe ° C </li><li> 300 xg 5 dak, 4 ° C &#39;için her bir tüp ve santrifüj ile sıralayıcı tampon 5 mL </li><li> Bağlı fraksiyonu için, tampon dikkatlice sıralayıcı 200 ul süpernatan aspire hücreleri ve tekrar süspansiyonfer. 1.2 ml FACS mikrotüp içine hücreleri aktarın. Aynı mikrotüp içine sıralayıcı tampon ve havuz başka bir 200 ul ile tüp durulayın. Hücre kümeleri açık ise, bir 50 um filtre aracılığıyla hücre geçmektedir. </li><li> Ilişkisiz fraksiyonu ve tazminat kontrolleri, süzün veya supernatant ve tekrar süspansiyon 2 ml sıralayıcı tampon aspire için. </li><li> Tek renk telafisi kontrollerini kullanarak akış sitometresi ayarlayın. Kaydedilecek ek bir parametre olarak yan dağılım genişliği (SSC-W) seçin. </li><li> Şekiller 1 ve 2 de gösterildiği gibi, + ya da CD8 + T hücreleri CD4 belirlemek için ardışık içerme bir geçitlerinin dizisi kullanılarak boyanan numuneler analiz edin. Bağlı kesirler için, yukarı 2.000.000 toplam etkinlik azami mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri toplamak. Ilişkisiz kesirler için, 1.000.000 toplam etkinlik toplamak. Alma hızı saniyede etkinliklerde veya 3000 altında tutun. </li><li> Aynı makine ayarları kullanarak, sayma boncuk örnekleri analiz. 10,000 toplam etkinlik toplayın. &lt;/ Li&gt; <li> FCS dosyaları gibi tüm verileri kaydedin. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> FlowJo yazılımı kullanarak sayma boncuk örnekleri için FCS veri dosyalarını analiz edin. Plot ileri FITC ile saçılım ve (Şekil 1 ve 2) sayma boncuklar Kottbusser bir kapı ayarlayın. Her bir numune içinde tespit edilen boncuk sayma sayısını belirler. Toplanan hücre olayların sayısını belirlemek için toplanan olayların toplam sayıdan çıkart. </li><li> Kutu 1&#39;de denklemler kullanılarak her bir örnek tüm hücrelerinin toplam sayısını hesaplayın. </li><li> Lekeli ilişkili ve ilişkisiz fraksiyonu örnekleri için FCS veri dosyalarını analiz edin. Lenfoid +, yan genişlik dağılım-lo, dökümü-, CD3 +, CD4 + ya da CD8 +, tetramer Şekiller 1 ve 2 de gösterildiği gibi, her bir numune içinde + T hücreleridir. Belirlemek için ardışık içerme kapıları bir dizi ayarlama </li><li> CD4 tanımlamak için kullanılan içerme kapılarının her biri sıklığı + tetramer göre örnek bir hücre toplam sayısı çarpma+ Ya da CD8 + tetramer + hücreleri epitopu özgü T hücreleri (Kutu 1) toplam sayısını hesaplamak için kullanılır. </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol tarafından sunulan pMHC tetramer tabanlı cep zenginleştirme yöntemi endojen T hücre çizgilerinden epitop-spesifik T hücreleri incelemek için güçlü bir araçtır. PMHC tetramerleri kullanımı, doğrudan doğruya aynı kökten gelen pMHC ligandlar bağlamak için kendi TCRS yeteneğine dayalı epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlar. Zenginleştirme antijen-spesifik T hücrelerinin çok nadir topluluğunun, genetik ya da haberci frekans herhangi bir düzenlemesi olmadan T hücrelerinin endojen çizgilerinden tespit edil...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bayilik</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE veya APC konjuge pMHC tetramer (veya multimer)</td&gt;<td&gt; NIH tetramer çekirdek elde, araştırmacı tarafından yapılmış, ya da ticari kaynaklardan satın</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE konjuge manyetik mikroboncukları</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC konjuge manyetik mikroboncukları</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS manyetik sütunlar</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 veya 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hücre sayımı boncuk</td&gt;<td&gt; Yaşam Teknolojileri</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptid: epitop-spesifik t-hücrelerinin mhc tetramer bazlı zenginleştirme

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Vivo deneysel modellerde olan adaptif bağışıklık inceleyen araştırmacılar için temel bir gereklilik kendi T hücre antijen reseptör (TCR) özgüllük esas T hücreleri belirlemek için bir yetenek. Pek çok dolaylı yöntemlerle T-hücrelerinin bir yığın nüfus belirli bir antijen ile epitopu özgü T hücreleri proliferasyonu, sitokin üretimi, ya da aktivasyonu 1 ifadesi olarak işlevsel bir yanıt ölçümü ile tespit edilir ile in vitro uyarılmış olduğu kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birçok olası fonksiyon gösteren bir epitopuna özgü T hücreleri belirlemek, ve saf haberci frekanslarda epitopa spesifik T hücreleri saptamak için yeterli değildir. Popüler bir alternatif, TCR transjenik adoptif aktarım modeli olan bir TCR transjenik fare monoklonal T hücreleri EASI olabilir epitopa spesifik T-hücrelerinin geniş bir haberci nüfus oluşturmak için histocompatible taşıyıcılara yerleştirildiği tohumlanmıştırly bir congenic işaretleyici antikor 2,3 kullanımı ile izlenir. Güçlü olmakla birlikte, bu yöntem, 4,5, tek bir epitopu için spesifikliğe sahip olan T hücrelerinin unphysiological frekansı ile ilişkili deneysel eser uğrar. Ayrıca, bu sistem, bir poliklonal popülasyon içindeki epitopa spesifik T hücre klonlarının fonksiyonel heterojen araştırmak için kullanılamaz. MHC (pMHC) kompleksleri: kazanılmış bağışıklık incelemek için ideal bir şekilde sadece kendi akraba peptid bağlayıcı ile TCR özgüllük ayıran bir yöntem kullanılarak, endojen T-hücresi epitopu repertuarından-spesifik T hücrelerinin doğrudan saptanması içermelidir. PMHC tetramerleri ve akış sitometrisi kullanımı bu 6 gerçekleştirir, ancak şu antijen kaynaklı klonal büyüme bulunamadı epitopa spesifik T-hücrelerinin yüksek frekans popülasyonlarının tespiti ile sınırlıdır. Bu protokol, bir pMHC tetramerleri kullanımı ile koordine yöntem ve magnezyum tanımlamaktik hücre zenginleştirme teknoloji fare lenf dokuları 3,7 son derece alçak frekans epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlamaktır. Bu teknik sayesinde, bir kapsamlı immün yanıtın tüm aşamalarında farelerde endojen T hücrelerinin tamamı epitop özel popülasyonlarda izleyebilirsiniz.

Şekil 2&#39;de daha önceden ilgili peptid + CFA ile bağışık hale getirilen farelerin için temsilci veriler göstermektedir iken Şekil 1, saf farelerden alınan pMHCII tetramer zenginleştirilmiş dalak ve lenf düğümü numuneleri için temsili akış sitometrisi parselleri göstermektedir. Seri yolluk CD4 analizi + T hücre popülasyonlarının gelen autofluorescent ve diğer istenmeyen olaylar kaldırır. CD8 + T hücre populasyonunun CD4 pMHCII tetramer boyama + T hücreleri için kullanışlı bir iç negat...

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma sağlar<em&gt; In vivo</em&gt; Deneysel sistemler.

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

In vivo deneysel modellerle adaptif bağışıklığı çalışan araştırmacılar için temel bir gereklilik, T hücrelerini T hücresi ...'lerine göre tanımlayabilme yeteneğidir.

Bu deneyin genel amacı, farelerin endojen T hücresi repertuvarından nadir epitop spesifik T hücrelerini tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle toplanan lenfoid hücrelerin, ilgili epitop spesifik T hücrelerini floresanla işaretleyecek olan peptit MHC tetramer ajanları ile boyanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, tetramer ile işaretlenmiş bu hücreler, tetramerdeki floresan etikete özgü antikorlarla konjuge edilmiş manyetik mikroboncuklarla boyanır.Ardından, tetramer bağlı epitop spesifik T hücreleri yönünden örneği zenginleştirmek için manyetik olarak işaretlenmiş hücreler manyetize edilmiş bir kolondan geçirilir. Son olarak, hücreler istenen deneysel hücre markerları için boyanır ve nadir tetramer zenginleştirilmiş epitop spesifik T hücresi popülasyonlarını saptamak ve miktarını belirlemek için çok parametreli akış sitometrisi uygulanır. Bu tekniği, TCR Transgenik T hücresi adoptif transfer sistemi gibi mevcut diğer yöntemlere tercih etmenin temel avantajı, çalışmaların bağışıklık sistemi içinde doğal olarak gelişen gerçek poliklonal epitop spesifik T hücresi popülasyonları üzerinde gerçekleştirilmesidir.Ayrıca, bu tekniğin sağladığı yüksek tespit hassasiyeti, bu popülasyonların aşırı düşük frekanslarda bulunduğu durumlarda çalışılmasına olanak tanır. Bu yöntem, immünoloji alanındaki birçok temel sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, kaç adet naif T hücresinin patojenik bir mikroba ait belirli bir antijeni tanıyabileceği ve epitopa özgü bir T hücresi popülasyonunun klonal kompozisyonunun bir immün yanıt süreci boyunca nasıl değiştiği gibi. Diseksiyona başlamadan önce, 100 micron naylon mesh içeren küçük bir kare parçanın bulunduğu 60 millimeter kültür kabına bir mililitre tam EHAA medyumu ekleyin ve kabı buz üzerine yerleştirin.Ardından, ötanazi uygulanmış bir fareden dalak ve mümkün olduğunca çok sayıda kolayca erişilebilir lenf nodu çıkarın. Dokuları kültür kabındaki naylon ağın üzerine yerleştirin. Kapalı bir 1,5 milimetrelik mikrosantrifüj tüpünün düz üst kısmını kullanarak, naylon ağ üzerindeki lenfoid dokuları nazikçe ezin.Lenfositleri serbest bırakmak için kaba bir mililitre daha besiyeri ekleyin ve ardından hücreleri süspansiyon haline getirmek için solüsyonu pipetle aşağı yukarı çekin. Şimdi, yeni bir 15 mililitrelik polipropilen santrifüj tüpünün üzerine yeni bir naylon ağ yerleştirin ve ardından hücreleri yeni ağ üzerinden aktarın. Kabı ve ağı bir mililitre daha soğuk besiyeri ile durulayın ve bu hacimleri yeni ağ parçası üzerinden 15 mililitrelik tüpe geçirin.Durulama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Soğuk sorter tamponu ekleyerek final hacmi 15 mililitreye tamamladıktan sonra, tüpü beş dakika boyunca 300 ×g ve dört °C'de santrifüjleyin. Ardından snat resus'u dikkatlice aspire edin.Hücre pelletini, toplam hacim pelletin hacminin yaklaşık iki katı olacak şekilde FC blok çözeltisinde süspanse edin. Eğer yüksek derecede hücre kümelenmesi meydana gelmişse, antijene özgü T hücrelerini boyamak için hücre kümelerini bir pipet ucuyla dikkatlice uzaklaştırın.Resüspande edilmiş hücre peletine, optimize edilmiş konsantrasyonda floresan işaretli peptit MHC tetramerini ekleyin. Ardından hücre süspansiyonunu karıştırın ve tetramer bağlanması için optimize edilmiş süre ve sıcaklıkta inkübe edin. Sonrasında, hacmi 15 mililitreye tamamlamak için soğuk sorter tamponu ekleyin ve hücreleri dört derece santigrat sıcaklıkta tutarak santrifüjleyin.Şu andan itibaren süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından hücre pelletini, nihai hacim 200 µL olacak şekilde sorter tamponunda yeniden süspanse edin. Şimdi, tetramer karışımının floresan etiketine spesifik olarak bağlanacak 50 µL Miltenyi antikor konjuge mikrobobekleri ekleyin ve ardından tetramere bağlanmış hücreleri ve boncukları 4 °C'de inkübe edin.20 dakika sonra, hücreler santrifüjdeyken hücreleri sorter tamponu ile yıkayın. Bir Milani LS manyetik kolonunu Quadro Max mıknatısı üzerine yerleştirin ve yeni bir 15 mililitrelik polipropilen santrifüj tüpü konumlandırın. Kolonun hemen altına, kolonun üst kısmından üç mililitre sorter tamponu ekleyerek 15 mililitrelik tüpe süzülmesini sağlayın.Ardından, kolonun üzerine 100 mikronluk bir naylon ağ şeklinde kare yerleştirin. Hücrelerin santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı dikkatlice aspire edin ve peleti üç mililitre sorter tamponu içerisinde yeniden süspanse ederek, hücre süspansiyonunu naylon ağ üzerinden kolonun üst kısmına aktarın. Hücre süspansiyonu kolona tamamen süzüldüğünde, orijinal tüpü üç mililitre daha sorter tamponu ile durulayın ve bunu ağ üzerinden kolona aktarın.Yıkama sıvısını toplama tüpünde biriktirip naylon ağı atın. Ardından, tampon çözelti tüpe tamamen süzüldüğünde, kolonu her seferinde üç mililitre ayıklama tamponu ile iki kez daha yıkayın. Daha sonra kolonu mıknatıstan çıkarın ve yeni bir 15 mililitrelik polipropilen santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin.Şimdi kolona beş mililitre daha ayıklama tamponu ekleyin. Pistonu hemen kolonun üst kısmına yerleştirin ve tek bir sürekli hareketle, tamponu kolonun dışına tüpe doğru itecek şekilde pistonu tamamen aşağı indirin. Elüsyonla elde edilen bağlı fraksiyonu içeren tüpü ve akış yoluyla geçen bağlı olmayan fraksiyonu içeren tüpü santrifüjledikten sonra, bağlı fraksiyondaki süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini, son hacmi tam olarak 95 µL olacak şekilde ayıklama tamponunda yeniden süspande edin; hücre fraksiyonlarını daha fazla boyamadan önce bağlı olmayan fraksiyonu aspire ederek iki mililitrelik son hacme yeniden süspande edin, beş mililitrelik bir FACS tüpüne 200 µL sayım boncuğu ekleyin ve bu tüpe beş mikrolitre hücre aktarın.Bu tüpleri analiz için dört derece Celsius'ta kenara ayırın. Daha sonra, tabloya uygun olarak hücrelerdeki yüzey belirteçlerini boyamak için bir antikor ana karışımı hazırlayın. Bağlı fraksiyon için, antikor kokteylini doğrudan hücrelere ekleyin; bağlanmamış fraksiyon için ise aynı işlemi gerçekleştirin.Hücrelerin 90 µL'sini beş mililitrelik bir fax tüpüne aktarın ve aktarılan örneğe, kullanılacak her bir florokrom için bir doz antikor kokteyli ekleyin. Hücrelerin geri kalan bağlanmamış fraksiyonundan 50 µL'yi, beş mililitrelik bir fax tüpünde, uygun florokroma konjuge edilmiş bir mikrolitre anti CD4 antikoru ile karıştırın. Ayrıca boyanmamış bir kontrol grubu ayırın; ardından örnekleri vorteksleyin ve tüm örnekleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, her bir tüpü beş mililitre sorter tamponu ile yıkadıktan sonra, bağlı fraksiyon örneklerindeki süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 200 µL sorter tamponu içinde yeniden süspande edin. Hücreleri 1,2 mililitrelik faks mikrotüplerine aktarın ve ardından önceki tüplerini başka bir 200 µL sorter tamponu ile durulayıp, durulama sıvılarını ilgili mikrotüplerde toplayın. Eğer kümeler görülüyorsa, bağlı olmayan fraksiyon ve kompanzasyon kontrolleri için hücreleri 50 mikronluk bir filtreden geçirin, süpernatantı dökün ve pelletleri bir mililitre sorter tamponu içinde yeniden süspande edin.Bağlı fraksiyon örnekleri için burada gösterildiği gibi, CD4 pozitif veya CD8 pozitif T hücrelerini tanımlamak amacıyla birbirini izleyen kapsama kapıları (inclusion gates) dizisini kullanarak boyanmış örnekleri analiz edin. Bağsız fraksiyon örnekleri için, toplamda maksimum 2 milyon olayla sınırlı olmak üzere mümkün olduğunca çok hücre toplayın. Toplam 1 milyon olay toplayın.Son olarak, aynı cihaz ayarlarını kullanarak sayım boncuğu örneklerinden 10.000 olay toplayın. Bu ilk şekil, naif farelerden alınan peptid MHC iki tetramer ile zenginleştirilmiş dalak ve lenf düğümü örneklerinin bağlanmış ve bağlanmamış hücre fraksiyonlarına ait temsili akış sitometrisi grafiklerini GÖSTERMEKTEDİR. Lenfoid saçılım pozitif, yan saçılım düşük, dump negatif, CD üç pozitif olayları seçmek için bir dizi kapı ayarlanmıştır; bu CD dört pozitif veya CD sekiz pozitif olaylar, epitop spesifik T hücrelerinin veya arka plan boyanmasının analizi için kapılanmıştır.Bağlı ve bağlı olmayan fraksiyonlardan alınan boyanmamış hücre alikotları, floresan sayım boncuklarıyla karıştırıldı ve ayrı ayrı analiz edildi. Bu yoğunluk grafikleri, daha önce ilgili peptit ve komplet adjuvan ile immünize edilmiş farelere ait temsili verileri göstermektedir. Ot floresansını ve diğer istenmeyen olayları temizlemek için önceki deneyle aynı seri kapılama stratejisi kullanılmıştır.CD4 pozitif T hücresi popülasyonlarının analizinden elde edilen sonuçlara göre, CD8 pozitif T hücresi popülasyonu, CD4 pozitif T hücrelerinin peptit MHC II tetramer boyaması için kullanışlı bir dahili negatif kontrol görevi görmüştür. Bir örnekteki epitopa özgü T hücrelerinin mutlak sayısı, boncuk sayımı analiziyle belirlenen zenginleştirilmiş örneğin bağlanmış fraksiyonundaki toplam hücre sayısının, hücre boyama analizinden belirlenen tetramer pozitif hücrelerin oranıyla çarpılmasıyla hesaplanır; ilk yoğunluk grafikleri serisinde gösterilen temsili naif fare verileri için toplam hücre sayısı 4.411 ve boncuk sayısı 5.589'dur. Boncuk stok konsantrasyonu mL başına 2 × 10⁵ idi.Boncuk hacmi 0.2 milliliters ve hücre hacmi 0.005 milliliters idi. Bu veriler, mililitre başına 6.31 × 10⁶ hücre konsantrasyonunu hesaplamak için kullanıldı. Ardından, toplam hücre sayısını belirlemek için hücre konsantrasyonu toplam örnek hacmi ile çarpıldı.Hücre analizinden elde edilen tetramer pozitif olayların yüzdesi ile bu veriler çarpılarak, bu naif fareden elde edilen epitop spesifik CD4 pozitif T hücresi sayısının 98 olduğu belirlenmiştir. İkinci yoğunluk grafiği serisindeki temsilci immünize fare verileri için, toplam epitop spesifik CD4 pozitif T hücresi sayısı 1,53 × 10⁴ idi. Epitop spesifik T hücresi sayısı arttıkça, zenginleştirme verimliliği azalır.Böylece, epitop spesifik T hücrelerinin çok yüksek frekanslarda bulunduğu örneklerin bağlanmamış fraksiyonunda tetramer pozitif hücreler görülebilir. Bu gibi durumlarda, bağlanmamış fraksiyonda bulunan epitop spesifik T hücrelerinin sayısı ayrı ayrı hesaplanabilir ve bağlanmış fraksiyonda bulunan sayıya eklenebilir. Örneğin, temsili immünize fare bağlanmamış hücre fraksiyonunda, toplam epitop spesifik CD4 pozitif T hücresi sayısı 8,97 × 10³ idi.Böylece, bağlanmış ve bağlanmamış fraksiyonlardaki sayıların toplanmasıyla, immünize edilmiş fare örneğinin tamamında toplam 2,43 × 10⁴ epitop spesifik CD4 pozitif T hücresi olduğu belirlenmiştir. Nitekim, epitop spesifik hücre genişlemesi yeterince güçlüyse, zenginleştirme işlemi atlanabilir. Zenginleştirme prosedürünün ardından, sitokinler ve transkripsiyon faktörleri gibi hücre içi proteinlerin boyanmasını sağlamak için fiksasyon ve permeabilizasyon adımları uygulanabilir.Bu yöntem başlangıçta dalak ve lenf düğümlerinden alınan T hücreleri çalışmaları için tasarlanmış olsa da, timus ve bağırsak gibi diğer dokulara da uygulanabilir. Teknik ayrıca insan kanı ve doku örneklerindeki epitipe özgü T hücrelerini incelemek için de kullanılabilir.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Bu videoda, antijenik peptit yüklü MHC-Ig'ler ve anti-CD28 antikorları ile işlevselleştirilmiş manyetik nanopartikül bazlı yapay antijen sunan hücreler (aAPC'ler) kullanılarak nadir antijene özgü CD8+ T hücrelerinin izole edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. aAPC'lerin, antijenik peptit hedefli T hücresi reseptörlerini spesifik olarak eksprese eden CD8 + T hücreleri ile etkileşimi ve ardından in vitro genişlemeleri, bu CD8 + T hücresi popülasyonunun zenginleşmesi ve genişlemesi ile...

Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Nanopartikül Bazlı Zenginleştirilmesi ve Genişletilmesi

Bu videoda, peptit majör histouyumluluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tetramerleri kullanılarak simian immün yetmezlik virüsüne (SIV) özgü CD8+ bellek T hücrelerinin karakterize edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Bir pMHC-I tetrameri, SIV'e özgü peptitlere bağlı ve bir florofora konjuge edilmiş dört MHC-I molekülünden oluşan bir komplekstir. Bu tetramerler, SIV'e özgü CD8 + T hücreleri üzerindeki T hücresi reseptörlerine (TCR'ler) seçici olarak bağlanır ve bu hücrelerin karakterizasyonunu...

SIV'e Özgü CD8+ Bellek T Hücrelerini Analiz Etmek için Bir Peptit-MHC-I Tetramer Boyama Tekniği

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi + Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Öğrenin, MHC tetramer ve manyetik mikroboncuklar kullanarak nadir epitop-spesifik T hücrelerini fare lenfoid hücrelerinden izole etme yöntemini. Bu teknik, endojen T hücre yanıtlarını incelemek için değerli bir araçtır.

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

Daha fazla video keşfet