Name: Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Keşfedin uzun vadeli koku adaptasyonunun moleküler okumasını C. elegans'ta GFP-etiketli EGL-4 kullanarak. Bu yöntem, AWC duyu nöronlarında nükleer yerelleşmeyi görselleştirerek adaptasyon durumunu hızlıca değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu yazıda dikkatli okumak için Scott Hamilton ve O&#39;Halloran laboratuar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Biz de mükemmel öneriler ve anlayışlı yorum için anonim yorumcusu ederim.

1. GFP İnşaat EGL-4 İfade Hayvanlar Etiketli <ol><li> ODR-3 gen (doğrudan yukan başlama kodonunun kullanımı 2678 bp) promotörü altında translasyonel füzyon GFP :: EGL-4 klonlama: (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 promotör sürücüler amphid nöron çiftleri ifade: AWA; AWB, AWC ve zayıf AKY. </li><li> (P) ofm-1: plazmid (p) ODR-3 :: GFP :: 50 yabani-tip (N2) hayvanların içine EGL-4 standart germ-line transformasyon teknikleri 8 kullanılarak ko-enjeksiyon belirteçleri ile ul ng / Inject: : GFP 9 (ul / 25 ng), ve (p) ODR-1 :: DsRed 10 (25 ng / ul). AWC ve AWB amphid nöron çiftleri ODR-1 promotör sürücüler ifade ve coelomocytes yılında ofm-1 promotör sürücüler ifade. </li><li> Ultra Violet (UV) / Trimethylpsoralen (TMP) entegrasyon protokole Adım 1.2 &#39;de ayrıntılı ekstrakromozomal diziler ifade transgenik hayvanlar koşuluyla11. </li><li> Bleach hayvanlar 12 senkronize ve OP50 E. içeren Nematod Büyüme Medya (NGM) plakalar üzerine onları yetiştirmek L4 sahneye coli. OP50 E. kaldırmak için M9 tamponu ile NGM plakalar kapalı L4 hayvanlar yıkayın coli bakterisinin. </li><li> M9 tampon çıkarın ve 30 mikrogram / 1,5 ml mikrosantrifüj tüp solucanı pelet üzerine ml TMP çalışma çözüm 50-100 ul ekleyin. Ortam ışığı bloke ve folyo sarılı 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 15 dakika süreyle bir rotator yavaşça karıştırma folyo 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü sarın. Büyük bir dereceye giremeyen NGM tabağa TMP / solucan çözüm solucanlar aktarın. </li><li> Bir Stratalinker 2400 kullanarak UV 350 μJ (X100) NGM tabakta solucanlar Açığa. Sonra bir OP50 içeren NGM plaka solucanlar ekleyin ve 5 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> Yaklaşık 10 numaralı seribaşı tabak (2-5 solucanlar her plaka) 50 transgenik solucanlar seçin. Transferi P0 yeni plakalar için 3 gün boyunca her 24 saat var. </li><li> 250 klonal F1 Seçimnimals (plaka başına 1 hayvan). Her F1 plaka 2-4 F2 hayvanları klonlama. Ofm-1 (p) de :: diseksiyon floresan mikroskop altında GFP ifade deseni bakarak% 100 iletim hattı aramak için F3 hayvanları kontrol edin. </li><li> Outcross yabani-tip N2 hayvanlar ile nihai entegre hat (lar) 5 kez. Biz pyIs500 olarak nihai entegre hattı bakın ve GFP gibi GFP etiketli EGL-4 molekülünün :: EGL-4 olacaktır. </li></ol> 2. Nükleer Translokasyon Tahliller için Yetiştirme ve Hayvan Bakımı <ol><li> 25 pyIs500 hayvanlar Yetiştirmek ° OP50 E. ile standart 10 cm NGM plakalar üzerine C (tarifi için aşağıya bakınız) tohumlu coli bakterisinin 13 (Şekil 1). </li><li> 1. Günde beş ayrı 10 cm OP50 E. üzerine 25 ekili plakaları 4-5 L4 pyIs500 hayvanlar ° C almak coli 25 plaka ve inkübe seribaşı ° C (yani, plaka başına 4-5 L4 hayvanlar). </li><li> 4. Günde, yetişkin p yıkayınS-Bazal tampon kullanarak büyük NGM plakalar kapalı pyIs500 hayvanların opulations (tarifi için aşağıya bakınız). Onlar plastik pipet uçları yan sopa gibi, hayvanlara aktarmak atılabilir cam pipetler kullanın. </li></ol> 3. Uzun vadeli Koku Induced Nükleer Translokasyon Tahliller <ol><li> PyIs500 hayvanlar bakterileri temizlemek için S-Bazal 3 kez yıkayın. Yıkamalar arasında hayvanlar santrifüj etmeyin; yerine hayvanların sabit bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde yerçekimi ile yerleşmek için izin. Bu tüm bakteri kaldırılır sağlamak için kritik olduğunu ve NGM pates kalan bakteriler olumsuz translokasyon testin sonucunu etkileyecek gibi kirlerden arınmış vardır. Ayrıca, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri otoklav tarafı ayrılmamak hayvanların neden olur ve bu nedenle non-otoklavlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanmak tüpün iç duvarları üzerinde bir &quot;yapışkan&quot; özelliği üretir olduğunu bulduk. </li><li> Hayvanlar Yıkamalar arasında ödeyecekseniz ise t makyajO uyum çözüm. 100 ml&#39;lik bir mezun silindir S-Bazal tamponu 100 ml ilave edilir. S-Bazal için koku adapte ekleyin ve Parafilm bir şerit kullanılarak silindir mühür. Butanon adaptasyon S-Bazal 100 ml 2-butaone 11 ul eklemek için benzaldehid adaptasyon, S-Bazal 100 ml benzaldehidin 7.5 ul ilave edin. Halinde icra Yavaşça (sallamayın) içeren mezun silindir S-Bazal ve koku 30 kez bir üniforma emülsiyon oluşturmak için ters. </li><li> S-Bazal içinde son yıkamadan sonra, tüm hayvanlara sıvı yerleştirmek ve çıkarmak için izin verir. Etiket bir tüp &quot;+ ve&quot; ya da &quot;uyum&quot; ve diğer boru &quot;-ve&quot; ya da &quot;unadapt&quot;. Daha sonra adaptasyon mikrosantrifüj tüpü (+ ve) ile uyum karışımı 1 ml ekleyin ve uyumsuzlar kontrol mikrosantrifüj tüpü (-ve) sonucu, S-Bazal 1 ml ekleyin. Her tüpte 100 ve 200 arasında hayvan sayıları tutmaya çalışın. Bazı uygulama ile, bu gözle bir pelet hayvanların yaklaşık sayısını tahmin etmek mümkündür. </li><li> 1,5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı koruyucusu yerleştirinHer bir tüp (haşhaş açık kapaklarını önler) ve 80 dk için bir rotator üzerine tüpleri yerleştirmek için. Biz 60 dk ve 80 dk arasında koku pozlama benzer sonuçlar (uzun dönem uyum yanıtı hem sonucu) verdiğini bulduk. Ancak, 80 dakika maruz elimizde daha tutarlı sonuçlar sağlar. Böylece tüm uzun vadeli uyum testleri 80 dk koku pozlama (Şekil 2) kullanılarak standardize edilmiştir. </li><li> 80 dakika sonra, S-Bazal hayvanlar 3 kere yıkayın. Hayvanların her yıkama arasındaki yerçekimi tarafından yerleşmek için izin verin. </li></ol> 4. Kısa vadeli Koku indüklenen Nükleer Translokasyon Tahliller <ol><li> Kısa süreli koku uyum halinde, ancak bunun yerine 80 dakika için koku adapte pyIs500 hayvanların kuluçka, 30 dakika maruz kalma kullanımı, uzun süreli başına koku indüklenen translokasyon deneyleri (Basamak 3,1-3,4) ile aynı protokol kullanabilir . Aşağıda özetlenen koku indüklenen nükleer translokasyon testlerinin ölçümü (Adım 5) Uzun vadeli ve kısa-ter için aynıdırm poz. </li></ol> 5. Koku bağlı Nükleer Translokasyon Olay Skorlama <ol><li> DH 2 0 içinde, agaroz jel elektroforezi ile çözülmesi ile 5 mM sodyum azid (NaN3) ihtiva eden% 2 agaroz pedleri edin. Bir cam mikroskop lamı üzerine NaN 3 içeren erimiş agaroz tek bir damla yerleştirin. Hemen erimiş agaroz açılan düzleştirmek için ilk slayttan başka bir cam mikroskop lamı yerleştirin. 30 saniye bekletin ve sonra yavaşça mikroskop ~ 1 mm düz agaroz pad ile bir mikroskop lamı bırakarak slaytlar dışında tease. </li><li> S-Bazal finalinde yıkama sonra, solucanlar 1,5 ml mikrosantrifüj tüp yerleşmek ve tüm sıvı kaldırmak için izin verir. Sonra birkaç mikroskop lamı agaroz pabuçlarına açılan bilge hayvanlar ekleyin. Bu 50 ile 100 arasında, slayt başına hayvan sayıları tutmak için önemlidir. Slayt başına çok fazla hayvan puanlama komplike ve genellikle mavi ışık uyarma sonra bir saçılma parlaklık yaratacaktır. Aşırı sıvı olabilirKim-silin küçük kullanılarak agaroz takımından kötülük. Ped üzerine 0,5 mm cam kapak kayma yerleştirin ve hayvanların hareketsiz NaN 3 için izin vermek için 2 dakika bekletin. Not, hayvanlar puanlama sonra slaytlar kurtarılabilir. M9 Tampon bir damla içine numaralı seribaşı NGM tabağa aktarılır eğer hayvanlar ~ 1 saat sonra NaN 3 anestezi kurtarmak olacaktır. </li><li> Bu noktada her deneyci slayt deneysel (+ ve) slayt ve hangi slayt (-negatif) slayt kontrolü olan izlemek için bir anahtar bulurlar ve körü körüne GFP atar başka bir kişiye slaytlar geçmek zorunludur: EGL-4 lokalizasyonu deseni. Bu, herhangi bir deneyci önyargı için kontrol edecek. </li><li> , 10X 40X ve 63X büyütme hedefleri ve GFP / TTT filtreleri ile dik bir floresan mikroskop kullanılarak slayt başına 50 ile 100 hayvanlar arasındaki Puanını. Öncelikle, parlak alan aydınlatma kullanılarak 10X büyütme altında hayvanları bulun. İkincisi, brigh kapatarak AWC nöron bulunt-alan aydınlatması ve RFP filtre kullanarak. AWB ve AWC nöronlarda (p) ODR-1 :: DsRed sürücüler ifade. Şeklinde küçük ve dairesel AWB hücre gövdeleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında AWC nöronlar belirgin oval hücre gövdeleri var. </li><li> AWC hücre gövdesi bulunur edildikten sonra, GFP filtresi geçmek ve GFP localisation kaydedin: nükleer veya sitoplazmik olarak EGL-4. Bir sayaç kullanarak deneyci slayt puanlama yaparken mercek bakarak tutmak için izin verir. Not: Adımları 5,1-5,5 istatistiksel olarak önemli verileri (Şekil 1-2) üretmek için iki ayrı günde en az 3 kez tekrarlanır. </li></ol> 6. Uzun vadeli Koku İntibak Kurtarma sırasında EGL-4 GFP etiketli izleme işlemi <ol><li> Adım 3.5 sonra zaman noktasında sıfır AWC birden alikotları ve nükleer karşı sitoplazmik GFP için skor :: EGL-4 içine pyIs500 hayvanların popülasyonlarının bölün (yani 80 dakika maruz kaldıktan sonra,) ve moklu sonraki zaman noktalarında (Şekil 3). </li><li> NGM plakalar üzerine atılabilir cam pipet kullanılarak kontrol (-ve) ve deneysel (+ ve) hayvanlarda hem aktarın. </li><li> Hayvanların çeşitli zaman uzunlukları için kurtarmak için bekleyin ve her zaman noktasında GFP :: EGL-4in AWC yeniden değerlendirmek yerelleştirme 5.1 5.5 Adımlar gibi. </li></ol> 7. Malzemeler NGM plakalar:; 3 g Sodyum Klorür (NaCl); 2,5 g Bacto-pepton 21 g Bacto-Agar: 1 L için 1 L GKD 2 0 ekleyin. Otoklav Medya. Sıcaklık 54 ° C okur otoklav, serin agar sonra kadar , 1 ml 1 M magnezyum sülfat (MgSO4), 1 ml 1 M kalsiyum klorür (CaCl2), etanol içinde 1 ml kolesterol (5 mg / ml stok) 25 ml 1 M potasyum fosfat tamponu: aşağıdaki çözümler ekleyin. 1 M Dibazik K 2 HPO 4 174.2 g / mol: 500 ml için: 400 ml GKD 2 O olarak çözülür 87.1 g Dibasic K 2 HPO 4. GKD 2 O. ile 500 L seviyesini ayarlama 500 ml Steril Filtre Ünitesi kullanılarak sterilize filtreleyin. 1 M mono KH 2 PO 4 136,1 g / mol: 1 L için: 800 ml GKD 2 O olarak, 136.1 g mono KH 2 PO 4 çözülür. GKD 2 O. ile 1 L seviyesini ayarlama 500 ml Steril Filtre Ünitesi kullanılarak sterilize filtreleyin. 1 M Potasyum Fosfat (K 3 PO 4) Tampon pH 6.0: 1 L için: 1 L Steril Filtre Ünitesi, 1 M mono KH 2 PO 4 868 ml ekleyin. Birim süzülmeye bırakın ve daha sonra 1 M Dibazik K 2 HPO 4 132 ml ekleyin. Ünitesi tüm sıvı filtre için izin verin. Filtre ünitesini çıkarın ve 6.0 pH ayarı. Oda sıcaklığında saklayın. S-Bazal: 1 L için: 50 ml 1M K 3 PO 4 Tampon eklemek, pH ~ 6.0; ve 20 ml 5M NaCl aq. 1 L doldurunGKD 2 O. Çözüm otoklavlayınız. M9: 3 g KH 2 PO 4, 6 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2 O.: 1 L için GKD 2 0 1 L doldurun. Otoklavda sterilize edin.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515(1993).</li>
<li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li>
<li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016(2010).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).</li>
<li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li>
<li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314(1999).</li>
<li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575(2000).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451(1995).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson%27s+Disease+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835(2008).</li>
<li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity%3A+Aplysia+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bir GFP etiketli EGL-4 molekülünün koku indüklenen nükleer girdisinin burada açıklanan C. olfaktör uyum sağlam bir moleküler okunmasını sağlar elegans. Koku indüklenen nükleer translokasyon testleri basittir ve hazırlık süresi sadece birkaç gün gerektirir. Bu deneyleri için yapılmış olduğu pyIs500 hayvan, AWC nöron hem de GFP-etiketli EGL-4 proteini ifade aydınlatan bir işaretleyici ifade eder. Böylece, nöron bu sınıf ile çalışan hiçbir deneyimi az olan bir deneyci çok hızlı (belki de bir kaç ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGM plakalar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Kimyasal </td><td> S671-10 </td><td> NGM plakalar </td></tr><tr><td> Bacto Peptonlu </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM plakalar </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat dibazik </td><td> Fisher Kimyasal </td><td> S375-500 </td><td> S-Bazal tampon ve NGM plakalar </td></tr><tr><td> Potasyum Fosfat mono </td><td> Fisher Kimyasal </td><td> P285-500 </td><td> S-Bazal tampon ve NGM plakalar </td></tr><tr><td> Kimwipes - Küçük </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol% 100 </td><td> Altın Kalkan KimyasalA.Ş. </td><td> 43196-115 </td><td> kemotaksisi deneyleri için sulandırma kokuları </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> NGM plakalar </td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> MP Biomedicals </td><td> 150136-500G </td><td> NGM plakalar </td></tr><tr><td> Sodyum Azid 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestetik </td></tr><tr><td> Agaroz - ultrapure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agaroz pedleri </td></tr><tr><td> Benzaldehit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> AWC koku </td></tr><tr><td> Bütanon, ACS Sınıf </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360473-500ML </td><td> AWC koku </td></tr><tr><td> Mikrosantrifuj Tüpler - 1.5 ml Renkli </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipet Tek Cam 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> UV entegrasyon </td></tr><tr><td> Filtre vakum şişesi - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

uzun vadeli olfaktör İntibak a moleküler saati<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Sürekli stimülasyon sırasında çoğu duyusal nöronlar sinyal onların hassasiyetini azaltarak tepki adapte olacaktır. Adaptasyon yanıtı şekli dikkatini yardımcı olur ve aynı zamanda aşırı uyarılması hücreleri korur. C. koku devre içerisinde İntibak elegans ilk Colbert ve Bargmann 1,2 tarafından tanımlanmıştır. Burada, yazarlar Amphid Kanat hücreleri tip C (AWC) duyusal nöronlar tarafından algılanan uçucu kokuları uyum yeteneklerini mutantlar kusurlu yalıtmak için genetik bir ekran tasarımı için kullanılan koku adaptasyon paradigma, parametreleri tanımlanır. Zaman yabani-tip C. elegans hayvanlar da koku onların yanıt uyum 30 dakika için çekici bir AWC-algılanan koku 3 maruz kalır ve daha sonra ~ 1 saat boyunca bir kemotaksis davranış tahlilinde adapte koku göz ardı eder. Zaman yabani-tip C. elegans hayvanlar daha sonra ac adapte koku yok sayacaktır ~ 1 saat için cazip bir AWC-algılanan koku maruz~ 3 saat hemotaxis davranış testi. C. koku adaptasyon Bu iki faz elegans kısa vadeli olfaktör adaptasyon (30 dak koku maruz kaldıktan sonra tetiklenen), ve uzun vadeli olfaktör adaptasyon (60 dk koku maruziyet sonrası uyarılan) olarak tanımlanmıştır. Daha sonra L&#39;Etoile ark. Çalışmak, 4 AWC nöronlarda kısa vadeli ve uzun vadeli olfaktör adaptasyon hem de gereklidir EGL-4 denilen bir protein kinaz G (PKG) ortaya çıkardı. EGL-4 protein uzun süreli koku uyum yanıtı ancak AWC 4 kısa vadeli olfaktör uyum yanıtı için vazgeçilebilir için gerekli olan bir nükleer lokalizasyon dizisi içerir. Yeşil floresan protein ile etiketleme EGL-4 olarak, bu uzun süreli koku pozlama sırasında AWC yılında EGL-4 lokalizasyonu görselleştirmek için mümkün oldu. Bu tamamen işlevsel kullanarak biz AWC 5 uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma geliştirmek mümkün olmuştur EGL-4 (GFP :: EGL-4) molekülü GFP etiketli. Bu m Kullanmaolfaktör adaptasyon olecular okuması biz AWC 6,7 olarak GFP kusurlu hücre içi lokalizasyonu desenleri :: EGL-4 sergilerler mutant hayvanlar tanımlamak için hem ileri ve geri genetik ekranlar gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Burada tarif: GFP 1) İnşaat :: EGL-4 eksprese hayvanlar; 2) uzun süreli koku indüklenen nükleer translokasyon deneyleri için hayvan yetiştiriciliği için protokol ve uzun vadeli koku indüklenen 3) puanlama Nükleer translokasyon olay ve nükleer GFP :: EGL-4 devlet kurtarma (re-sensitizasyon).

AWC önce ve uzun süreli koku maruz kaldıktan sonra GFP :: EGL-4 inç lokalizasyonu model bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Uzun süreli koku pozlama, GFP :: EGL-4 öncesinde AWC (Şekil 2B) sitoplazmada lokalize edilir ve 80 dakika koku maruz GFP sonra :: EGL-4 AWC (Şekil 2B) çekirdeğinde lokalize edilmektedir. Davranışsal düzeyde, sitozolik GFP :: EGL-4 AWC içinde olan hayvanların koku nokta kaynak (- kemotaksis endeksi 3 1&#39;e yakın olduğunu unutmayı...

Burada uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma tarif<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Protein Kinaz G, EGL-4, AWC denilen bir çift primer duyusal sinir hücresi içinde kararlı uyum yanıtı için gereklidir. Sitoplazmada gelen AWC çekirdeği uzun süreli koku maruz EGL-4 translocates sırasında.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

Sürekli stimülasyon sırasında çoğu duyusal nöron, sinyale olan duyarlılıklarını azaltarak yanıtlarını adapte eder. Adaptasyon yanıtı, ... yardımcı olur.

Bu videonun genel amacı, bir hayvanın adaptasyon durumunu tanımlayan, deniz elganlarında uzun süreli olfaktör adaptasyonun moleküler okumasının geliştirilmesi ve uygulanmasını detaylandırmaktır. Bu, egg L four olarak adlandırılan bir protein kinaz G'nin yeşil floresan protein molekülü ile işaretlenmesi ve bu protein füzyonunun amfi wing hücreleri tip C veya A WC nöronlarında eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, A WC nöronlarında GFP işaretli egg L four formunu eksprese eden hayvanlar, bakteriyel besin kaynağı OP 50 içeren nematod büyüme ortamı plaklarında kültüre edilir. Ardından, dört gün sonra, bir grup hayvan kültür plaklarından yıkanarak uzaklaştırılır ve uzun süreli olfaktör adaptasyonu teşvik etmek amacıyla 80 dakika boyunca A WC tarafından algılanan bir kokuya maruz bırakılır.Sonuçlar, adapte olmuş hayvanların A WC'sinde GFP etiketli ALE4'ün nükleer lokalizasyonunu, adapte olmamış kontrol hayvanlarında ise GFP etiketli ALE4'ünle sitoplazmik lokalizasyonunu göstermektedir. ALE4'ün fonksiyonel bir kopyası ile iki yeşil floresan protein oluşturarak, A WC'deki ALE4'ün subselüler lokalizasyonunu takip edebilir ve GFP lokalizasyonuna dayanarak hayvanın davranışsal durumunu tanımlayabiliriz. Bu moleküler araç, sürekli nöronal stimülasyon sonrası hücresel çıktının şekillenmesinde çeşitli mutantların veya tedavilerin rolünü hızlı bir şekilde araştırmamıza olanak tanır.Bu Protokol, bu videoya eşlik eden yazılı prosedürde açıklandığı üzere, GFP etiketli egg L four eksprese eden hayvanların oluşturulması ile başlar. Nihai entegre hat IS 500, GFP etiketli egg L four molekülü ise GFP egg L four olarak adlandırılır. IS 500 hayvanlarını 25 °C'de, OP 50 E. coli bakterileri ile ekilmiş standart 10 cm'lik NGM plaklarında kültüre edin. Birinci günde, 25 °C'de kültüre edilmiş plakalardan larva evresi dörtte olan dört ila beş IS 500 hayvanını, hayvanları toplamak ve transfer etmek için "pick" olarak adlandırılan küçük bir platin tel kullanarak OP 50 E. coli ekilmiş 10 cm'lik plakalara taşıyın.Bu işlemi dört ek plaka için tekrarlayın. Plakaları dördüncü günde 25 degrees Celsius'ta inkübe edin. Büyük NGM plakalarındaki yetişkin IS 500 hayvan popülasyonlarını, plakaya basal buffer ekleyip nazikçe çalkalayarak yıkayarak uzaklaştırın.Bu işlem, hayvanların plaka yüzeyinden ayrılarak tampon çözeltiye geçmesini sağlar. Tek kullanımlık cam pipetler kullanarak hayvanları plakadan aspire edin ve 1,5 milliliter einor tüpüne aktarın. Bakterileri uzaklaştırmak için 500 hayvanı s basil ile yıkayarak translokasyon deneylerine başlayın; santrifüj yapmayın.Yıkamalar arasındaki hayvanlar. Bunun yerine hayvanların, sabit bir 1,5 milliliter mikro santrifüj tüpünde yerçekimi ile çökelmesine izin verin. Tüm bakterilerin uzaklaştırıldığından ve NGM plakalarının kontaminasyondan ari olduğundan emin olmak kritiktir; çünkü kalıntı bakteriler translokasyon analizinin sonucunu olumsuz etkileyecektir.S basil ile yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. 100 mililitrelik dereceli bir silindire 100 mililitre S basil tamponu ekleyerek adaptasyon çözeltisini hazırlayın. Aldehit adaptasyonu yapılıyorsa, 100 mililitre ESP basil içerisine 7,5 mikrolitre aldehit ekleyin ve silindiri bir parafmin şeridi kullanarak mühürleyin.Fesleğen ve koku içeren dereceli silindiri nazikçe 30 kez ters çevirin. Homojen bir emülsiyon oluşturmak için, her tüpteki hayvan sayısını 100 ile 200 arasında tutmaya çalışarak tüplerin her birine hayvanlar ekleyin. Biraz pratikle, hayvanlar çöktükten sonra bir paletteki yaklaşık hayvan sayısını göz kararıyla tahmin etmek mümkündür.S. basil yıkamasının ardından, epi orph tüpündeki tüm sıvıyı uzaklaştırın; yeni tüplerden birini pozitif, diğerini ise negatif olarak etiketleyin. Ardından, pozitif adaptasyon mikrosantrifüj tüpüne 1 mL adaptasyon karışımı ekleyin ve negatif adapte edilmemiş kontrol mikrosantrifüj tüpüne 1 mL S. basil ekleyin. Her tüpe 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü kap koruyucusu yerleştirin ve tüpleri 80 dakika boyunca bir rotatöre yerleştirin.80 dakika sonra, hayvanları her yıkama arasında yer çekimiyle çökmelerine izin vererek S basil içinde üç kez yıkayın. Jel elektroforez agrozunu distile suda çözerek beş milimolar sodyum azit içeren %2'lik agroz pedleri hazırlayın. Cam bir mikroskop lamı üzerine sodyum azit içeren tek bir damla eritilmiş agroz yerleştirin ve eritilmiş agroz damlasını düzleştirmek için ilk lamın üzerine hemen başka bir cam mikroskop lamı yerleştirin.30 saniye bekleyin ve ardından mikroskop lamlarını nazikçe ayırarak, her bir lamda yaklaşık bir milimetre boyutunda düz bir aros ped bırakın. Bu noktada, her deneycinin hangi lamların pozitif deney, hangilerinin ise negatif kontrol olduğunu takip etmek için bir anahtar oluşturması zorunludur. Ardından, solucanlar son yıkamadan sonra çökeldiğinde tüm sıvıyı uzaklaştırın ve hayvanları birkaç mikroskop lamının aros pedlerine damla damla ekleyin.Slayt başına hayvan sayısını 50 ile 100 arasında tutmak önemlidir. Slayt başına çok fazla hayvan olması, puanlamayı zorlaştıracak ve sıklıkla dağılım şeklinde bir parlamaya neden olacaktır. Mavi ışık uyarımından sonra, fazla sıvı küçük bir kim wipe kullanılarak aros pedinden emilebilir.0,5 milimetre kalınlığında bir cam lamеli pedin üzerine yerleştirin ve sodyum azidin hayvanları immobilize etmesi için iki dakika bekleyin. Ardından, lamları GFP yumurta L4 lokalizasyon paternini körleme yöntemiyle değerlendirecek başka bir kişiye aktarın. Bu, herhangi bir deney veya yanlılık hatasını kontrol altına alacaktır; her lamdaki 50 ile 100 arasındaki hayvanı, 10x, 40x ve 63x büyütmeli objektiflere ve GFP/RFP filtrelere sahip dik bir floresan mikroskop kullanarak skorlayın.İlk olarak, parlak alan aydınlatması kullanarak 10 x büyütme altında hayvanları bulun. İkinci olarak, parlak alan aydınlatmasını kapatıp RFP filtresini kullanarak A WC nöronunu bulun. Promotör koku.Tek bir DS red, WB ve A WC nöronlarında ekspresyonu yönlendirir. A WC nöronları, daha küçük ve dairesel şekilli olan WB hücre gövdelerine kıyasla karakteristik oval şekilli hücre gövdelerine sahiptir. A WC hücre gövdesi konumlandırıldıktan sonra, GFP filtresine geçiş yapın ve GFP egg L dört lokalizasyonunu nükleer veya sitoplazmik olarak kaydedin.Bir sayıcı kullanmak, deneycinin lamı puanlarken okülerden bakmaya devam etmesini sağlar. İstatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için bu işlem, farklı günlerde en az üç kez tekrarlanır. Uzatılmış koku maruziyeti öncesi ve sonrası A WC içindeki GFP egg L four'ün lokalizasyon paternine bir örnek, uzatılmış koku maruziyeti öncesindeki haliyle gösterilmiştir.GFP egg L four, 80 dakikalık koku maruziyetinden sonra A WC'nin sitozolünde lokalize olur. GFP egg four, davranışsal düzeyde A WC'nin çekirdeğinde lokalize olur. WC'de sitozolik GFP egg four bulunan hayvanlar, noktasal bir koku kaynağına yönelir.Bu grafik, adapte edilmemiş hayvanların kemotaksi deneylerinden elde edilen temsili sonuçlardan oluşturulmuştur. KEMOTAKSİ indeksinin bire yakın olduğuna dikkat edin. A WC içerisinde nükleer G-F-P-E-L four sergileyen hayvanlar, adapte edilen kokunun nokta kaynağına yönelmezler.Bu grafik, evlat edinilen hayvanların KEMOTAKSİ deneylerinden elde edilen temsili sonuçlardan oluşturulmuştur. KEMOTAKSİ indeksinin sıfıra yakın olduğuna dikkat edin. egg L four, A WC nöronlarının çekirdeğine girdiğinde, egg L four artık çekirdekte olmasa bile A WC fizyolojisinde kalıcı ve uzun süreli değişikliklere neden olur.80 dakikalık koku maruziyetinden sonra, hayvanlar adapte oldukları kokunun nokta kaynağını görmezden gelecekler ve bu adaptasyon 120 dakikalık bir recovery süresinden sonra bile devam edecektir. 80 dakikalık koku maruziyetinden sonra, A WC'nin çekirdeğinde GFP Egle four gözlemlenir. Bu nükleer giriş, A WC'de uzun süreli adaptasyonu indüklemek için hem gerekli hem de yeterlidir. 120 dakikalık recovery süresinden sonra, bu hayvanlarda artık nükleer GFP Eagle four görülmez, ancak davranışsal düzeyde adapte oldukları aldehit kokusunun nokta kaynağını hala görmezden gelmeye devam ederler. Kültür süreleri dahil değildir.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem birkaç saat içinde tamamlanabilir.

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Burada yöntemleri C. elegans ilişkisel öğrenme ve kısa ve uzun vadeli çağrışımlı hafıza test etmek için açıklayın. Bu nüfus Testler uçucu koku doğru chemotax solucanlar yetenekleri istihdam ve kemoatraktan bütanon gıda eşleştirme üzerine olumlu dernek kurma. Klima dönemlerinin sayısının artırılması uzun vadeli bellek neden olur.

C. elegans Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Belirli çevresel stres faktörlerine maruz kaldıktan sonra, nematod Caenorhabditis elegans, strese dirençli bir 'dauer' gençlik aşamasına girmek için geniş fenotipik plastisiteye uğrar.  Dauer sırasında nöroplastisitenin kontrollü indüksiyonu ve görüntülenmesi için yöntemler sunuyoruz.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

Daha önce Caenorhabditis elegans'ın sırasıyla kitlesel ve aralıklı eğitim yoluyla kısa ve uzun vadeli ilişkisel anılar oluşturması için protokoller geliştirdik. Burada, C. elegans'ın koşullandırılması için, 1-propanol ve hidroklorik asidi, sırasıyla koşullu ve koşulsuz uyaranlar olarak eşleştirerek, engelleyici ilişkisel hafıza oluşturmak için ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta İki Kimyasalın Eşleştirilmesiyle Engelleyici İlişkisel Öğrenme ve Hafıza Oluşumu

Burada, model organizma C. elegans'ta klasik koşullandırma gerçekleştirerek ilişkisel öğrenmeyi test etmek için bir protokol sunuyoruz. Paradigma, ortamdaki tuz konsantrasyonunu, kemotaksislerini tuza doğru veya tuzdan uzaklaştıran gıdanın varlığı veya yokluğu ile eşleştirmeye dayanır.

Nematod Caenorhabditis elegans'ın Kemotaksisinde İlişkisel Öğrenmenin Ölçülmesi

Bu protokol, C. elegans'taki uçucu seks feromonuna verilen yanıtların çıkarılması ve ölçülmesi için yöntemler oluşturur ve kimyasal iletişim ve navigasyon yörüngesini incelemek için araçlar sağlar.

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Öğrenme ve hafıza gibi bilişsel süreçler sırasında hücresel aktiviteyi incelemenin önündeki önemli bir engel, in vivo görüntüleme hazırlığı için anesteziklerin kullanılmasıdır. Anestezi, Drosophila  da dahil olmak üzere birçok modelde kısa süreli hafızayı ve bilişi bozar.Bu çalışma, yetişkin Drosophila'yı anestezi olmadan in vivo görüntüleme için hazırlamak için benzersiz bir yöntem sunmaktadır.

In vivo (İn canlı) Anestezi Uygulanmamış Drosophila Yetişkin Sineklerde Nöral Aktivitenin Görüntülenmesi

Keşfedin uzun vadeli koku adaptasyonunun moleküler okumasını C. elegans'ta GFP-etiketli EGL-4 kullanarak. Bu yöntem, AWC duyu nöronlarında nükleer yerelleşmeyi görselleştirerek adaptasyon durumunu hızlıca değerlendirmeyi sağlar.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati

Daha fazla video keşfet