Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Bu işlemin amacı normal ve kanserle ilişkili fibroblastları taze dokulardan izole etmektir. Bu, önce meme bezlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, meme bezlerini, tek hücreli süspansiyonları, fibroblastlara özgü antikorlarla sürdürülen bir sonraki hücreyi ve diğer hücre popülasyonlarına özgü antikorları hazırlamaktır.

Son adım, floresanla aktive edilmiş hücre tedariki veya gerçekleri gerçekleştirmektir. Sonuç olarak, sıralanmış hücre popülasyonlarında ifade edilen spesifik belirteçlerin Q-R-T-P-C-R ekspresyon profili, sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığını değerlendirmek için kullanılır. Bu tekniğin fibroblast izolasyonu için mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, fibroblastların çoğunun immün hücreler veya epitel hücreleri tarafından minimum kontaminasyon ile izole edilmesine izin verirken, fibroblastların gen ekspresyon profilini değiştirebilecek bir doku kültürü adımından kaçınmasıdır.

Bu tekniğin anlamı tüm meme kanseri tedavisini kapsar, çünkü moleküler hedeflerin anlaşılması ve tanımlanması, meme kanserinin ilerlemesiyle mücadele etmek, hasta sağkalımını uzatmak ve nihayetinde kişiselleştirilmiş terapötik seçeneklerin iyileştirilmesine ve uyarlanmasına yardımcı olmak için yeni bir Birleştirici yaklaşım sağlayabilir. Gözünüze ek olarak, Dr.Lena tek başına, laboratuvar yöneticisi bu işleme başlamak için prosedürü gösterecek. Ötenazi uygulanmış dişi fareyi strafor bir yüzeye sırt üstü yerleştirin ve dört uzvu da sıkıca sabitlemek için 25 gauge iğne kullanın.

Forseps kullanarak fareye cömertçe %70 etanol püskürtün. Karın derisini orta hattan yukarı çekin ve kesiden başlayarak keskin bir makasla küçük bir kesi yapın. Abdominal torasik boşlukları delmekten kaçınırken cildi hayvanın boynuna kadar kesin.

Arka bacaklardaki cildi orta hat kesisinden bacağa doğru kesin ve Y şekli elde edin. Ardından, cildi fare gövdesinden uzaklaştırın ve cildin alt tarafına bağlı meme bezlerini açığa çıkaracak şekilde aşağı doğru sabitleyin. Bu işlemde en sorunlu şeylerden biri kas dokusu almaktan kaçınmaktır.

Bu sorunu önlemek için, kas dokusuna yakın olan ikincisini değil, sadece dördüncü ve beşinci meme bezini alacağım. Hafıza bezini farenin omurgasına doğru ayırmak için küçük keskin makasla konjonktiv dokuyu keserken hafıza bezini ciltten nazikçe ayırmak için Q-ipuçlarını kullanın, bulunan nekrotik bölgeleri çıkarın. Diseke edilmiş hafıza bezlerini PBS'ye buz üzerine yerleştirin.

Epilasyon ile uğraşmak zorunda kalmadan cilt dokusu elde etmenin en kolay yolu fare kulakları kullanmaktır. Ötenazi uygulanmış farenin her iki kulağını da kesmek için keskin bir makas kullanın. Kulakları hemen buz üzerinde küçük bir hacimde PBS içeren bir sindirim kavanozuna yerleştirin.

Bir meme bezi tek hücreli süspansiyonu hazırlamak için, buz üzerinde küçük bir hacim PBS içeren bir sindirim kavanozunda meme bezlerini iyice kıymak için kavisli makas kullanın, kıyma dokusuna 20 mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Bu miktardaki kollajenaz çözeltisi, yaklaşık beş gram hafıza veya tümör dokusunu ve kulakları 15 fareye kadar etkili bir şekilde ayıracaktır. Hemen 37 santigrat derece su banyosunda bir karıştırma plakasına yerleştirin ve reaksiyonu 30 mililitre soğuk DMEM ve% 10 FCS'de durdurmak için orta hızda karıştırarak 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, doku ve ortam karışımını 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Konik tüpü dört santigrat derecede 450 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Fareler kurban edilmeden önce PBS ile kalp perfüze edilmediyse, numunedeki kırmızı kan hücrelerinin bağışıklık lekelenmesinden önce yalan söylemesi gerekecektir.

Fibroblastları ve diğer hücre popülasyonlarını etiketlemeden önce hücreler endojen FC için bloke edilmelidir. Hücreleri bir ila üç mililitre faks tamponunda yeniden askıya alın ve ardından bir ila 50 seyreltme ile FC bloğu ekleyin, buz üzerinde 10 ila 20 dakika inkübe edin. FC blok transferinin 100 mikrolitrelik hücre alikotlarını lekesiz kontrol ve tek renk kontrolleri olarak kullanılacak orph tüplerine yıkamaya gerek yoktur.

Bu gösteride kullanılan floresan antikorların sayısına bağlı olarak, anti PDGF reseptör alfa'daki fibroblastları etiketlemek için iki floresan antikor kullanılacaktır. Bu, sıralama örneğine bir ila 50 arasında bir seyreltmede doğrudan bir Flor'a ve ayrıca diğer hücre popülasyonlarını etiketlemek için tek renk kontrollerine konjuge edilir. Uygun floresan konjuge antikorları yüzey belirteçlerine de bir ila 50 seyreltmede ekleyin.

Herhangi bir çift pozitif popülasyonu dışlamak ve böylece izole fibroblastların saflığını arttırmak için bağışıklık hücreleri ve epitel hücreleri için antikorlar da dahil olmak üzere uygun tek renk kontrol tüplerine antikorların eklenmesi önerilir. Daha sonra, antikorlarla hücreleri karanlıkta buz üzerinde bir saat inkübe edin, bir saat sonra tüpleri faks tamponu ile doldurarak ve dört santigrat derecede 450 kez G'de beş dakika döndürerek hücreleri yıkayın, ABD aspirat sat ve resus bükme hücreleri faks tamponu bir, kullanılacak faks sıralayıcı ile sıralama için en uygun konsantrasyona. Etiketli hücreleri filtre üstleri olan faks tüplerine aktarın ve hücre kümelerini, ölü hücreleri dışlamak için topakları önlemek için hücreleri tüplere filtreleyin.

Lekesiz kontrol dışındaki tüm numuneler için bir DPI. Faks analizi sırasında numuneleri buz üzerinde tutun. Bu prosedüre başlamak için, floresan ayarını, alım ayarını ve hidrodinamik damla ayarını hazırlamak için bilgi sıralayıcı yazılımını kullanın.

Hücre sıralayıcıya yüklemeden önce hücreleri yeniden askıya almak için her bir örneği kısaca vorteksleyin. Hücre kalıntılarını dışarı atmak ve otofloresan veya arka plan lekelenmesini belirlemek için toplam hücre popülasyonu için kapıyı ayarlamak için boyanmamış numuneyi analiz ederek başlayın. Ardından, toplam hücre popülasyonundan canlı hücre popülasyonunu belirlemek ve geçit yapmak için boyanmamış numuneyi ve DPI'yi analiz edin.

Telafi gibi parametreleri belirlemek ve kalibre etmek için her bir renk kontrolünü analiz edin. Sıralama için kapıların konumunu tanımlamak için leke örneğini analiz edin. İstenen hücre popülasyonları için parametreler ve kapılar ayarlandıktan sonra, etiketli hücre popülasyonlarını eph tüplerine veya kültür ortamı veya RNA lizis tamponu içeren 15 mililitrelik konik tüplere ayırmaya başlayın.

Sıralama bittikten hemen sonra, hücreleri döndürün ve taze ortama veya RNA lizis tamponuna aktarın. Deneyinizin amacına bağlı olarak, eğer sıralanırsa, fibroblastlar kültürlenecekse, her zaman kollajen kaplı plakalar üzerine plaka asla doğrudan plastik üzerine plaka koymayın, çünkü bu, fibroblastların gen ekspresyonlarında değişikliklere yol açan aktivasyonu ile sonuçlanacaktır. PDGF reseptör alfa'nın fibroblastlar için bir belirteç olarak kullanılması, izolasyon, yüksek oranda zenginleştirilmiş doku fibroblast popülasyonları ile sonuçlanır.

Bu örnekte, fare meme bezlerinin tek hücreli süspansiyonları PDGF reseptörü alfa ve F dört 80 antikoru ile boyandı. Gerçek sıralama grafiği, P ikisinin fibroblast kapısı ve P dördünün makrofaj kapısı olduğu sol panelde gösterilmiştir. Sağ panelde gösterilen sıralanmış fibroblastların ve orta panelde gösterilen makrofajların saflığını belirlemek için bir kaynak sonrası analiz yapıldı.

Bu sonraki şekil, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve epitel hücreleri için hücreye özgü kontrol genlerinin Q-R-T-P-C-R ile elde edilen saflığın bir analizini göstermektedir. Sonuçlar, ga, DH ve mgus olmak üzere iki temizlik genine ve boşluğa göreceli ekspresyona normalize edildi. DH, bu tür analizlerin tipik olarak% 0.1 ila 0.6 kontaminasyon gösterdiği gösterilmiştir.

Bu saflık seviyesi, izole fibroblastların yüksek kalitede transkriptom profillemesine izin verir. Sınıflandırılmamış bir meme fibroblast popülasyonunda PDGF reseptör alfa ekspresyonunun ölçülmesi, meme bezlerindeki toplam doku fibroblastlarının yaklaşık% 85'inin PDGF reseptörü alfa pozitif olduğunu göstermektedir. İzole oldum.

Fibroblastlar tasnif edildikten hemen sonra kültürlenebilir, ancak iyileşmesi birkaç gün sürebilir. Primer fibroblastlar yayılma sırasında yaşlanmaya uğradığından, diğer tüm deneylerin düşük masaj hücreleri ile yapılması önemlidir. Kültürde, bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Üçüncü hücreler kültürlenmek üzere belirlenmişse, tüm prosedürü steril koşullar altında gerçekleştirmeyi hatırlamak için içe aktarılır. Bu çekimde steril bir sıralama yapmadık. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek oranda zenginleştirilmiş fibroblast popülasyonunun taze dokudan nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.