Zebra balığı larvalarının Microgavage

Bu prosedürün genel amacı, zebrafish larvalarının intestinal lümenine oral yolla materyal uygulamaktır. İlk olarak, larvalar anestezi altına alınır ve metil selüloz ile kaplanmış bir enjeksiyon kalıbına yerleştirilir. Ardından, larvalar nazikçe kalıba daldırılır ve gavage iğnesi ile mikro manipülatörün açısına göre hizalanır.

Ardından iğne larvanın ağzına yerleştirilir ve bağırsak bulbuna doğru yönlendirilir. Yerleştiğinde, materyal lümene bırakılır. Son adım, larvanın metil selülozdan çıkarılması ve anesteziden kurtulması için taze besiyerine yerleştirilmesidir.

Nihayetinde bu yöntem, bağırsak içindeki veya bağırsak dışı dokulardaki taşıma süreçlerinin incelenebildiği zebrafish larvalarının bağırsak lümenine spesifik olarak materyal iletmek için kullanılabilir. Bu tekniğin, ilgili materyali içeren suya daldırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hayvana iletilen materyal miktarının yanı zamanda zamanlamanın ve dozajın kesin bir şekilde kontrol edilebilmesidir. Bu durum, deneysel değişkenliği ve bazı durumlarda belirli materyallerle ilişkili toksisiteyi azaltır.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, belirli floresan probları, mikroskopi ile intestinal epitelyumda tespit edilebilecek kadar yüksek seviyelerde uygularken zorluk yaşadığımızda ortaya çıktı. Yüksek konsantrasyonlar bazen balıkları öldürebiliyor ve buna rağmen görüntüleme için yeterince yüksek floresan sinyali sağlamıyor. Başlamak için, bir mikro pipet çekici kullanarak birkaç gavage iğnesi çekin ve silika cam kapilerler ödünç alın.

İğneleri kesmek için stereo mikroskoba geçin. Öncelikle, iğnenin ucunu şeffaf bir cetvelin veya grafik kağıdının ucuna hizalayın. Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, ince uçlu saatçi pensi kullanarak iğneyi ucundan yaklaşık bir milimetre uzaklıktan kesin.

İğne ucunu 100 kat büyütmede inceleyin. İğnenin çapı yaklaşık 27 ila 30 mikron olmalı ve ucu küt olmalıdır. Daha tutarlı sonuçlar elde etmek için keskin veya tırtıklı iğnelerden kaçınılmalıdır.

İğne klips noktasını daha iyi kontrol etmek ve iğneyi alevle parlatmak (fire polish) için bir mikro ocak kullanılabilir. Keskin kenarları gidermek için uçlar düzeltilir. Ardından, gavage çözeltisi hazırlanır.

Çoğu uygulama için, mikro enjektörün görüntülenmesine ve gavage solüsyonunun yerleştirilmesine yardımcı olmak amacıyla fenol kırmızısı eklenir. Mineral yağı ile doldurduktan sonra, gavage iğnesini nano jet two Mikroenjeksiyon ünitesine monte edin. Düz ve su geçirmez bir yüzey sağlamak için 10 santimetrelik plastik bir Petri kabını biyofilm ile kaplayın ve parafilmin üzerine yaklaşık iki mikrolitre gavage solüsyonu paylaştırın.

Bir sonraki adım, gavaj iğnesini manuel olarak geri doldurmaktır. Mineral yağına hava kabarcıkları girmemesine dikkat edin. Boşaltım hacmini kalibre etmek için, damlacıklar boyut olarak tutarlı hale gelene kadar mineral yağıyla doldurulmuş küçük bir Petri kabına küçük damlacıklar enjekte edin, damlacıkların çapını grafiksel olarak ölçün ve damlacık hacmini hesaplayın.

İğneler arasındaki tutarlılık burada grafiklenmiştir. Gavage için iğneyi kullanmadan önce, temiz zebra balığı ortamında durulayarak kalıntı mineral yağı temizleyin. Aros kalıbını ısıttıktan sonra üç oluğu %3 metil selüloz ile kaplayın. Oluk, balığı tutacak kadar yeterince kapatılmalı, ancak metil selülozun hızla kurumasına neden olacak kadar az kapatılmamalıdır.

Ardından, altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara yaklaşık dört mililitre zebrafish medyumu paylaştırın ve her bir deneysel grup için zebrafish larvalarını ayrı kuyucuklara aktarın. Balıkları anestezi altına almak için, uygun zebrafish medyumunda üç kat yoğunlukta trica çözeltisi hazırlayın. Bir kuyucuk için.

Medya içine eşit hacimde trica solüsyonu ekleyip nazikçe çalkalayarak balıkları anestezi altına alın. Balıklar hareket etmeyi bıraktığı anda, geniş uçlu bir transfer pipeti kullanarak onları tek tek, başları oluğun 45 derecelik açısına gelecek ve kuyrukları oluğun 90 derecelik açısına doğru uzanacak şekilde metil selülozun üzerine yerleştirin. Her bir larvayı metil selüloza nazikçe bastırarak konumlarını sabitlemek için küt uçlu bir diseksiyon probu kullanın.

Ardından, iğnenin sığ bir açıyla eğimli olması için nano jet iki mikroenjeksiyon düzeneğini ayarlayın. Uzatma aralığının, kuyucuğun tabanını geçecek kadar yeterli olduğundan emin olun. Gelecekteki ayarlama ihtiyacını en aza indirmek için, bir elinizle immobilize edilmiş larvaları içeren plakada küçük düzeltmeler yaparken diğer elinizle mikroenjeksiyon ünitesinin mikromanipülatörünü kontrol ederek, mikroenjeksiyon ünitesini yavaş enjeksiyon ayarı konumunda 4,6 nanolitre bırakacak şekilde ayarlayın.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, zebra balıklarının çok küçük olması ve kolayca zarar görmesi nedeniyle zorluk yaşarlar. Stereo mikroskop altında özofagus yapısını tanımlamak ve intestinal lümene ulaşmak için gavage iğnesine uygulanacak uygun basınç miktarını belirlemek pratik gerektirir. İlk olarak, gavage iğnesini anestezi altındaki balığın ağzına nazikçe yönlendirin.

Özofagustan geçerek özofagus sfinkterini hafifçe bastırın ve ucu ön bağırsak duvarının hemen içine yerleştirin. Ön bulbusun içine girdikten sonra, materyali bu ayarlar kullanarak nazikçe uygulayın. Verilen hacim, bağırsak ön bulbusunu tam olarak doldurmalı ve özofagustan veya kloakadan dışarı sızmamalıdır.

İğneyi hızlı ve pürüzsüz bir şekilde geri çekin. Yemek borusuna önemli miktarda materyal salmamaya dikkat edin. Gavaj iğnesini çıkardıktan sonra, balığı taze besiyeri içeren bir kaba aktarın.

Larvaları anesteziden uyandırın ve taze besiyeri ile birkaç kez durulayarak metil selülozu uzaklaştırın. İhtiyaç duyulana kadar larvaları bir Petri kabına veya altı kuyucuklu plakaya aktarın. Sonraki analizler için, zebra balığı testlerine çeşitli materyaller iletmek amacıyla mikro gavage yöntemi kullanılabilir.

Başlamak için, bu yöntemin gösterimini sağlamak amacıyla gerekli gavage çözeltilerini hazırlayın. Bağırsak epitelyumunun bariyer bütünlüğünü analiz etmek için Texas Red ile konjuge edilmiş 10 KD dekstran kullanılır.

Daha önce gösterilen adımları takip ederek, her bir deney koşulu için 10 ila 20 zebrafish larvasından oluşan gavage grupları oluşturun. Mümkünse bunu duble veya triple gruplar halinde tekrarlayın. Gavage işleminden sonra, larvaların anesteziden ayılmasını sağlayın ve taze medyada serbestçe yüzmelerine izin verin.

Yaklaşık 20 dakika sonra, larvaları daha önce gösterildiği gibi tekrar anesteziye alın. Anestezi sonrası larvaları %3'lük metil selüloz içeren %3'lük agaroz bloğunun üzerine yerleştirin; larvaları floresan stereo mikroskop ve Texas red filtresi ile görüntüleyin ve burnundan kloakın hemen arkasına kadar olan kısmını gösterecek bir büyütme seçin. Floresan, intestinal lümende yoğun olmalıdır.

Bununla birlikte, bariyer fonksiyonu, gövde floresansı görselleştirilmesini sağlamak için maruziyet ayarlandıktan sonra ekstraintestinal dokularda görülen dekstran seviyesi ile değerlendirilir. Tek başına uygulandığında lüminal floresansı aşırı belirginleştirse bile, dekstran bağırsak lümeninde tutulur. Ancak, epitel sıkı bağlantılarını bozan EDTA ile birlikte işleme tabi tutulan larvalarda, dekstran dolaşımda ve antisemitik damar ve boşluklarda görülür.

Bu örneklerde, zebra balığı gövdesindeki bir ilgi alanının (ROI) bağıl ortalama floresan değerini nicelleştirmek için Image J kullanılmış ve sonuçlar, iç kontrol olarak balığın dışındaki bir ROI'ye göre normalize edilmiştir. Burada, standart bir iğneden elde edilen sonuçlar, mikro dövme iğnesinden elde edilenlerle karşılaştırılmıştır. Sadece dekstrin grubundaki daha az larva bağırsak dışı floresan göstermiş olup, bu durum mikro dövme iğnelerinin larvalara zarar verme olasılığının daha düşük olduğunu göstermektedir.

Bir bölgeye daha yakından bakıldığında, dekstranın damar sistemine veya bağırsak dışı boşluklara sızmadan yine bağırsak lümeni ile sınırlı kaldığı görülür. EDTA yokluğunda, EDTA ile birlikte uygulandığında dekstran, bağırsak dışı boşluklarda ve dorsal aorta ile posterior kardinal ven lümeninde gözlemlenir; buradaki kan sinyali kan akışından kaynaklanmaktadır. Bu prosedürü uygularken, iğnenin tırtıklı kenarlarının olmadığından, balıkların Metilselüloz içinde iyi konumlandırıldığından ve sabitlendiğinden emin olun; iğneyi larvanın özofagusundan geçirmeyi öğrenirken dikkatli ve sabırlı olun.

Bu teknik, zebra balığında bağırsak içine materyallerin kontrollü bir şekilde verilmesini veya görüntülenmesini gerektiren geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilir. Hayvana uygulama zamanlaması, yolu ve dozajı üzerinde titiz bir kontrol sağlar; böylece tek bir deney içindeki ve deneyler arasındaki varyasyonu önemli ölçüde azaltır.