Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Bu prosedürün amacı, taze dokulardan normal ve kanserle ilişkili fibroblastları izole etmektir. Bu işlem, öncelikle meme bezlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, meme bezleri hazırlanarak tek hücre süspansiyonları oluşturulur; ardından bu hücreler, fibroblastlara özgü antikorların yanı sıra diğer hücre popülasyonlarına özgü antikorlarla desteklenir.

Son adım, floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS işlemini gerçekleştirmektir. Nihayetinde, ayıklanan hücre popülasyonlarının saflığını değerlendirmek için bu popülasyonlarda eksprese edilen spesifik markerların Q-R-T-P-C-R ekspresyon profillemesi kullanılır. Bu tekniğin fibroblast izolasyonu için mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fibroblastların gen ekspresyon profilini değiştirebilecek bir doku kültürü adımından kaçınırken, doku fibroblastlarının çoğunluğunun immün hücreler veya epitel hücreler tarafından minimum kontaminasyonla izole edilmesine olanak tanımasıdır.

Bu tekniğin etkileri tüm meme kanseri tedavilerine uzanmaktadır; çünkü moleküler hedeflerin anlaşılması ve tanımlanması, meme kanseri ilerlemesiyle mücadele etmek, hasta sağkalımını uzatmak ve nihayetinde bireyselleştirilmiş terapötik seçeneklerin iyileştirilmesine ve uyarlanmasına yardımcı olmak için yeni bir kombinatoryal yaklaşım sağlayabilir. Laboratuvar yöneticisi Dr. Lena, prosedürü tek başına uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için ötanazi uygulanmış dişi fareyi strafor bir yüzeye sırtüstü yerleştirin ve dört uzvunu da sıkıca sabitlemek için 25 gauge iğneler kullanın.

Pens kullanarak fareye bolca %70 etanol püskürtün. Karın derisini orta hat üzerinden yukarı kaldırın ve kesi yerinden başlayarak keskin bir makasla küçük bir insizyon yapın. Abdominal ve torasik boşlukları delmemeye dikkat ederek, deriyi hayvanın boynuna kadar kesin.

Arka bacaklardaki deriyi, orta hat kesisinden bacağa doğru keserek Y şeklinde bir form oluşturun. Ardından, deriyi fare gövdesinden uzaklaştırın ve derinin alt kısmına yapışık olan meme bezlerini açığa çıkaracak şekilde iğneleyin. Bu prosedürdeki en sorunlu noktalardan biri, kas dokusunu almayan kaçınmaktır.

Bu sorunu önlemek için, kas dokusuna yakın konumda bulunan ikinci meme bezi yerine sadece dördüncü ve beşinci meme bezlerini alacağım. Meme bezini deriden nazikçe ayırmak için kulak çubukları kullanın ve meme bezini farenin omurgasına doğru ayırmak için konnektif dokuyu küçük keskin bir makasla kesin; bulunan tüm nekrotik bölgeleri temizleyin. Diseke edilen meme bezlerini buz üzerinde PBS içerisine yerleştirin.

Tüy temizleme işlemiyle uğraşmadan deri dokusu elde etmenin en kolay yolu fare kulaklarını kullanmaktır. Ötanazi uygulanmış fareden her iki kulağı da kesmek için keskin bir makas kullanın. Kulakları derhal, içinde az miktarda PBS bulunan ve buz üzerinde bekletilen bir sindirim kavanozuna yerleştirin.

Meme bezi tek hücre süspansiyonu hazırlamak için, buz üzerinde ve küçük bir hacimde PBS içeren bir sindirim kavanozunda kavisli makaslar kullanarak meme bezlerini iyice ince parçalara ayırın ve parçalanmış dokuya 20 mililitre kollagenaz çözeltisi ekleyin. Bu miktar kollagenaz çözeltisi, 15 fareye kadar olan yaklaşık beş gram meme veya tümör dokusunu ve kulakları verimli bir şekilde ayrıştıracaktır. Hemen 37 °C su banyosundaki bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve orta hızda karıştırarak 15 dakika inkübe edin; ardından reaksiyonu durdurmak için 30 mililitre soğuk DMEM artı %10 FCS ekleyin.

Ardından, doku ve besiyeri karışımını 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Konik tüpü dört santigrat derecede, 450 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüj edin. Eğer fareler sakrifikasyondan önce PBS ile kalp perfüzyonuna tabi tutulmadıysa, immün boyama öncesinde örnekteki eritrositlerin lizize edilmesi gerekecektir.

Fibroblastlar ve diğer hücre popülasyonları işaretlenmeden önce, hücreler endojen FC için bloke edilmelidir. Hücreleri bir ila üç mililitre fax buffer one içerisinde resuspend edin ve ardından 1:50 dilüsyonda FC block ekleyerek buz üzerinde 10 ila 20 dakika inkübe edin. FC block'u yıkamaya gerek yoktur; boyanmamış kontrol ve tek renkli kontroller olarak kullanılacak olan eend orph tüplerine 100 mikrolitre hücre alikotları aktarın.

Bu gösterimde kullanılan floresan antikorların sayısına bağlı olarak, fibroblastları anti PDGF reseptör alfa üzerinden işaretlemek için iki floresan antikor kullanılacaktır. Bunlar, sıralama örneği ve diğer hücre popülasyonlarını işaretlemek için kullanılan tek renkli kontrollere 1:50 seyreltmede doğrudan bir florokroma konjuge edilmiş halde eklenir. Yüzey belirteçlerine yönelik uygun floresan konjuge antikorları da aynı şekilde 1:50 seyreltmede ekleyin.

Çift pozitif popülasyonları dışlamak ve böylece izole edilen fibroblastların saflığını artırmak amacıyla, immün hücreler ve epitel hücreler için antikorlar da dahil olmak üzere uygun tek renk kontrol tüplerine antikor eklenmesi önerilir. Ardından, hücreleri antikorlarla buz üzerinde, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra tüpleri fax buffer one ile doldurup 4°C'de 450 ×g hızında beş dakika santrifüj ederek hücreleri yıkayın. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri, kullanılacak fax sorter ile ayıklama için en uygun konsantrasyona gelecek şekilde fax buffer one içinde resüspande edin. Etiketlenmiş hücreleri filtre kapaklı fax tüplerine aktarın ve hücre kümelerini önlemek ve ölü hücreleri dışlamak için hücreleri tüplere filtreleyin.

Boyanmamış kontrol hariç tüm örneklere DPI uygulayın. FACS analizi sırasında örnekleri buz üzerinde tutun. Bu prosedüre başlamak için, floresan ayarlarını, toplama ayarlarını ve hidrodinamik damla ayarlarını hazırlamak amacıyla FACS ayıklayıcı yazılımını kullanın.

Hücre ayırıcıya yüklemeden önce, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için her örneği kısa süreliğine vorteksleyin. Hücre kalıntılarını dışlamak amacıyla toplam hücre popülasyonu için kapılama (gating) ayarlarını yapmak ve otofloresans veya arka plan boyanmasını belirlemek için boyanmamış örneğin analiziyle başlayın. Ardından, toplam hücre popülasyonu içerisinden canlı hücre popülasyonunu belirlemek ve kapılamak için boyanmamış örnek artı DPI'yı analiz edin.

Kompansasyon gibi parametreleri belirlemek ve kalibre etmek için her bir tek renk kontrolünü analiz edin. Sıralama için kapıların (gate) konumlarını tanımlamak amacıyla boyanmış örneği analiz edin. İstenen hücre popülasyonları için parametreler ve kapılar ayarlandığında, etiketli hücre popülasyonlarını kültür ortamı veya RNA lizis tamponu içeren eph tüplerine veya 15 mililitre konik tüplere sıralamaya başlayın.

Sıralama işlemi biter bitmez, hücreleri santrifüjle çöktürün ve taze besiyerine veya RNA lizis tamponuna aktarın. Deneyinizin amacına bağlı olarak, sıralanan fibroblastlar kültüre edilecekse, her zaman kollajen kaplı plaklara ekim yapın ve asla doğrudan plastiğe ekim yapmayın; çünkü bu durum fibroblastların aktivasyonuna yol açarak gen ekspresyonlarında değişikliklere neden olacaktır. Fibroblastlar için belirteç olarak PDGF reseptör alfa kullanımı, doku fibroblastlarından oluşan oldukça zenginleştirilmiş popülasyonların izole edilmesiyle sonuçlanır.

Bu örnekte, fare meme bezi tek hücre süspansiyonları PDGF reseptör alfa ve F dört 80 antikorları ile boyanmıştır. FACS ayıklama grafiği sol panelde gösterilmektedir; burada P iki fibroblastlar kapısı, P dört ise makrofajlar kapısıdır. Ayıklanan fibroblastların saflığını belirlemek için sağ panelde ve makrofajların saflığını belirlemek için orta panelde gösterilen bir ayıklama sonrası analiz gerçekleştirilmiştir.

Bir sonraki şekil, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve epitelyal hücreler için hücreye özgü kontrol genlerin Q-R-T-P-C-R ile kaynak saflığı analizini göstermektedir. Sonuçlar, iki housekeeping gen olan ga, DH ve mgus'a göre normalize edilmiş ve gap'e göre göreceli ekspresyon gösterilmiştir. DH'nin gösterildiği bu analizler tipik olarak %0,1 ile %0,6 arasında kontaminasyon sergilemektedir.

Bu saflık düzeyi, izole edilen fibroblastların yüksek kaliteli transkriptom profillemesinin yapılmasına olanak tanır. Ayıklanmamış bir meme fibroblastı popülasyonundaki PDGF reseptörü alfa ekspresyonunun kantifikasyonu, meme bezlerindeki toplam doku fibroblastlarının yaklaşık %85'inin PDGF reseptörü alfa pozitif olduğunu göstermektedir. İzole ettim.

Fibroblastlar saflaştırma işleminden hemen sonra kültüre edilebilir, ancak toparlanmaları için birkaç güne ihtiyaç duyabilirler. Primer fibroblastlar çoğaltılma sırasında senesense (yaşlanma) sürecine girdikleri için, sonraki tüm deneylerin düşük pasajlı hücrelerle gerçekleştirilmesi esastır. Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde kültür ortamında dört saat içinde tamamlanabilir.

Eğer ayrıştırılan hücrelerin kültürü yapılacaksa, tüm prosedürün steril koşullar altında gerçekleştirilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Bu çekimde steril bir ayıklama yapmadık. Bu videoyu izledikten sonra, taze dokudan yüksek derecede zenginleştirilmiş fibroblast popülasyonunun nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.