Nanopartiküllerin Optik Yakalama

Bu prosedürün genel amacı, yaklaşık 20 nanometre boyutundaki parçacıkları yakalamak için bir açıklıklı optik tuzaklama düzeneği oluşturmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, ölçüm yapabilmeyi sağlamak amacıyla mevcut bir optik lazer tuzaklama düzeneğine bir detektör eklenir. Ardından, ölçülecek nanoparçacık çözeltisi çift nano delikli tuzağın bulunduğu mikroakışkan bir odağa aktarılır ve odağa optik tuzaklama düzeneğine yerleştirilir.

Bir parçacık aydınlatılmış açıklığa girdiğinde, dielektrik yükleme nedeniyle ışık transmisyonu önemli ölçüde artar. Parçacık açıklıktan ayrılmaya çalıştığında, azalan transmisyon delikten dışarı doğru bir momentum değişimine neden olur ve Newton'un üçüncü yasası uyarınca parçacığı geri deliğe çeken, onu hapseden bir kuvvet oluşturur. Parçacık, transmisyon eğrisinde izlenebilen bir kırmızıya kayma meydana getirir.

Böylece, tuzak bir sensöre dönüştürülebilir. Nihayetinde, çift nano delik üzerinden lazer yoğunluğundaki değişimlerle belirtilen, yakalanan proteinlerin açılması da dâhil olmak üzere nanoparçacıkların yakalanma olaylarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin gradyan kuvvetli optik tuzaklama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha düşük lazer yoğunluklarıyla daha küçük nanoparçacıkları yakalayabilmesidir.

Bu yöntem, tekil proteinlerin nasıl katlandığı ve etkileşime girdiği ve virüs partiküllerinin canlı hücreleri nasıl enfekte ettiği gibi biyokimyadaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, çift nano delik yapısının mevcut bir lazer tuzaklama sistemine entegre edilmesinin zor olması nedeniyle, bireyler bu yöntemi uygularken zorluk yaşayabilirler. Optik tuzaklama düzeneği, kuvvet ölçüm modülü ile donatılmış bir Thor Lab optik cımbız kitine dayanmaktadır.

Kuvvet ölçüm modülündeki kuadran dedektörünün yerine bir avalanche fotodiyod kullanılır. Optik tuzaklama sistemi kurulurken, lazer açık olduğu sürece göz koruması kullanılmalıdır. Kapalı bir odada çalışarak ve ışını tuzaklama düzeneği içinde mümkün olduğunca sınırlayarak ışının güvenli bir alan içinde kalmasını sağlayın; yansıtıcı takılardan kaçınılmalıdır.

Lateks eldivenler giyilir. Optik düzeneğin temizliğini sağlamak için optik cımbız kiti ve kuvvet ölçüm modülü kurulur. Üretici talimatlarına göre, monte edilmiş optik cımbız kiti ters ışık mikroskobu tasarımına sahiptir ve bir tuzak lazerinden, 100 x yağ daldırma objektifinden, üç eksenli bir numune konumlandırma tablasından ve bir CCD kameradan oluşur.

Lazer diyotlarla çalışırken elektrostatik boşalma korumasının tavsiye edildiğini lütfen unutmayın. Kuvvet ölçüm modülü, kondansatörün arka odak düzleminin konum tespiti kullanılarak optik cımbızların kalibrasyonuna olanak tanır. Kuvvet ölçüm modülleri yerine silikon tabanlı bir çığ foto diyodu (APD) veya bir PD kullanılır.

Kuadrant konum dedektörüne ayrıca 200 kilo ohm direnç ve 100 pikofarad kapasitör kullanılarak bir direnç kapasitör veya RC filtresi ekleyin. Bu, yüksek frekanslı gürültüyü azaltmak ve osiloskopta hapsetme olaylarının görülmesini kolaylaştırmak için kullanılır. RC filtresini APD'den sonrasına bağlamak için koaksiyel bir kablo kullanın. Ardından, osiloskopu ve veri toplama modülünü RC filtresine bağlamak için koaksiyel kablolar ve bir T adaptörü kullanın.

Sistem şu anda numune yüklemeye hazırdır. Çift nano delik açıklığı, odaklanmış bir iyon demeti ile altın bir filme açılmış iki nano delikten oluşur. Film 100 nanometre kalınlığındadır ve cam bir taban ile desteklenmiştir.

Nano delikler, iki keskin uç oluşturacak şekilde üst üste biner. Nanoparçacıklar, çift nano deliğe gelen lazer ışığı tarafından bu uçlar arasındaki boşluğa hapsedilecektir.

Optik mikroskopta çift nano delik konumunu belirlemeye yardımcı olmak için metal filme büyük hizalama özellikleri de işlenmelidir. Bu özellikler, çift nano delikten yaklaşık 100 mikron uzakta konumlandırılmalıdır. Tek kullanımlık bir kaba 10 gram polidimetilsiloksan veya PDMS baz ve bir gram kürleme ajanı dökün. Birkaç dakika boyunca karıştırın.

Ardından, tüm kabarcıklar gidene kadar karışımı bir vakum odasında boşaltın. Sonrasında, dokuz santimetre çapındaki bir Petri kabına 1,5 gram PDMS dökün. Spinleme işlemini takiben PDMS'yi Petri kabının tabanına 65 saniye boyunca 950 RPM'de spin kaplama yöntemiyle uygulayın.

80 mikronun altında olduğu sürece kalınlık kritik değildir. Üç ila beş adet 1,5 numara lameli, birbirlerinin üzerine gelmeyecek şekilde PDMS üzerine nazikçe yerleştirin ve 30 dakika boyunca vakumlayın.

Tahliye işlemi sırasında lameller kayarsa ve üst üste binerlerse, onları nazikçe birbirinden ayırın. Lameller altındaki PDMS tabakasının ince ve homojen olduğundan emin olun. Ardından, Petri kabını tekrar 30 dakika boyunca tahliye edin.

Petri kabını vakum odasından çıkarın ve PDMS'yi kürlemek için sıcak plaka üzerinde 85 °C'de 20 dakika boyunca ısıtın. PDMS katılaştığında, bir jilet kullanarak lamel kapaklarından birinin kenarları boyunca kesin. Ardından, ince uçlu bir cımbız veya bir bıçak yardımıyla lameli nazikçe yukarı kaldırın; ince bir PDMS tabakası lamel kapağına yapışacaktır.

PDMS kaplı lameletle yeni bir Petri kabına yerleştirin. Ardından bir jilet kullanarak, PDMS üzerinde üç milimetreye üç milimetrelik bir pencere kesin. Bu pencere, nanoparçacık solüsyonunun tutulacağı hazneyi oluşturacaktır.

Merkezinde üç çeyrek inç çapında bir delik bulunan akrilik bir mikroskop lam tutucusu üretmek için bir lazer kesici kullanın. Deliğin çevresini çift taraflı bantla bantlayın. Fazla bantları temizlemek için bir jilet kullanın.

Hazırlanan mikroskop lamını, PDMS'nin cam ve akrilik arasında sandviç şeklinde kalacağı şekilde, önceden hazırlanmış PDMS kaplı lamel örtülerden birinin üzerine yerleştirin. Bir mikropipet kullanarak, PDMS penceresine birkaç damla %0,05 ağırlık/hacim oranında polistiren nanoküre çözeltisi ekleyin.

Nano deliklerin bulunduğu altın film üzerine bir damla ekleyin. Altın numuneyi, nano delikler PDMS penceresinin içinde kalacak şekilde lamine camların üzerine yerleştirin. Hazne içinde hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.

Ardından, altın örneği kapağa doğru bastırın. Yağ daldırma objektifi kullanılacağı için, fazla çözeltiyi bir peçete yardımıyla hafifçe çekip kurulayın. PDMS penceresinin üzerindeki lamelin diğer tarafına bir damla yağ ekleyin.

Nano deliklerin konumunu belirleyin. Mikroskobu yerleştirin. Lamı, yağlı yüzeyi aşağı bakacak şekilde lam tutucuya sürün ve ardından immersiyon yağı mikroskoba temas edene kadar lam tutucuyu aşağı indirin.

Objektif ile, altın film üzerine kazınmış hizalama işaretleri objektifin altına gelecek şekilde lam tablasını kaba olarak hizalayın. Tuzaklama kitinin bir parçası olarak sunulan Thor site gibi bir görüntüleme yazılımı kullanarak, altın film üzerindeki hizalama işaretlerini bulun ve nano deliklere kadar uzanan gösterge çizgilerini takip edin.

İndikatör işaretleri ve diğer açık alanlar ekran merkezinden uzaklaşacak şekilde lamı konumlandırın. Aşırı ışık iletimi APD'ye zarar verebilir, lazeri açın. Dikroik ayna mükemmel olmadığı için, lazer ışınından kaynaklanan bir nokta ekranın merkezine yakın bir yerde görünmelidir.

Piezo sahne kontrol yazılımını kullanarak, üç eksendeki hizalamayı daha da hassaslaştırın. Hizalama doğru olduğunda, nano açıklıktan en yüksek iletimi belirten maksimum bir PD voltajı gözlemlenecektir.

Sistem kurulup numune yüklendikten sonra, optik tutma verileri elde edilebilir. Gösterge işaretlerin yardımıyla spotu, bilinen bir nano delik konumunun yakınına yerleştirin. Çift nano delikler, net bir şekilde ayırt edilemeyecek kadar küçük olacak ve ekranda küçük noktalar şeklinde görünecektir.

Numuneden geçen ışık geçirgenliği, osiloskop üzerindeki sinyal seviyesi ile belirtilir. Işık geçirgenliğini maksimize etmek için numuneyi daha fazla hizalayın. Gösterge işaretlerine, görünür ve görünmez çiziklere dikkat edin; çünkü bu bölgelerde ışık geçirgenliği yüksek olacaktır, nano delikler ışık geçirgenliğinde ani sıçramalar gösterirken çizikler farklı seyredecektir.

Dalga plakası kullanarak daha kademeli değişimler sergileyin. Çift nano delik yapısı polarize olduğu için, en yüksek ışık geçirgenliğini elde etmek amacıyla ışık polarizasyonunu ayarlayın. Veri toplamak için, veri toplama modülünü kullanarak APD'lerin voltajını istenen süre boyunca örnekleyin.

Kazanım süreleri tipik olarak yüzlerce saniye mertebesindedir. Bu durumda, veri kazanımı için özel bir yazılım kullanılmış ve voltaj saniyede 2000 kez örneklenmiştir. MATLAB kullanarak, kazanılan verileri bir KY Gole filtresi ile süzün ve 20 nanometre polistiren nanoparçacıkların yakalanmasını göstermek için bunu bir grafik üzerinde zamana karşı kestirin; çift nano delikten geçiş, zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülmüştür.

Ardından bir PD kullanılarak optik iletim grafiği çizilmiştir. Zaman içinde, yakalama olayı, bu örnekte gösterildiği gibi iki iletim güç seviyesi arasında net bir geçiş gösteren keskin bir kenarla karakteristik olarak anidir; yakalanmış durumda sıklıkla sinyal gürültüsünde bir artış görülür. Bu gürültü artışı, yakalanan parçacığın brownian hareketinden kaynaklanmaktadır.

Hapsedilmiş parçacık olmadığında, bu gürültü kaynağının mevcut olmadığını unutmayın. Sonuçlarda, hapsetme olaylarını göstermeyen bazı artefaktlar ortaya çıkabilir. Burada gösterildiği gibi, dakikalar boyunca iletimde yavaş değişimler şeklinde görülen sürüklenmeleri içeren sonuçlar göz ardı edilmelidir. Bu prosedürün ardından, hapsedilen nanoparçacığın doğasına ilişkin ek soruları yanıtlamak amacıyla Raman ve floresan spektroskopisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, araştırmacıların biyolojik olarak ilgili nanoparçacıkları tek molekül düzeyinde incelemelerinin önünü açmıştır. Örneğin, hem protein bağlanmasını algılamak hem de virüs enfeksiyonunu tek molekül düzeyinde incelemek için kullanılmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, tekil nanoparçacıkları yakalamak için çift nHO optik tuzağın bir ters mikroskop lazer T sistemine nasıl entegre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.