Name: Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Öğrenin, FRET tabanlı tek adımlı bir analiz yöntemiyle SENP1 proteaz kinetiğini kantitatif olarak belirlemeyi. Bu yöntem pre-SUMO1 substratının hidrolizini gerçek zamanlı izleyerek Km ve kcat parametrelerini hassas şekilde ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz değerli tavsiyeler için Victor GJ Rodgers için çok müteşekkiriz. Biz çok yakın ortak çalışma ve bu çalışma ile yardım için Liao grubun tüm üyeleri teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JL Grant AI076504) tarafından desteklenmiştir.

1. Plazmid Oluşumlar <ol><li> PCR ile genlerin açık okuma çerçeveleri Kuvvetlendirme ve PCRII TOPO-vektörüne klonlanması PCR ürünlerinin. </li><li> Dizilenerek teyit ürünleri, ve klon kodlayan cDNA CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ve bir N-terminal hexahistidine etiket ile pET28 (b) vektörü içine SENP1 katalitik etki. </li></ol> 2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması <ol><li> PET28 ile suşu BL21 (DE3) ve Escherichia coli hücreleri Transform (b) CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ve SENP1 bir katalitik etki kodlayan vektörler. </li><li> 600 nm&#39;de 0.5 bir optik yoğunluğa ulaşmak üzere 37 ° C (250 rpm&#39;de sallama), 3 saat boyunca 2xYT ortamı içinde yeniden izlenmesiyle dönüştürülmüş bakteriler yetiştirilir. </li><li> Izopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) (nihai konsantrasyon) proteini ifade etme indüklemek ve 25 saat için sallayın 16 ° C ile 200 rpm ile 100 uM ekleyin. </li><li> Centrifug bakterilerin hasat4 10.000 rpm&#39;de 5 dk tirme ° ve 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 5 mM imidazol ve bir tampon içinde tekrar süspansiyon için onları C. </li><li> MiSonics 4.000 sonikatör kullanılarak 25 W bir güç ayarında 5 saniye aralıklarla 10 dakika için hücreler sonikasyon ve 4 35,000 x g&#39;de santrifüj ile bunları toplamaya ° C&#39;de 30 dakika süre ile. </li><li> 1 L kültür için 500 ml Ni-NTA boncuklar ile sütun ayarlama ve sütuna süpernatant aktarmak. </li><li> 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, ve iki defa 10 mM imidazol tampon ile reçine yıkanır. </li><li> 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 500 mM imidazol ile ve 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl ve 1 mM ditiotreitol (DTT) de bir tampon içine diyaliz tamponu ile elute protein 4 ° C gecede. </li><li> Bradford tahlili ile saflaştırılmış protein konsantrasyonu belirlenir. Protein konsantrasyonu ölçümleri için alternatif yöntem SDS-PAGE jel elektroforezi olmak ve sonra Coomassie mavisi ile boyandı olacak görüntüleme ile takipniceliksel. </li></ol> 3. Kantitatif Spektrum Analizi FRET <ol><li> Tahlil için genel strateji (Şekil 1) sinyalizasyon Fret dayanmaktadır. FRET çifti, CyPet ve YPet, ön-SUMO1, sırasıyla N-ve C-termini ile etiketlendi. SENP1 keser füzyon SUMO1 en C-terminusunda Gly-Gly yerinde protein CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ve, böylece, YPet ile SUMO kuyruk serbest bırakır. Sinyal CyPet gelen emisyon artış ve CyPet dalgaboyu az YPet emisyon dramatik bir azalma ile sonuçlanan, bozulur FRET. </li><li> Mutlak FRET indüklenen YPet emisyon, CyPet doğrudan emisyon ve YPet doğrudan emisyon (Şekil: 530 nm dalga boyunda ışık ile 414 nm, toplam floresans emisyon CyPet-(pre-SUMO1)-YPet heyecanlı zaman üç kaynaktan elde edilebilir 2). </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> nerede FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; 414 nm&#39;de uyarıldığı 530 nm&#39;de toplam floresans emisyonu, FL FRET mutlak sinyal FRET olduğunu, FL CyPet (devam) 414 nm&#39;de heyecanlı CyPet doğrudan emisyon ve FL YPet (devam) YPet olduğunu 414 nm&#39;de uyarıldığı zaman emisyon yönlendirebilirsiniz. Ve simge (devam) katkı anlamına gelir. <ol start="3"><li> Α sabit bir oran ile 414 nm&#39;de uyarıldığı zaman 530 nm CyPet arasında doğrudan emisyonu 475 nm&#39;de emisyon orantılı idi. CyPet-SUMO1 50 konsantrasyonları, 100, 200, 500, ve 750 nM hazırlanan ve 1 mM edildi ve 475 ve 530 nm emisyon α (Şekil 3-1) belirlemek için 414 nm&#39;de uyarılma sonrasında ölçüldü. </li><li> Β sabit bir oran ile 475 nm&#39;de uyarıldığı zaman 414 nm uyarma altında 530 nm&#39;de YPet arasında doğrudan emisyonu 530 nm&#39;de emisyon orantılı idi. YPet 50 konsantrasyonları, 100, 200, 500, 750 hazırlandıörnekleri β (Şekil 3-2) belirlemek için 414 dalga boylarında ve 475 nm ile heyecanlı iken nd 1.000 nM ve 530 nm&#39;de emisyon ölçüldü. </li><li> CyPet-(pre-SUMO1)-YPet SENP1 tarafından sindirilir zaman, dilinim CyPet-SUMO1 ve YPet ile SUMO1 kuyruk yayımladı. Bileşik 414 nm&#39;de uyarıldığı zaman, 530 nm (FL &#39;530/414) de floresans emisyonu azalmış ama hala gibi üç bölüme ayrılabilir: </li></ol><img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> FL &#39;414 nm&#39;de uyarıldığı zaman 530/414 sindirim sonra 530 nm&#39;de toplam floresans emisyonu, FL&#39; burada kalan mutlak FRET sinyal FRET, FL &#39;CyPet (475/414) iken sindirim sonra 475 nm&#39;de CyPet emisyonu 414 nm (burada CyPet emisyon iki bölümden alınmıştır: CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sindirilmemiş ve CyPet-SUMO1 sindirilmiş) heyecanlı ve FL YPet(530/475) CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sindirilmiş olup olmadığını sabittir 475 nm&#39;de heyecanlı YPet emisyon vardır. <ol start="6"><li> SENP1 ile sindirim sonra, geri kalan emisyon (FL &#39;FRET)&#39; dir FRET: </li></ol><img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> C CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ve x &#39;in toplam konsantrasyonunu sindirilmiş konsantrasyonu CyPet-(pre-SUMO1)-YPet olup. <ol start="7"><li> Tüm öğeleri birleştirerek, 414 nm (FL &#39;530/414) ve uyarma altında 530 nm&#39;de tespit floresans emisyonu: </li></ol><img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. Enzim Kinetik Çalışması için FRET tabanlı Proteaz Assay <ol><li> CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl,% 0.1 bir tampon içinde 37 ° C &#39;de SENP1 arasında katalitik alan ile inkübe edildi v /v) Tween-20, 80 ml toplam hacim 1 mM DTT ve 384-plaka içine aktarılır. </li><li> Runs 15 sn aralıklarla 5 dakika süreyle bir floresan multiwell plaka okuyucu içinde 414 nm de bir uyarım sonrası 475 ve 530 nm&#39;de floresans emisyon ölçümü ile yapılmıştır. </li><li> Reaksiyon hızı (v) olarak alt tabaka (S) miktarı değişim ile korelasyon: </li></ol><img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> Ürünün konsantrasyonu olarak 0 dan üstel olarak artmaktadır [S] 0 (orijinal substrat konsantrasyonu), t = 0: </li></ol><img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> T = 0, orijinal hızı (V 0) olduğunda: </li></ol><img alt="Denklem 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> KonsSENP1 arasında entration tespit edildi, ve CyPet-(pre-SUMO1)-YPet konsantrasyonu Michaelis-Menten denklem için gerekli olan enzim konsantrasyonu, 100 kat daha fazla çıkarılmıştır. </li><li> Floresan okumaların tüm kantitatif FRET analizi yöntemi ile analiz ve Michaelis-Menten eşitliği sığdırmak için GraphPad Prism V Yazılım aktarılmıştır. Doğrusal olmayan regresyon zamanda tablolama programları (Microsoft Excel gibi) gibi daha yaygın yazılım paketleri yardımı ile yapılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar SENP1 ön-SUMO1 olgunlaşması süreci sırasında 475 ve 530 nm de floresan sinyalini meydana gelen değişiklikleri takip edilerek tespit edilebilir. Sonuçlar, bir alt tabaka doza bağlı olarak SENP1 tarafından önceden SUMO1 sindirim hızı (Şekil 4). Bu da gösteriyor öncesi SUMO1 en olgunlaşması için SENP1 ve katalitik etki sergiler mükemmel aktivite olduğunu. Başlangıç ​​reaksiyontion hızları farklı substrat konsantrasyonları (Tablo 1) ile ilgili olarak yukarıda analizi ile hesaplanmıştır. K kedi / K M oranı, genel olarak bir alt tabaka veya başka substratlar ile, belirli bir enzim ile farklı enzim etkinliği karşılaştırmak için kullanılır. K M ve V max karşılık gelen çeşitli ilk hızlar, çizilerek Michaelis-Menten denklemden elde edilebilir . CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Şekil 5) k kedi halinde elde edildi farklı konsantrasyonları için: <img alt="Denklem 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> Yukarıdaki analize göre, hesaplanan K M 0.21 idi ± 0.04 uM, k kedi ± 0.28 s -1 6.90 idi ve k cat / K M oranı (± 0.55 3.2) idi x10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Şekil 1. SENP öncesi sumos olgunlaşması için FRET tabanlı proteaz tahlil grafiği. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Şekil 2. Donör, alıcı ve FRET tarafından konulan sermaye olarak floresan sinyal kantitatif analizi. CyPet-414 nm uyarma altında (pre-SUMO1)-YPet. FL CyPet (530/414) gelen emisyon spektrumları diseksiyonu 414 nm uyarma altında 530 nm&#39;de CyPet emisyon, FL FRET olduğu FRET indüklenen YPet 414 nm uyarma altında 530 nm&#39;de emisyon ve FL YPet (530/414) 414 nm uyarma altında 530 nm&#39;de YPet emisyon olduğunu. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. Yön emisyon faktörü α ve β hesaplanması. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Şekil 4. SENP1 ve katalitik etki farklı oranlarda tarafından sindirilir CyPet-(pre-SUMO1)-YPet kantitatif analizi. Reaksiyonlar ilk 5 dakika içerisinde izlenmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Şekil 5. SENP1 tarafından CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en sindirim Michaelis-Menten grafik analizi. Veri çizilen ve GraphPad Prism V ve doğrusal olmayan regresyon ile analiz edildi. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (uM) </td><td> V 0 (uM / s) </td></tr><tr><td> 0.115 </td><td> 0.0023 ± 0.00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0.214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0.407 </td><td> 0.0033 ± 0.00007 </td></tr><tr><td> 0.594 </td><td> 0.0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0.725 </td><td> 0.0043 ± 0.00012 </td></tr><tr><td> 1.471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1.899 </td><td> 0.0050 ± 0.00031 </td></tr><tr><td> 2.300 </td><td> 0.0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. SENP1 öncesi SUMO1 olgunlaşan ilk hızlarının belirlenmesi. Her bir alt tabaka konsantrasyonu, dört numune sindirim ölçmek için kullanılmıştır. Standart sapma, bu dört örneklerin varyasyonları geldi. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (uM) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / k M (M -1 • s-1) </td></tr><tr><td> 0.21 ± 0.04 </td><td> 6.90 ± 0.28 </td><td> 3.2 ± 0.55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Kantitatif tarafından SENP1 öncesi SUMO1 olgunlaşan Kinetik parametrelerin analiz FRET. Standart sapma, her bir alt tabaka konsantrasyonu olarak dört numune geldi.

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li>
<li>Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%2C+ubiquitin%27s+mysterious+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-RING+for+SUMO%3A+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li>
<li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeSUMOylating+enzymes-SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li>
<li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+in+reverse%3A+the+SUMO+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li>
<li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

FRET teknoloji SENP1 9 tarafından önceden SUMO1 olgunlaşan incelemek için kullanılmıştır. CFP-YFP, verici ile alıcı emilim oranı olarak FRET çifti ve rasyometrik analizi kullanılmıştır kinetik özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Bununla birlikte, geleneksel rasyometrik içinde kendinden flüoresan analiz FRET verici ve alıcı arasında hiç düşünülmemiştir. Oranı doğrudan sindirilmiş substrat miktarı ile korele değildir. Burada SENP1 öncesi SUMO1 en olgunlaşma kinetik çalı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PCR II TOPO Takımı </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Araştırma Ürünleri Internationa.l Corp </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie artı (Bradford) Assay Regent </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384-plaka (cam alt) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 plaka okuyucu </td><td> Moleküler Cihaz </td><td></td></tr></tbody></table>

kantitatif senp1 proteaz kinetik belirlenmesi (förster rezonans enerji transferi) analizi fret

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Ubikitin veya ubikitin-benzeri proteinler (Ubls) ile proteinlerin tersinir posttranslasyonel değişiklikler yaygın olarak dinamik bir protein aktivitesini düzenleyen ve çok biyolojik olarak farklı roller için kullanılır. Örneğin, SUMO kovalent hücre siklusunun regülasyonunda, hücre yaşam ve ölümü, DNA hasar cevabı ve stres yanıtın 1-5 gibi birçok hücresel süreçlerin önemli rolü olan bir büyük numarası veya proteinleri değiştirir. SENP, SUMO-spesifik proteaz olarak, SUMO öncüllerinin olgunlaşmasının endopeptidazla olarak veya isopeptidase gibi fonksiyonları hedef proteinleri SUMO kaldırmak ve sumoilasyon döngüsü 1,3,6,7 yenilemek için. Bir enzimin katalitik etkinliği ya da en iyi seçicilik kinetik sabitler, k kedi / K M oranı ile karakterize edilir. Çeşitli çalışmalarda, SUMO-SENP çiftleri kinetik parametreleri rad, poliakrilamid jel tabanlı western-blot dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle tespit edilmiştirioactive-etiketli substrat, floresan bileşik ya da protein alt tabaka 8-13 etiketli. Ancak, &quot;yerli&quot; proteinleri kullanılır ama poliakrilamid-jel tabanlı teknikler, zahmetli ve teknik olarak zor olan, kolayca ayrıntılı nicel analiz için kendilerini borç yoktur. ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ya da AMC (7-amino-4-methylcoumarin) florofor ile tetrapeptides ya da proteinlerin kullanıldığı çalışmalar k kedi / K M edilen doğal substratlar göre büyüklük daha düşük en fazla iki sipariş ya idi veya açıkça SENPs ve iso-ve endopeptidazla faaliyetleri ayırt edemez. Son zamanlarda, FRET tabanlı bir proteaz deneyleri mavi floresan protein FRET çifti (CFP) ve sarı floresan protein (YFP) 9,10,14,15 ile deubiquitinating enzimler (Dubs) ya da SENPs incelemek için kullanılmıştır. Proteaz ac için sinyal monitör FRET için donör emisyonu alıcı emisyon oranı ölçülebilir bir parametre olarak kullanılmıştırbilirlik belirlenmesi. Bununla birlikte, bu yöntem alıcı ve verici kendi flüoresans ile alıcı ve verici emisyon dalga boyunda çalışan sinyal çapraz bulaşma göz ardı edilir ve böylece doğru değildir. Bu SENP1 ön-SUMO1 olgunlaşma kinetik parametrelerinin belirlenmesi için bir yeni ve son derece hassas kantitatif FRET bazlı Proteaz analiz geliştirilmiştir. Bir tasarlanmış, önemli ölçüde geliştirilmiş FRET verim ve floresan kuantum verimi ile çift CyPet ve YPet FRET CyPet-(pre-SUMO1)-YPet alt tabaka 16 oluşturmak için kullanılmıştır. Biz farklılaşmış ve verici ve alıcı tarafından katkı ve sırasıyla alıcı ve emisyon dalga boylarında FRET mutlak floresans sinyalleri sayılabilir. K kedi / K M değeri SENP1 x10 7 M -1 s -1 genel enzim kinetik parametreler ile uyum içindedir ön SUMO1, karşı (3.2 ± 0.55) olarak elde edildi. Bu nedenle, bu yöntem geçerlidir ve bir de kullanılabilirsa genel hem de diğer proteazlar karakterize yaklaşım.

FRET kantitatif analizi (Förster rezonans enerji transferi) sinyalleri içeren bir roman yöntemini enzim kinetiği çalışmaları için tanımlanmıştır.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; Ve<em&gt; K<sub&gt; Kedi</sub</em&gt; (Küçük ubikitin gibi değiştirici) ön SUMO1 için SENP1 (SUMO / Sentrin belirli proteaz 1) &#39;in katalitik alanının hidroliz için elde edilmiştir. Bu kantitatif-FRET bazlı proteaz kinetik çalışma genel ilkeler diğer proteazlar için uygulanabilir.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Proteinlerin ubiquitin veya ubiquitin benzeri proteinler (Ubl'ler) ile tersinir posttranslasyonel modifikasyonları, proteinlerin dinamik olarak düzenlenmesinde yaygın şekilde kullanılmaktadır...

Bu video, proteaz kinetiğinin kantitatif analizi için geliştirilmiş yeni, tek aşamalı bir FRET deneyi sunmaktadır. Aşağıdaki deneyin genel stratejisi, FRET sinyal analizine dayanmaktadır. Burada, sağlam substratta FRET çifti olan CyPet ve YPet, pre-SUMO1'in N ve C terminallerine bağlanmıştır ve CyPet ile YPet birbirine yakın konumdadır.Bu molekül 414 nanometre dalga boyunda uyarıldığında, emisyon sinyalinin büyük çoğunluğu 530 nanometrede görülür. Ancak, SENP1 proteaz eklendiğinde, substrat Sumo1 C terminalindeki Gly-Gly bölgesinden kesilerek CIPA ve wpa birimlerini birbirinden ayırır. Artık 414 nanometrede uyarıldığında, gözlemlenen emisyon sinyalinin büyük çoğunluğu 475 nanometrededir.Bu reaksiyonun kinetiğini değerlendirmek için, beş dakikalık bir süre boyunca her 15 saniyede bir floresan emisyonları belirlenir. Elde edilen floresan verilerinin analizi, cype pre sumo one ype substratının SENP one proteazı tarafından sindirilme hızını ortaya koyar. Bu tekniğin; floresan peptid substrat kullanan yağ assay'i gibi mevcut kütle analizlerine, radyometrik analizlere veya western blot'a göre temel avantajı, gerçek zamanlı kinetik parametreleri tek adımlı bir gerçek zamanlı assay ile belirleyebilmesidir.Bu tekniğin etkileri, kanserler ve metabolik hastalıklar gibi proteinlerin dahil olduğu hastalıkların tedavisine ve teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu teknik, çeşitli proteinler ve bunların inhibitörlerinin keşfi için hassas ve yüksek kapasiteli analizler sağlayabildiğinden ve hastalık sürecini gösteren karakterizasyonlar yapabildiğinden, prosedürü laboratuvarımdaki, bu yöntemi ve prosedürü geliştiren ilk kişi olan ENUA lisansüstü öğrencisi gerçekleştirecektir. Bu prosedüre, Cype ype pre sumo one, mature sumo one ve SENP one katalitik etki alanlarının açık okuma çerçevelerini PCR ile çoğaltarak başlayın.Elde edilen ürünleri PCR two topo vektörüne klonlayın. Ardından, gen dizilerinin doğruluğunu sekanslama yoluyla onaylayın. Daha sonra CYPE pre sumo one ype cype sumo, one ype ve SENP one katalitik alanını kodlayan CD NA'yı, N terminal Polyhis etiketi içeren PET 28 B vektörüne klonlayın.Genler vektöre klonlandıktan sonra, elektroporasyon yoluyla Esia coli, BBL 21 DE üç hücrelerine transforme edin. Transforme edilen bakterileri katı besiyerine ektikten sonra, tekil koloniler seçin ve bunları gece boyunca kültüre edin. Ardından, iki litrelik 2X YT besiyeri içeren erlenmayerleri, transforme edilen bakterilerle 1:100 oranında inoküle edin.Kültürleri, 600 nanometrede 0.5 optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 derece Celsius'ta, 250 RPM'de çalkalayarak üç saat boyunca inkübe edin. Protein ekspresyonunu indüklemek için, final konsantrasyonu 100 mikromolar olacak şekilde IPTG ekleyin ve 25 derece Celsius'ta 200 RPM'de 16 saat boyunca çalkalayın. Ardından, bakterileri 250 mililitrelik santrifüj şişelerine aktarın.Ardından bakterileri 4 °C'de 8.000 G'de beş dakika boyunca santrifüj ederek hasat edin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı atın ve bakteri hücrelerini tris HCL, sodyum klorür ve ole içeren bir lizis tamponunda yeniden süspande ederek kültürleri 50 ml'lik santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra, bakteri hücrelerini parçalamak için hücreleri 70 genlikte, beş saniyelik aralıklarla 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.Ardından, füzyon proteinlerini hücre kalıntılarından ayırmak için tüpleri 4 °C'de 35,000 RCF hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi sırasında, kültüre edilen hücrelerin her bir litresi için 500 µL nikel NTI boncuk içeren 10 mL'lik bir BioRad kolonu hazırlayın. Santrifüj sonrası çözeltinin kolondan damlayarak süzülmesine izin verin.Süpernatantı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Süpernatant çözeltiyi kolona dökün. Süpernatantın tamamı rezinle temas ettikten sonra, kolonu 10 mililitrelik tris hidroklorür sodyum klorür ve emit aole tamponu ile iki kez yıkayın.Proteini elüe etmek için, bu kez 500 millimolar ole içeren aynı tampon çözeltiden 500 microliters ekleyin. Akış sıvısını bir mikro santrifüj tüpünde toplayın.Ardından, çözeltiyi 10 kilodaltonluk moleküler kesim değerine sahip diyaliz tüpüne aktarın ve örneği dört degrees Celsius'ta 20 millimolar tris, HCL 50, millimolar sodyum klorür ve bir millimolar DTT içeren bir litre tampon çözelti içerisinde gece boyunca diyalize edin. Diyaliz işleminin ardından, saflaştırılmış proteinleri bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve saflaştırılmış proteinlerin konsantrasyonlarını Bradford Assay ile belirleyin. Sonrasında, saflaştırılmış proteinler, pre sumo one'ın SENP one tarafından kesilme hızını kantitatif fret assay kullanarak değerlendirmek için kullanılır.Mikrosantrifüj tüplerinde 5100, 200, 500, 750 ve 1000 nM konsantrasyonlarında 60 mililitre Spet Sumo one ve YA hazırlayın. Bu kontrol örnekleri, aynı tampon içerisindeki cype ve YA'nın doğrudan emisyonunun sabit oranını karakterize etmek için kullanılacaktır. 0,03 µM ile 0,9 µM arasında değişen 12 farklı konsantrasyonda cype pre sumo one y PET ve SENP one'ın katalitik domaininin 0,3 nM'lik bir dilüsyonunu hazırlayın.Floresan çok kuyucuklu plaka okuyucuyu, 37 °C'de iki dakika boyunca 32 saniyelik aralıklarla; 414 nanometre eksitasyon sonrası 475 ve 530 nanometrelerde floresan emisyonunu ve 475 nanometre eksitasyon sonrası 530 nanometrede emisyonu ölçecek şekilde ayarlayın. Plakanın otofloresansını elde etmek için florimetreye boş bir 384 kuyucuklu plaka yerleştirin ve ölçümleri gerçekleştirin. Plakanın otofloresansı belirlendikten sonra florimetrenin ayarlarını şu şekilde düzenleyin: CyPet Sumo için eksitasyon 414 nanometre olacak ve ölçümler 475 nanometre ile 530 nanometrede alınacaktır; YPet için eksitasyon 414 nanometre ve 475 nanometre olacak ve ölçümler 530 nanometrede alınacaktır.Ardından, bu diyagramda gösterildiği gibi, 384 kuyucuklu plakanın uygun kuyucuklarına üç tekrar şeklinde 75 µL cype Sumo one ype veya cype sumo one ype ekleyin. Daha sonra, her kuyucuğa hazırlanan SENP one'dan 5 µL ekleyerek final hacmi 80 µL'ye getirin; plakayı hemen florimetreye yerleştirin ve floresan ölçümlerini başlatın. Floresan okumalarını, bir sonraki bölümde gösterilen kantitatif FRET analiz yöntemi kullanılarak analiz edin.Bu teknolojinin temel fikri, mutlak tehdit sinyalini sindirimle ilişkilendirmektir. Mutlak tehdit sinyalini elde etmek mi istiyorsunuz? Akseptörlerin emisyon dalga boylarındaki toplam floresan emisyondan, donörün ve akseptörün doğrudan katkılarını hariç tutmamız gerekir.Donör ve akseptörün doğrudan katkıları, sırasıyla donör ve akseptörlerin alfa ve beta korelasyon katsayısı faktörlerinden hesaplanır. Videonun bu bölümünde hesaplamaların nasıl yapıldığı detaylandırılacaktır. SENP1 tarafından substrat sindiriminin kinetiğini analiz etmek için GraphPad Prism 5 yazılımını kullanın; plakadaki arka plan floresansı çıkarıldıktan sonra dışa aktarılan txt dosyasını Excel'de açarak başlayın.Farklı zaman noktalarındaki sindirilmiş substrat konsantrasyonu, 414 nanometre dalga boyundaki ışıkla uyarıldığında PrepU formülasyonları ile hesaplanır; 530 nanometredeki toplam floresan emisyonu üç kaynaktan türetilebilir: mutlak FRET kaynaklı Y pets emisyonu, cype doğrudan emisyonu ve wpe doğrudan emisyonu. Bu denklemde, FL 530/414, 414 nanometrede uyarıldığında 530 nanometredeki toplam floresan emisyondur; FL fret ise mutlak FRET sinyalidir.FL Spet Con, Spet doğrudan emisyonudur. 414 nanometrede uyarıldığında ve FL Ype Con, Ype doğrudan emisyonudur. 414 nanometrede uyarıldığında, spet'in 530 nanometredeki doğrudan emisyonu, 475 nanometredeki emisyonu ile orantılıdır.Sabit bir alfa oranıyla 414 nanometrede uyarıldığında, 414 nanometre uyarımı altındaki YA'nın 530 nanometredeki doğrudan emisyonu, 530 nanometredeki emisyonuyla orantılıdır. spet pre sumo one ype SENP one tarafından sindirilip 414 nanometrede uyarıldığında, sabit bir beta oranıyla 475 nanometrede uyarılmış durumdadır. 530 nanometredeki floresan emisyonu azalmıştır, ancak burada olduğu gibi hâlâ üç kısma ayrılabilir.FL' 530/414, sindirim sonrası 530 nanometredeki toplam floresan emisyondur. 414 nanometrede uyarıldığında, FL' fret kalan mutlak fret sinyalidir ve FL' SPET 475/414 ise 414 nanometrede uyarıldığında sindirim sonrası 475 nanometredeki spet emisyonudur. Emisyon, sindirilmemiş cype-pre sum1, ype ve sindirilmiş cype-Sumo 1 olmak üzere iki kısımdan kaynaklanmaktadır.FL Y PET 530/475, 475 nanometre dalga boyunda uyarıldığında gerçekleşen emisyondur ve cype pre sumo one ype sindirilmiş olsun ya da olmasın sabittir; SENP one ile sindirimden sonra kalan FRET emisyonu, C'nin toplam cype pre sumo one ype konsantrasyonu ve X'in sindirilmiş cype pre sumo one YA konsantrasyonu olduğu şu denklemle gösterilir. Tüm öğeler birleştirildiğinde, 475 nanometre uyarım altında 530 nanometrede saptanan floresans emisyonu, enzim kinetiği çalışması için FRET tabanlı proteaz testi kapsamında bu denklemle gösterilir; reaksiyon hızı, ürün konsantrasyonu sıfırdan eksponansiyel olarak arttıkça substrat miktarındaki değişimle ilişkilendirilir.Burada görüldüğü gibi T sıfıra eşit olduğunda, S₀ T sıfır olduğundaki orijinal substrat konsantrasyonunu belirtir. Orijinal hız, pre-sumo'nun SENP1 tarafından olgunlaştırılmasıdır.Süreç boyunca 475 ve 530 nanometrelerdeki floresan sinyalindeki değişiklikler izlenerek belirlenebilir. Burada gösterildiği gibi, pre-SUMO1 olgunlaşma hızı substrat dozuna bağımlıydı; bu durum, SENP1 katalitik domaininin pre-SUMO1 olgunlaşması için mükemmel aktivite gösterdiğini kanıtlamaktadır. Başlangıç reaksiyon hızları, farklı substrat konsantrasyonları kullanılarak aynı analizle hesaplanmıştır.KCAT/KM oranı, genellikle farklı enzimlerin tek bir substratla veya belirli bir enzimin farklı substratlarla olan verimliliklerini karşılaştırmak için kullanılır. Farklı cype konsantrasyonlarına karşılık gelen çeşitli başlangıç hızleri grafiğe dökülerek McKayla Cementin denkleminden KM ve Vmax değerleri elde edilebilir. Pre sumo one YA kcat değeri bu denklem kullanılarak elde edilmiştir.Yukarıdaki analize göre, hesaplanan KM 0,21 ± 0,4 µM idi. kcat değeri 6,90 ± 0,28 s⁻¹ ve kcat/km oranı 3,2 ± 0,55 × 10⁷ M⁻¹ olarak belirlendi. İkinci olarak, bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürü takip ederek tek adımda ve gerçek zamanlı ölçüm yapan yeni bir kantitatif yağ analizi ile proteaz kinetik parametrelerinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Gerçek görünür KM veya inhibitör K gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla ürün inhibisyonu veya inhibitör karakterizasyonları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, protein alanındaki araştırmacıların hassas genetiği keşfetmelerinin, optik sensördeki fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alan proteinleri anlamalarının, hızlı teşhis ve ilaç keşfi yapmalarının önünü açmıştır.

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, bir test proteinine özgü antikorlar üzerinde etiketlenmiş donör ve alıcı floroforların yardımıyla endojen protein fosforilasyonunu belirlemek için zamana bağlı Förster rezonans enerji transferini veya TR-FRET testini açıklar. Bu teknik, hücre lizatlarındaki test proteinlerinin fosforilasyonunu ölçmek için tasarlanmıştır.

Hücrelerde protein fosforilasyonunun izlenmesi için zamana bağlı Forster rezonans enerji transferi

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Burada açıklanan protokoller, nötrofil proteazların insan balgamındaki aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için bir kılavuz sağlar. Bu tür analizlerin uygulamaları anti-enflamatuar tedavilerin değerlendirilmesinden biyobelirteç doğrulamasına, ilaç taramasına ve büyük kohort klinik çalışmalarına kadar yayılmaktadır.

İnsan Balgam Örneklerinde Nötrofil Elastase ve Katepsin G Aktivitesinin İzlenmesi

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Öğrenin, FRET tabanlı tek adımlı bir analiz yöntemiyle SENP1 proteaz kinetiğini kantitatif olarak belirlemeyi. Bu yöntem pre-SUMO1 substratının hidrolizini gerçek zamanlı izleyerek Km ve kcat parametrelerini hassas şekilde ölçer.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Daha fazla video keşfet