Name: Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, taze dokulardan normal ve kanser ilişkili fibroblastları FACS ile izole etme yöntemini. PDGFRα kullanılarak yüksek saflıkta hücre popülasyonları elde edilir ve gen ekspresyon profili korunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz FACS sıralama ile yardım için Dr Yitzchak Oschry ve Dr Orit Sagi-Asif ederim. Bu araştırma hibe sözleşmesi n kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) NE hibe tarafından desteklenen ° [276.890], İsrail Kanser Derneği (# 20110078), gelen ve İsrail Kanser Araştırma Fonu (Research Kariyer Geliştirme Ödülü).

1. Fare gelen Meme veya Deri Doku Diseksiyon <ol><li> Farelerin istenilen doku diseksiyon önce, aşağıdaki sarf malzemeleri ve reaktifler hazırlamak: Malzemeleri: <ul><li> Cerrahi araçları (deterjan ile yıkandı ve daha sonra% 70 etanol içinde batırılmış). </li><li> Strafor yüzey diseksiyonu sırasında fare dinlenmek için. </li><li> Veya iğne diseksiyonu sırasında fare tutun. </li><li> Manyetik karıştırıcı (otoklav) içeren sindirim için kapaklı cam kavanoz,. </li><li> 37 Su banyosu ° C, heyecan plaka üzerinde dinlenirken, bir dalgıç manyetik karıştırıcı ve batığın sindirim kavanozu için yeterli miktarda su içeren. </li></ul> Reaktifler: <ul><li> FACS tampon I: (4 ° C): Dulbecco Fosfat (Kalsiyum Magnezyum Ücretsiz) Salin CMF Buffered +% 0.5 BSA </li><li> Kollajenaz çözeltisi (kullanımdan hemen önce yapılmış): 0.05 g kollajenaz II 0.05 g kollajenaz IV 0.01 g deoksiribonükleaz 20ml FACS tampon I. kullanıma kadar buz üzerinde kollajenaz çözüm tutun. </li><li> PharmLyse (Amonyum Klorür Parçalama Reaktifi). </li><li> FACS tampon II: Dulbecco&#39;nun Fosfat Tamponlu Tuzlu CMF +% 1 FCS. </li></ul></li><li> Meme bezlerinin diseksiyonu (ayrıca 17 bakınız). <ul><li> Karbon dioksit (CO 2) inhalasyon kullanmaya dişi farelerde Euthanize. </li><li> Strafor yüzey üzerinde, sırtında fare yerleştirin ve sıkıca 25 gauge iğneler (Şekil 1A) kullanarak tüm dört bacağı pin. % 70 etanol ile cömertçe fare püskürtün. </li><li> Forseps kullanarak, orta hatta karın cildi yukarı çekin ve keskin bir makas ile küçük bir kesi yapmak. </li><li> Abdominal veya torasik kavite delinme kaçınarak kesi başlayarak, hayvanın boynuna deri yukarı kesti. </li><li> &quot;Y şekli&quot; ile sonuçlanan, bacak karşı orta hattan bir kesik, arka bacaklar üzerine deri kesin. </li><li> Fare vücuttan uzakta deri çekin ve aşağı pin, teşhirsalgı derinin alt (Şekil 1B) tutturulmuştur. </li><li> Fare omurganın doğru meme bezi ayırmak için küçük keskin bir makas ile katılgandoku kesim sırasında cildi nazikçe gelen meme bezleri ayırmak için Q-ipuçlarını kullanın. </li><li> Karın bezleri (# 4, 5) Bu protokol için en iyisidir. Ayrıca 2. meme bezi kullanabilirsiniz, ancak bu bezlerin anatomik karışık dokusu kaynaklı hücreler neden ayırmak zor olabilir pektoral kas yakın bulunan aklınızda olabilir. </li><li> Not: Tümör dokusunda diseksiyon, bu nekrotik bölgelerin çıkarılması tavsiye edilir. </li></ul></li><li> Cilt dokusunun Diseksiyonu: epilasyon ile uğraşmak zorunda kalmadan, cilt dokusu elde etmek için en kolay yolu fare kulakları kullanmaktır. Doku büyük miktarda gerekiyorsa, fare gövde saç kapalı tıraş ve cilt teşrih edebilirsiniz. <ul><li> CO 2 kullanarak farelerde Euthanize inhalation. </li><li> Keskin bir makas kullanarak, buz PBS küçük hacimli (~ 0.5 ml) içeren sindirim kavanoza hemen kulakları ve yer hem kesti. </li></ul></li></ol> 2. Meme Bezi / cilt Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması <ul><li> Meme bezlerinin / buz PBS küçük bir hacim içeren sindirim kavanoza cilt yerleştirin. Doku sonra PBS ile kanlı yıkama x2 ise ve aşırı PBS atın. </li><li> Kavisli makas ile iyice kıyın. </li><li> 20 ml kollajenaz çözüm (Not: kollajenaz çözüm bu miktar verimli 15 fareleri kadar gelen meme veya tümör dokusunun ve kulakları yaklaşık 5 g ayrıştırmaları) ekleyin. </li><li> 37 plaka karıştırın üzerine hemen yerleştirin ° 15 dakika C su banyosu, ve inkübe orta hızda karıştırmaya devam. </li></ul> Not: diğer dokuları sindirerek, optimum inkübasyon sürelerinde farklılık gösterebilir. <ul><li> Reaksiyon durdurmak için, 30 ml soğuk DMEM +% 10 FCS ekleyin. </li><li> Stra50 ml&#39;lik bir konik boru üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgecinden doku / medya karışım halinde. </li><li> 4 az 450 x g&#39;de 5 dakika boyunca konik bir tüp Santrifüj ° C. </li></ul> 3. Kırmızı Kan Hücreleri Lizis Not: öldürülmeden önce fareler PBS ile kalp-perfüze olsaydı bu adım gerekli değildir. <ul><li> Hücre peleti bozmadan, vakum bağlı bir cam pipet kullanılarak süpernatan aspire. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10 ml PharmLyse çözelti ve inkübe içinde RBC, tekrar süspansiyon hücre peleti lyse. </li><li> FACS tampon I&#39;in yaklaşık olarak 40 ml ilave edilerek PharmLyse çözelti Nötrleştir </li><li> 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 5 dakika için hücreler ile konik bir tüp döndürme </li><li> Süpernatant aspire. </li></ul> 4. Endojen Fc Engelleme <ul><li> İsteğe bağlı: Aşağıdaki adımlar için uygun hacmini belirlemek için sayım hücreleri. </li><li> Hücreler süspanse1-3 ml FACS tampon I (hücre sayısına bağlı olarak, ve kullanmak istediğiniz antikor miktarı). </li><li> 1:50 seyreltme (10 ug / ml) ulaşır, ve 10-20 &#39;için buz üzerinde inkübe FcBlock (anti-fare CD16/CD32) ekleyin. Hayır FcBlock yıkayın gerekir. </li></ul> 5. Lekelenme <ul><li> Un-lekeli kontrolü ve tek renk denetimleri (kullanılan floresan antikor sayısına göre) olarak kullanılmak üzere Eppendorf tüplere 100 ul hacimde çıkarın. </li><li> Etiket fibroblastlar için: 1:50 seyreltme (10 ug / ml) ile (florofor ile direkt olarak konjuge) anti-PDGFRα ekleyin. </li><li> Diğer hücre popülasyonlarının (örneğin bağışıklık hücreleri, makrofajlar, endotel hücreleri vb) etiketlemek için: 1:50 seyreltme, yüzey belirteçleri için uygun floresan konjuge antikor ekleyin. </li></ul> Not: PDGFRα fibroblastlar için bir işaretleyici güçlü olmasına rağmen, bağışıklık hücreleri için ve ord epitel hücreleri için antikorları içerir tavsiye edilirer herhangi bir çift pozitif nüfus dışlamak ve dolayısıyla izole fibroblastların saflığı geliştirmek için. <ul><li> Tek bir renk kontrol eppendorf tüpleri her birinin her bir antikorun 2 ul ekle. </li><li> Karanlıkta buz üzerinde 1 saat için antikorlar ile hücreler inkübe edin. </li><li> Yıkamak için: FACS tampon I tüpleri doldurmak ve 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 5 dakika daha dönmeye </li><li> Yaklaşık olarak 2 x 10 6 hücre / mL, veya hangisi uygun FACS sıralayıcı ile sıralama için en uygun konsantrasyon arasında bir konsantrasyonu için bir FACS buffer içinde süpernatant, tekrar süspansiyon hücreleri aspire. </li></ul> İsteğe: Hücreler bir sıralama süre için FACS tampon II içinde yeniden süspanse edilebilir. Bu hücre canlılığı artırabilir. Bununla birlikte, serum içinde faktörlere maruz kalma, test edilmiş ve göz önüne alınması gereken bir gen ekspresyonunu etkileyen sahip olabilir. <ul><li> Hücre kümeleri önlemek için tüpleri içine filtre hücreleri: Filtre üst FACS tüpler içine etiketli hücreleri aktarın. </li><li> Ölü hücre dışlamak içins, eklenti 7AAD (0.5 mg / ml) veya örnekleri (un-lekeli kontrolü hariç) Propidium İyodür (PI). </li></ul> Not: hücre kaybını önlemek için, FACS kaydettikten sonra un-lekeli örnek 7AAD/PI eklemek ve 7AAD-tek kontrol yeri olarak tekrar kullanabilirsiniz. <ul><li> Analiz ederken buz örnekleri tutun. </li></ul> 6. FACS tarafından Hücre İzolasyonu (Not: protokol bu bölümü bir FACS sıralayıcı, örn. BD FACS AriaII, ya da bir teknisyen yardımı işletim önceki bilgi gerektirir). <ul><li> FACS sıralayıcı yazılımı (BD FACSDiva) kullanarak ileri saçılım (FSC), yan dağılım (SSC), 7AAD, FITC, PE ve etiket hücreleri (Şekil 2) için kullanılan herhangi bir fluorofor analiz etmek için uygun analiz araziler hazırlar. </li><li> Hücre sıralayıcı her örnek yüklemeden önce, vorteks kısaca hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Veya boyanmamış numune analiz ederek başlayınder hücre artıkları dışarı kapısına, total hücre nüfus için yolluk ayarlamak ve otofloresans veya arka plan boyama belirlemektir. </li><li> Toplam hücre popülasyonunun canlı hücre nüfusu belirlemek ve kapısı unstained örnek + 7AAD analiz edin. </li><li> Tazminat gibi parametrelerin belirlenmesi ve kalibre etmek için her bir renk kontrolü analiz edin. </li><li> Sıralama için kapılarının konumunu tanımlamak için lekeli numune analiz edin. </li><li> Sonra istenilen hücre popülasyonlarının için parametreler ve kapıları set edilmiştir, Eppendorf tüpler veya kültür ortamı veya RNA lizis tamponu (örneğin RLT tampon veya Trizol gibi) içeren 15 ml konik tüpler içine etiketli hücre popülasyonu sıralama başlar. </li></ul> Not: hücreler, çok sayıda ayırma, bu hücreler lizis tamponu ile seyreltik verimi düşer eşlik eden kılıf sıvının büyük bir hacim olarak, RNA lizis tamponu içine direkt olarak sıralamak için tavsiye edilmez. <ul><li> Immediat aşağı Spin hücreleriely sonra sıralama bitmiş ve deneme amacına bağlı olarak taze orta veya RNA lizis tamponu, içine transfer edilir. </li><li> Kültürü izole hücreler için sıralama ise, steril sıralama yapmak. Hücrelerin daha iyi bir iyileşme için, fenol kırmızısı ücretsiz DMEM +% 5 FCS yerine FACS tampon II kullanımı ve% 20 FCS ile kültür ortamında hücreleri toplamak. </li><li> Kültür fibroblastlar kriteri ise, kendi gen ekspresyonu değişiklikleri neden fibroblast aktivasyonunu bu sonuç olarak plastik Kollajen kaplı plakalar üzerinde alwaysplate ve asla doğrudan. </li></ul>

<ol><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li>
<li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.</li>
<li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+mitotic+clock+or+culture+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation%3A+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li>
<li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19(2008).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Doku kültüründe gerçekleştirilen deneyler bilgilendirici ve in vivo olarak kontrol edilebilir fonksiyonel ilkeler önermek mümkün olmakla birlikte, bu kültür içinde 11,12 hücrelerde gen ekspresyonunu büyük değişiklikler meydana geldiği bilinmektedir. Fibroblastlar gen ekspresyonu sırasında bir doku kültürü adım önlemek için amacıyla, sağlar taze fare veya insan dokusu normal hem de kanser-kaynaklı fibroblastlann izole edilmesi. Bir protokol gelişmiş Bu protokol başarıyla fare ve insan 9 der...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktif&gt; İsim</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar (isteğe bağlı)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41.965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Biyolojik Sanayi</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajenaz II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajenaz IV</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoksiribonükleaz</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555.899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hücre süzgeç 70 mikron</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Saflaştırılmış anti-fare CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553.142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Via prob (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-fare CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-fare F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o Fenol Kırmızısı</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajen Tip I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354.236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

floresans aktif hücre ayırma (facs) taze dokular normal ve kanser ilişkili fibroblastlar İzolasyonu

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Kanser ile bağlantılı fibroblast (cafs) özellikle göğüs kanseri olmak üzere birçok kanser tümör stroma içinde en önemli hücre türüdürler ve bunların belirgin durum çoğu zaman zayıf prognoz 1,2 ile ilişkilidir. Cafs stromal fibroblastlann bir aktive alt gruptaki olup, bunların çoğu bu myo işaretleyici α-SMA 3 ifade eder. Cafs lokal doku fibroblast yanı sıra kemik iliği kökenli hücrelerin gelişen tümör içine alınmış ve tümör mikro 4 etkisi altında CAF fenotip kabul kaynaklanır. Cafs tümör hücre proliferasyonu, anjiyogenez ve işgali 5-8 teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyümesi ve ilerlemesi kolaylaştırmak için gösterildi. Bu cafs erken ön-neoplastik aşamaları 9 başlayarak, tümör terfili iltihap aracılık ederek tümör büyümesini artırmak olduğunu göstermiştir. Anahtar rol cafs rağmen artan kanıtlar, tümör büyümesini kolaylaştırmada oynamakokuyan cafs tümör mikro 10 co-mevcut pek çok alt tipi ile CAF-spesifik belirteçler ve bu hücrelerin büyük heterojenliğin eksikliği nedeniyle devam eden bir meydan olmuştur. Üstelik, in vitro olarak fibroblastlar okuyan bunların gen ekspresyonu profiline sıkça doku kültürü 11,12 değiştirildiği gerçeği ile engellenmektedir. Bu sorunu çözmek için ve taze fare ve insan dokularından fibroblastların tarafsız gen ekspresyon profili izin, biz Floresans-Aktif Hücre Ayırma (FACS) 13,14 için daha önceki protokollere dayalı bir yöntem geliştirdi. Bizim yaklaşımımız taze fare ve insan dokusundan fibroblastlar yalıtmak için bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak dayanır. PDGFRα bol, normal fibroblastlar ve cafs 9,15 ikisi tarafından ifade edilir. Bu yöntem de dahil olmak üzere, normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının, izolasyonu ancak α-SMA sınırlı sağlar + miyofibroblastlar aktif. İzole fibroblastlar sonra olabilirkarakterizasyonu ve tümörogenez boyunca cafs meydana gen ifadesinin evrim karşılaştırma için kullanılır. Nitekim, biz ve diğerleri 16 sıralama hücre izole fibroblastların ekspresyon profili bildirdi. Bu protokol başarıyla deri, meme, pankreas ve akciğer dokularından fibroblastların zenginleştirilmiş popülasyonları ayırmak ve profil yapıldı. Bunun yanı sıra, yöntem, aynı zamanda işlevsel deneyler için ve kültür cafs çalışırken sık sık büyük bir engel teşkil tümör hücreleri ile kirlenmesini önlemek üzere, sıralı hücrelerin kültürlenmesi izin verir.

Doku fibroblast zenginleştirilmiş popülasyonlarının izolasyonu fibroblastlar sonuçları için bir belirteç olarak PDGFRα kullanma. Sıralama sonrasında saflık düzeyi gibi post-tür analizi (Şekil 2A) ile ölçülebilir,% 99 idi. Hücre özel kontrol genlerinin göreceli ifadesi (Şekil 2B) ile non-fibroblast hücreleri kirletici yüzdesi tahmin edilmesi tipik olarak% 0.1-0.6 kirlenme göstermektedir. Saflık Bu düzeyde izole fibroblastlar 9 yüksek kalitede transcriptome profilleme sağlar. <...

Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), birçok kanserin, özellikle de meme karsinomunun tümör stromasındaki en belirgin hücre tipidir ve bunların...

Bu prosedürün amacı, taze dokulardan normal ve kanserle ilişkili fibroblastları izole etmektir. Bu işlem, öncelikle meme bezlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, meme bezleri hazırlanarak tek hücre süspansiyonları oluşturulur; ardından bu hücreler, fibroblastlara özgü antikorların yanı sıra diğer hücre popülasyonlarına özgü antikorlarla desteklenir.Son adım, floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS işlemini gerçekleştirmektir. Nihayetinde, ayıklanan hücre popülasyonlarının saflığını değerlendirmek için bu popülasyonlarda eksprese edilen spesifik markerların Q-R-T-P-C-R ekspresyon profillemesi kullanılır. Bu tekniğin fibroblast izolasyonu için mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fibroblastların gen ekspresyon profilini değiştirebilecek bir doku kültürü adımından kaçınırken, doku fibroblastlarının çoğunluğunun immün hücreler veya epitel hücreler tarafından minimum kontaminasyonla izole edilmesine olanak tanımasıdır.Bu tekniğin etkileri tüm meme kanseri tedavilerine uzanmaktadır; çünkü moleküler hedeflerin anlaşılması ve tanımlanması, meme kanseri ilerlemesiyle mücadele etmek, hasta sağkalımını uzatmak ve nihayetinde bireyselleştirilmiş terapötik seçeneklerin iyileştirilmesine ve uyarlanmasına yardımcı olmak için yeni bir kombinatoryal yaklaşım sağlayabilir. Laboratuvar yöneticisi Dr. Lena, prosedürü tek başına uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için ötanazi uygulanmış dişi fareyi strafor bir yüzeye sırtüstü yerleştirin ve dört uzvunu da sıkıca sabitlemek için 25 gauge iğneler kullanın.Pens kullanarak fareye bolca %70 etanol püskürtün. Karın derisini orta hat üzerinden yukarı kaldırın ve kesi yerinden başlayarak keskin bir makasla küçük bir insizyon yapın. Abdominal ve torasik boşlukları delmemeye dikkat ederek, deriyi hayvanın boynuna kadar kesin.Arka bacaklardaki deriyi, orta hat kesisinden bacağa doğru keserek Y şeklinde bir form oluşturun. Ardından, deriyi fare gövdesinden uzaklaştırın ve derinin alt kısmına yapışık olan meme bezlerini açığa çıkaracak şekilde iğneleyin. Bu prosedürdeki en sorunlu noktalardan biri, kas dokusunu almayan kaçınmaktır.Bu sorunu önlemek için, kas dokusuna yakın konumda bulunan ikinci meme bezi yerine sadece dördüncü ve beşinci meme bezlerini alacağım. Meme bezini deriden nazikçe ayırmak için kulak çubukları kullanın ve meme bezini farenin omurgasına doğru ayırmak için konnektif dokuyu küçük keskin bir makasla kesin; bulunan tüm nekrotik bölgeleri temizleyin. Diseke edilen meme bezlerini buz üzerinde PBS içerisine yerleştirin.Tüy temizleme işlemiyle uğraşmadan deri dokusu elde etmenin en kolay yolu fare kulaklarını kullanmaktır. Ötanazi uygulanmış fareden her iki kulağı da kesmek için keskin bir makas kullanın. Kulakları derhal, içinde az miktarda PBS bulunan ve buz üzerinde bekletilen bir sindirim kavanozuna yerleştirin.Meme bezi tek hücre süspansiyonu hazırlamak için, buz üzerinde ve küçük bir hacimde PBS içeren bir sindirim kavanozunda kavisli makaslar kullanarak meme bezlerini iyice ince parçalara ayırın ve parçalanmış dokuya 20 mililitre kollagenaz çözeltisi ekleyin. Bu miktar kollagenaz çözeltisi, 15 fareye kadar olan yaklaşık beş gram meme veya tümör dokusunu ve kulakları verimli bir şekilde ayrıştıracaktır. Hemen 37 °C su banyosundaki bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve orta hızda karıştırarak 15 dakika inkübe edin; ardından reaksiyonu durdurmak için 30 mililitre soğuk DMEM artı %10 FCS ekleyin.Ardından, doku ve besiyeri karışımını 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Konik tüpü dört santigrat derecede, 450 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüj edin. Eğer fareler sakrifikasyondan önce PBS ile kalp perfüzyonuna tabi tutulmadıysa, immün boyama öncesinde örnekteki eritrositlerin lizize edilmesi gerekecektir.Fibroblastlar ve diğer hücre popülasyonları işaretlenmeden önce, hücreler endojen FC için bloke edilmelidir. Hücreleri bir ila üç mililitre fax buffer one içerisinde resuspend edin ve ardından 1:50 dilüsyonda FC block ekleyerek buz üzerinde 10 ila 20 dakika inkübe edin. FC block'u yıkamaya gerek yoktur; boyanmamış kontrol ve tek renkli kontroller olarak kullanılacak olan eend orph tüplerine 100 mikrolitre hücre alikotları aktarın.Bu gösterimde kullanılan floresan antikorların sayısına bağlı olarak, fibroblastları anti PDGF reseptör alfa üzerinden işaretlemek için iki floresan antikor kullanılacaktır. Bunlar, sıralama örneği ve diğer hücre popülasyonlarını işaretlemek için kullanılan tek renkli kontrollere 1:50 seyreltmede doğrudan bir florokroma konjuge edilmiş halde eklenir. Yüzey belirteçlerine yönelik uygun floresan konjuge antikorları da aynı şekilde 1:50 seyreltmede ekleyin.Çift pozitif popülasyonları dışlamak ve böylece izole edilen fibroblastların saflığını artırmak amacıyla, immün hücreler ve epitel hücreler için antikorlar da dahil olmak üzere uygun tek renk kontrol tüplerine antikor eklenmesi önerilir. Ardından, hücreleri antikorlarla buz üzerinde, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra tüpleri fax buffer one ile doldurup 4°C'de 450 ×g hızında beş dakika santrifüj ederek hücreleri yıkayın. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri, kullanılacak fax sorter ile ayıklama için en uygun konsantrasyona gelecek şekilde fax buffer one içinde resüspande edin. Etiketlenmiş hücreleri filtre kapaklı fax tüplerine aktarın ve hücre kümelerini önlemek ve ölü hücreleri dışlamak için hücreleri tüplere filtreleyin.Boyanmamış kontrol hariç tüm örneklere DPI uygulayın. FACS analizi sırasında örnekleri buz üzerinde tutun. Bu prosedüre başlamak için, floresan ayarlarını, toplama ayarlarını ve hidrodinamik damla ayarlarını hazırlamak amacıyla FACS ayıklayıcı yazılımını kullanın.Hücre ayırıcıya yüklemeden önce, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için her örneği kısa süreliğine vorteksleyin. Hücre kalıntılarını dışlamak amacıyla toplam hücre popülasyonu için kapılama (gating) ayarlarını yapmak ve otofloresans veya arka plan boyanmasını belirlemek için boyanmamış örneğin analiziyle başlayın. Ardından, toplam hücre popülasyonu içerisinden canlı hücre popülasyonunu belirlemek ve kapılamak için boyanmamış örnek artı DPI'yı analiz edin.Kompansasyon gibi parametreleri belirlemek ve kalibre etmek için her bir tek renk kontrolünü analiz edin. Sıralama için kapıların (gate) konumlarını tanımlamak amacıyla boyanmış örneği analiz edin. İstenen hücre popülasyonları için parametreler ve kapılar ayarlandığında, etiketli hücre popülasyonlarını kültür ortamı veya RNA lizis tamponu içeren eph tüplerine veya 15 mililitre konik tüplere sıralamaya başlayın.Sıralama işlemi biter bitmez, hücreleri santrifüjle çöktürün ve taze besiyerine veya RNA lizis tamponuna aktarın. Deneyinizin amacına bağlı olarak, sıralanan fibroblastlar kültüre edilecekse, her zaman kollajen kaplı plaklara ekim yapın ve asla doğrudan plastiğe ekim yapmayın; çünkü bu durum fibroblastların aktivasyonuna yol açarak gen ekspresyonlarında değişikliklere neden olacaktır. Fibroblastlar için belirteç olarak PDGF reseptör alfa kullanımı, doku fibroblastlarından oluşan oldukça zenginleştirilmiş popülasyonların izole edilmesiyle sonuçlanır.Bu örnekte, fare meme bezi tek hücre süspansiyonları PDGF reseptör alfa ve F dört 80 antikorları ile boyanmıştır. FACS ayıklama grafiği sol panelde gösterilmektedir; burada P iki fibroblastlar kapısı, P dört ise makrofajlar kapısıdır. Ayıklanan fibroblastların saflığını belirlemek için sağ panelde ve makrofajların saflığını belirlemek için orta panelde gösterilen bir ayıklama sonrası analiz gerçekleştirilmiştir.Bir sonraki şekil, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve epitelyal hücreler için hücreye özgü kontrol genlerin Q-R-T-P-C-R ile kaynak saflığı analizini göstermektedir. Sonuçlar, iki housekeeping gen olan ga, DH ve mgus'a göre normalize edilmiş ve gap'e göre göreceli ekspresyon gösterilmiştir. DH'nin gösterildiği bu analizler tipik olarak %0,1 ile %0,6 arasında kontaminasyon sergilemektedir.Bu saflık düzeyi, izole edilen fibroblastların yüksek kaliteli transkriptom profillemesinin yapılmasına olanak tanır. Ayıklanmamış bir meme fibroblastı popülasyonundaki PDGF reseptörü alfa ekspresyonunun kantifikasyonu, meme bezlerindeki toplam doku fibroblastlarının yaklaşık %85'inin PDGF reseptörü alfa pozitif olduğunu göstermektedir. İzole ettim.Fibroblastlar saflaştırma işleminden hemen sonra kültüre edilebilir, ancak toparlanmaları için birkaç güne ihtiyaç duyabilirler. Primer fibroblastlar çoğaltılma sırasında senesense (yaşlanma) sürecine girdikleri için, sonraki tüm deneylerin düşük pasajlı hücrelerle gerçekleştirilmesi esastır. Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde kültür ortamında dört saat içinde tamamlanabilir.Eğer ayrıştırılan hücrelerin kültürü yapılacaksa, tüm prosedürün steril koşullar altında gerçekleştirilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Bu çekimde steril bir ayıklama yapmadık. Bu videoyu izledikten sonra, taze dokudan yüksek derecede zenginleştirilmiş fibroblast popülasyonunun nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Burada, MF fenotipine sahip donmuş mide, ince bağırsak ve kolon dokusu oluşum hücrelerinden primer fibroblast/miyofibroblast (MF) kültürlerinin izole edilmesi ve oluşturulması için bir protokol sunulmaktadır. Bu hücreler CD90, α-SMA ve vimentin eksprese eder. MF'ler, enzimatik aktivite ve sitokin üretimi dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler için kullanılabilir.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bu makale, üçlü negatif meme kanserinin singeneik bir murine modelinden primer kanser ilişkili fibroblastların izolasyonu ve kültürü ve tümör mikroçevrimini hedeflemek için tasarlanmış yeni nanopartiküllerin preklinik çalışması için uygulanması için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır.

Hedeflenen Nanopartiküllerin Çalışması için Meme Kanserinin Singeneik Murine Modelinden Primer Kanserle İlişkili Fibroblastların İzolasyonu

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Çok hücreli 3D tümör sferoidleri, akciğer adenokarsinom hücreleri, fibroblastlar ve monositler ile hazırlandı ve bunu kanserle ilişkili fibroblastların (CAF'lar) bu sferoidlerden izole edilmesi izledi. İzole CAF'lar, mitokondriyal transmembran potansiyelini, reaktif oksijen türlerini ve enzimatik aktiviteleri inceleyerek mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için normal fibroblastlarla karşılaştırıldı.

3D Çok Hücreli Akciğer Tümörü Sferoidlerinden İzole Edilen Kanserle İlişkili Fibroblastlarda Mitokondriyal Sağlığın Değerlendirilmesi

Bu protokol, radikal prostatektomilerden fibroblastları izole etmek, genişletmek ve ölümsüzleştirmek için kapsamlı bir prosedür sağlar. Ayrıca, fibroblast-tümör hücresi karışmasının fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için geliştirilen, hem şartlandırılmış ortamla tedaviden hem de birlikte kültürlemeden yararlanan tahlilleri açıklar.

Prostat Kanseri ile İlişkili Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Öğrenin, taze dokulardan normal ve kanser ilişkili fibroblastları FACS ile izole etme yöntemini. PDGFRα kullanılarak yüksek saflıkta hücre popülasyonları elde edilir ve gen ekspresyon profili korunur.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Daha fazla video keşfet