Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, suda yaşayan kaplan semenderi retinasından ince doku dilimleri hazırlamak ve bunları fotoreseptörlerden ve ikinci dereceden yatay ve bipolar hücrelerden eşzamanlı tam hücre voltajı kelepçe kayıtları için kullanmaktır. Bu, önce bir semender gözünün diseksiyonu ve retinanın bir nitroselüloz zar parçası üzerinde izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ince retina dilimlerini kesmek ve bunları kayıt odasına yerleştirmektir.

Daha sonra, hazne dik sabit kademeli bir Mikroskop üzerine yerleştirilir ve yama pipetleri retina dilimlerinin üzerine yerleştirilir. Son adım, bir presinaptik, fotoreseptör ve postsinaptik yatay veya bipolar hücreden tüm hücre kayıtlarını elde etmektir. Sonuç olarak, eşleştirilmiş tam hücre kayıtları, sinaptik salınımı manipüle etmek ve retinadaki hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

Retinal dilim hazırlığı ilk olarak Frank Werblin ve Sam Wu'nun laboratuvarlarında geliştirilmiştir.Tek hücreli preparatların aksine, dilim preparatları sağlam ntik teması korumuştur ve tüm mount retina preparatlarının aksine, retinayı dilimlemek çeşitli retina katmanlarını ortaya çıkarır ve tüm farklı hücre tiplerine hazır erişim sağlar. Retina Diliminde. Hazırlıklar, birden fazla hücre için eşzamanlı kayıt ve görüntüleme deneyleri dahil olmak üzere elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılabilir.

Bu hazırlığın, retinal nöronlar arasındaki sinaptik etkileşimleri incelemek için son derece değerli olduğu kanıtlanmıştır. Bu videoda, kaplan semenderi retinası kullanarak dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz ve başarı ile başarısızlık arasındaki farkı yaratabilecek bazı küçük detayları vurguluyoruz. Odayı monte ederek bu işleme başlayın.

Süper fase için bir kanal oluşturmak ve retinol dilimlerini ikinci bir gres vuruşunda, bu iki yağ boncuğunun her birinin birkaç milimetre ötesine gömmek için kayıt odası boyunca sekiz ila 10 milimetre aralıklarla yerleştirilmiş iki boncuk vakumlu gres yerleştirin. Ardından, referans elektrotla sıvı temasını sağlamak için haznenin ucuna küçük bir üçgen Kim mendil parçası yerleştirin. Bundan sonra, cam mikroskobuna karşı düz bir nitroselüloz membran parçası bastırın.

İki küçük boncuk vakumlu gres üzerine kaydırın. Doku dilimleyiciyi hazırlamak için. İki ucu keskin bir tıraş bıçağını dört parçaya bölün.

Ardından bunlardan birini dilimleme koluna takın. İnce bir nitroselüloz filtre kağıdı dilimi keserek tıraş bıçağının kesici kenarının kayıt odasına düz bir şekilde oturduğundan emin olun. Daha sonra, bir semenderi dekapitasyon yoluyla ötenazi yaptıktan sonra, mikroskop altında bir çift küçük Venedik makası kullanarak gözü çekirdeklendirin, gözü çevreleyen yörüngeye bağlayan cildi kesin.

Ardından gözü öne doğru çekin ve göz kaslarını ve optik siniri kesmek için makası altına kaydırın. Daha sonra, enükleasyonlu gözü bir muşamba blok üzerindeki bir pamuk yatağına yerleştirin. Şimdi keskin bir cerrahi bıçakla korneanın merkezinde küçük bir kesi yapın.

İnce Venice makasını kesiye kaydırarak ve kesiği radyal olarak aura Serrata'ya doğru uzatarak korneayı çıkarın. Daha sonra, muşamba bloğunu veya pamuğu kesikler arasında döndürerek aura serrata'nın etrafını dairesel olarak kesin. Göz çevresini tamamen kestikten sonra, korneayı ve lensi göz kabının yanından çekerek çıkarın.

Kalan göz kabını, amfibi tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş muşamba bloğunun sert bir yüzeyine aktarın. Sklerayı tamamen kestiğinden emin olmak için keskin bir tıraş bıçağıyla ince bir testere hareketiyle üçe bölün. Ardından, retina yüzeyi aşağı bakacak şekilde nitroselüloz membranın üzerine bir veya iki parça IUP yerleştirin.

Kalan parçaları ilave tuzlu su ile batırın. Bundan sonra, daha sonra ek dilimlerin kesilmesi ihtimaline karşı bunları bir buzdolabına koyun. Şimdi, IUP parçasını bir çift ince forseps ile nitroselüloz membrana hafifçe bastırın.

Nitroselüloz membranı ve IUP parçasını birkaç damla soğuk amfibi tuzlu su ile batırın. Ardından, nitroselüloz membranın ve iup'nin kenarlarındaki bir parça Kim mendiline dokunarak tuzlu su solüsyonunu boşaltın. Bundan sonra, IUP'yi birkaç damla soğuk amfibi tuzlu su çözeltisi ile nitroselüloz membrana batırın.

Yine, daha sonra retinayı izole etmek için sklera koroid retina pigment epitelini soyun. Retina sıkıca yapışmamışsa, tuzlu suyu bir silme mendiliyle boşaltın. Retinayı nitroselüloz membrana daha sıkı bir şekilde çekmek için salini değiştirin ve gerekirse işlemi tekrarlayın.

Ardından, odayı soğuk amfibi tuzlu su ile doldurun. Doku dilimleyici aşamasına aktarın. Daha sonra retina ve nitroselüloz zarı, tıraş bıçağını nazikçe ama sıkıca bastırarak 125 mikron ince şeritler halinde dilimleyin.

Tüm retinayı dilimler halinde kestikten sonra, retina dilimlerini tek tek kayıt odasının ana kanalına aktarın. Bir dilimi aktarmak için, altındaki hazneyi kaydırırken bir zar şeridini yerinde tutun. Dilimi, haznenin orta kısmının üzerindeyken su altında tuttuğunuzdan emin olun.

Nitroselüloz membranın kenarlarını vakumlu gres şeritlerine gömün ve 90 derece döndürün. Retina katmanlarını görmek için, her parçada retina olmasa bile nitroselüloz zarı cam yüzeye düz bir şekilde bastırın. Yüzey gerilimini kırmaya ve böylece sıvı akışını iyileştirmeye yardımcı olmak için nitroselüloz membran şeritlerini düzenli aralıklarla yaklaşık milimetre yerleştirin.

Dilimler perfüzyon kanalının tüm uzunluğu boyunca yerleştirilene kadar dilimleri tek tek aktarmaya devam edin. Tüm dilimler aktarıldıktan sonra, kayıt odasını dik sabit kademeli bir mikroskop aşamasına getirin. Referans elektrot ucunu amplifikatör kafası üzerindeki bir topraklama kablosuna bağlayın.tage.

Uzun bir çalışma mesafesi kullanarak dilimlere odaklanın, suya daldırma, 40 ila 60 x objektif. Sıradaki süper. Dilimleri dakikada bir milimetre hızında, oksijenle köpürtülmüş amfibi tuzlu su çözeltisi ile kaynaştırın.

Emme hattını haznenin çıkış hattına bağlayın. Ardından, emme iğnesinin eğimli ucunu döndürerek veya haznenin ucundaki kim mendilini çıkış iğnesinin ucundaki açıklıktan daha yakın veya daha uzağa hareket ettirerek girişi dengelemek için çıkışı ayarlayın. Dilimleri loş veya kızılötesi ışık altında inceleyin.

Ardından, toptan satış için bir çift hücre, bir fotoreseptör ve yakındaki bir yatay veya bipolar hücreyi tanımlayın. Hücre içi çözelti ile deneylerden önce hazırlanan Philip pipetinin kaydedilmesi, elektrot tutucusuna monte edilir. Ardından, mikroskop objektifini hafifçe yükseltin.

Fotoreseptör pipetini objektifin altına yerleştirin. Ardından, uç dilimin hemen üzerine gelecek şekilde indirin ve odağı aynı anda ayarlayın. Çok ileri gitmekten kaçınmak için.

Bu işlemi ikinci pipetle tekrarlayın. Ardından, pipet direncini beş ila 10 milivoltluk depolarize edici bir darbeyle kontrol edin. Amplifikatör üzerindeki temel akım seviyesindeki herhangi bir ofseti ayarlayın.

Bundan sonra, hafif pozitif basınç uygulayın ve bu arada postsinaptik pipeti yatay veya bipolar hücre gövdesine temas edecek şekilde konumlandırın. Ardından presinaptik pipeti, bir çubuğun veya koni fotoreseptörünün hücre gövdesine temas edecek şekilde konumlandırın. Direnç salınımını izlerken, postsinaptik pipet üzerindeki pozitif basınç, bazen pozitif basıncın serbest bırakılması bir giga ohm conta oluşturmak için yeterlidir.

Uç direnci 100 mega ohm'un üzerine çıktıktan sonra, eksi 60 milivoltluk bir tutma potansiyeli uygulayın. Daha sonra bir giga om contası elde edildiğinde, geçici pipet kapasitansını iptal edin. Yama kelepçesi amplifikatörünün kapasitans dengeleme devresini kullanarak, eksi 70 milivoltluk bir tutma potansiyeli uygulayarak fotoreseptör pipeti ile tavan prosedürünü tekrarlayın ve pipet kapasitansını iptal edin.

Geçici, daha sonra her hücreye emme uygulayarak yamayı yırtın. Yamanın yırtılması, tüm hücre kapasitansının geçici olarak ortaya çıkmasıyla belirgindir. Şimdi, bir ışık flaşı uygulayarak ve 20 milivoltluk artışlarla eksi 120'den artı 40 milivolta kadar bir dizi voltaj adımı sunarak postsinaptik hücrenin kimliğini fizyolojik olarak doğrulayın.

Hücrelerin sinaptik olarak bağlı olup olmadığını değerlendirmek için 25 ila 100 milisaniye 60 milivolt verin. Fotoreseptöre depolarizasyonu adım atın ve post-sinaptik akımları arayın. İkinci dereceden nöronda, semender retinasının dikey dilimlerindeki nöronlardan gelen ışık tepkilerinin temsili izleri burada.

Koni yatay hücresi ve kapalı bipolar hücrenin tümü, ışık başlangıcına yanıt olarak dışa doğru bir akım gösterir. Buradaki yatay ve bipolar hücre kayıtlarında ışık parlamasını takip eden belirgin içe doğru akım, ışık ofsetinde depolarize olurken fotoreseptörlerden artan glutamat salınımından kaynaklanır. Bipolar hücre, ışık başlangıcında içe doğru bir akımla yanıt verir, bu da metabotropik glutamat reseptörü sinyal kaskadını tersine çeviren bir işaretten ve tripm one kanallarının aktivasyonundan kaynaklanır.

Yatay hücreler ve bipolar hücreler, akım voltaj ilişkileri ile birbirlerinden ayırt edilebilir. Yatay hücreler tipik olarak 500 mega ohm'dan daha düşük bir giriş direnci ile doğrusal veya içe doğru doğrultucu akım voltaj ilişkilerine sahiptir, bipolar hücreler dışa doğru doğruldayan bir akım voltajı ilişkisine ve 0,5 ila iki giga ohm arasında daha yüksek giriş direncine sahiptir. Bu şekil, bir koni yatay hücre çiftinin ve bir koni kapalı bipolar hücre çiftinin kayıtlarından elde edilen temsili sonuçları göstermektedir.

Her durumda, koniyi eksi 70 milivoltluk bir tutma potansiyelinden eksi 10 milivolta depolarize etmek, koni içinde voltaj kapılı bir kalsiyum akımı uyandırdı ve hızlı içe doğru postsinaptik hale geldi. Yatay veya bipolar hücreli Retina dilimindeki akım. Preparatlar, retinanın anatomisi ve fizyolojisi ile ilgili yüzlerce çalışmada kullanılmıştır.

Aynı anda birden fazla hücreden kayıt ve görüntülemeyi kolaylaştırdıkları için birden fazla hücrenin yanıtlarını aynı anda incelemek için özellikle avantajlıdırlar. Bu videoyu izledikten sonra, retinayı nasıl inceleyeceğinizi, ince retina dilimlerini nasıl keseceğinizi, bunları kayıt odasına nasıl yerleştireceğinizi ve sinaptik olarak bağlı benlik çiftlerinden toptan kayıtları nasıl alacağınızı iyi anlamış olmalısınız.