Name: Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Öğrenin, yetişkin farelerden spermatogonyal kök ve progenitör hücre hatlarını uzun vadeli kültür etmek için feeder hücreleri kullanarak seri zenginleştirme yöntemini. Bu teknik erkek üreme biyolojisi araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık New York Dışişleri Bakanlığı (C026878) tarafından desteklenmiştir. MS New York Kök Hücre Vakfı-Druckenmiller Fellow idi. Dimes Vakfı Mart Araştırma Bursu No 5-FY11-571 Part desteklenir.

1. Besleyici Hücrelerinin Hazırlanması Aşağıda açıklanan tüm reaktifler (Tablo 1 ve 2) steril bir şekilde hazırlanması gerektiğini unutmayın. Bu protokol, erişkin fare somatik hücre testis dönüştürülmüş bir türevidir ve başka bir yerde 3 tarif edilmiştir besleyiciler JK1 hücre hattı (Hücre Biolabs, Inc, katalog # CBA-315) kullanılır. Bütün hayvan prosedürleri kurumsal kurallar ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmesi gerektiğini de unutmayın. <ol><li> JK1 hücreler kültür korunur ve geçit 39 başarıyla besleyiciler kadar kullanılabilir. Filtre ile sterilize edilmiş besleyici büyüme ortamı 10 ml ile 100 mm&#39;lik bir hücre kültürü çanağı (BD Falcon, katalog # 353003) kültür içinde hücreleri JK1 (DMEM ile desteklenmiş% 10 fetal bovin serumu [FBS], 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler). Kültür% 95 izdiham ulaştığı zaman, hücrelerin oranı 01:06 -1:10 ayrıldı. </li><li> Konfluent JK1 besleyici hücre mono ortamı çıkarınkatmanı. </li><li> Kalsiyum ve magnezyum olmadan bir kez PBS ile hücre tabakası yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış tripsin / EDTA, 1x (% 0.05 trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog # 25-051-CI) ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5-10 dakika inkübe edilir. </li><li> Besleyici büyüme ortamında eşit hacmi ile tripsin inaktive eder. Hücreleri toplamak ve 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj. Besleyici büyüme ortamında hücreleri yeniden askıya. </li><li> Kuyu kapağı ve oda sıcaklığında 5 dakika sonra kaldırmak için yeterli% 0.4 jelatin solüsyonu ilave edilerek ön-kaplama, çok iyi hücre kültür plakaları. </li><li> Levha ~ jelatin kaplı hücre kültürü plaka mm 2 başına 250 hücre (örneğin 48-iyi ya da 6-biçimi). 16 ila 24 saat süre ile 37 ° C &#39;de kültür inkübe edin. </li><li> Kuyulardan kültür ortamı çıkarın. DİKKAT: hücre büyümesi inaktive etmek için DMEM içinde seyreltilmiş 10 ug / ml &#39;de mitomisin-C taze bir çözelti eklemek için, her bir kuyucuğa (örneğin, 200 ul / çukur bir 48 kuyulu plakanın için). Mitomisin-C toksiktir. Dikkatlice taşıyınız ve atın. Inkübe37 ° C&#39;de 4 saat için. </li><li> Hücrelerinden mitomisin-C çözüm çıkarın. Kaplama kök hücreler önce DMEM ile 3 kere yıkayın. </li><li> Besleyici hücreler kuyulardan DMEM çıkarın ve yeterince kök hücre, orta (100 ul / iyi bir 48 kuyulu plakanın; bkz. Tablo 3) ekleyin pasajı sırasında besleyiciler kuruma önlemek için. Besleyiciler içeren kuyuların belirtilen boyutlarda kullanarak, bölümler 3.1 veya 3.4 &#39;de aşağıda açıklandığı gibi, aynı gün DGM&#39;lerin ekleyin. </li></ol> 2. Fare Testis Doku Ayrılma Donör Germ Hücreleri Edinme <ol><li> Hasat yetişkin fare steril moda testis ve geçici bir kapalı Petri (herhangi bir sıvı olmadan eklenen) testislerde saklayın. Desikasyona önlemek ve hücre canlılığı korumak için çanak buz üzerinde hemen yerleştirilir gerekir. </li><li> ¾ mesafesi thr - steril ince forseps ve hücre kültürü kaputu ince bir makas kullanarak, tamamen testis (yani, kesme ~ ½ transecting olmadan tunika albuginea bir transvers kesi yapmakough) ve plaka bir köşeye seminifer tübüller sıkmak için forseps kullanın; ıskarta tunika ve ekli doku. Böylece onun bütünlüğünü korumak ve buharlaşmasını önleyen, doku soğutulmuş tutmak boyunca buz üzerinde plaka tutun. </li><li> Buz üzerinde plaka tutarak hızla, ince makas makas testis başına en az 3 dk tübüller kıyma. </li><li> 50 ml konik tüp tübül parçalarını toplamak ve albümin soğutulmuş PBS /% 1 sığır serum ~ 40 ml yıkayın. </li><li> Spermatozoa ve enkaz tübül parçalarını ayırmak için 10 dakika boyunca 60 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içinde, önceden ısıtılmış ayrışma tampon testis başına 3 ml (DMEM,% 0.05 tripsin,% 0.03 collagenase tip I, 80 U / ml DNAz I ve% 0.5 sığır serum albümini olarak pelet tekrar süspansiyon; bak Tablo ayrışma tampon daha özel ayrıntıları için 2). </li><li> Bir üst düzeye çıkarmak için 15 dakika için 37 ° C &#39;de 150 rpm bir çalkalama kümesindeki bir raf yatay olarak konik boru yerleştiringitation. </li><li> Ayrışmamış parçalarını ayrı tek hücreler için 10 dakika boyunca 60 xg&#39;de aşağı spin. </li><li> Sonraki adıma kadar pelet içeren parçaları kaydedin. Adım 2,8 süpernatant toplayın ve disosiyasyon tamponu nötralize etmek için 3 ml DMEM/10% fetal sığır serumu ekleyin. Geçici buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> Adım 2.9 &#39;dan kaydedilen pelet ile 2,6-2,7 adım adım 2.8 sonra kalan re-digest parçalar için tekrarlayın. </li><li> Disosiyasyon tampon nötralize etmek DMEM/10% FBS eşit hacimde ekleyin. </li><li> Adım 2.9 kaydedilen hücre süspansiyonu ile adım 2.11 dan recombine süspansiyon. 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Testisler çifti başına 16 ml&#39;lik bir hacme kök hücre ortam içinde yeniden süspanse pelet (bkz. Tablo 3). </li></ol> 3. Testis Hücre Süspansiyon Kaplama <ol><li> Hücre süspansiyonu Plaka 2 ml başına iyi bir 6-plaka içeren besleyici hücreler 37 &amp; bir hücre kültürü inkübatör mitomisin-C ve yer ile mitotik-inaktivedeg; C% 5 CO 2. </li><li> 48 saat, aspirat orta sonra 2 ml taze orta ekleyin ve inkübatör dönmek. </li><li> 48 saat sonra, her bir kuyunun 0.5 ml taze kök hücre orta ekleyebilir ve inkübatör dönmek. </li><li> 48 saat sonra, daha sonra hücrelerin haftada üç kez daha sonra gibi büyük, gizli koloniler (&gt; 50 hücreleri) (7 ile 21 gün içinde) görününceye kadar takip besleyebilir. Her hafta beslenme birinci ve ikinci (örneğin Pazartesi ve Çarşamba) için orta ~ 50% kaldırmak ve taze orta hacimce geri% 50 ekleyin. Üçüncü besleme için (örneğin Cuma), tüm orta aspirat ve 2 ml taze ortam ile değiştirin. Bu yaklaşım, tam bir ortam değişikliği kaçınma kültür ortamı içine salgılanan 9 parakrin sinyallerin konsantrasyonlarda dalgalanmaları en aza indirir mantık dayanmaktadır. </li></ol> 4. İlk Passage Colony Picking <ol><li> Geçişli olması kuyulardan içeren kolonilerden orta çıkarın ve taze kök hücre ortamı ekleyin. </li><li> 10x objektif kullanarak kolonileri tanımlayın. Mikroskop hafifçe de-odaklı ile iyice kenarında SSC koloniler hücreler bu yana, zor ya da tek bir hücre sınırlarının ayırt etmek mümkün olan pek çok 11-12 mikron çaplı hücreler, oluşan homojen parlak kümeleri gibi görünür (Şekil 1A) kaynaşarak görünür. Sigara SSC kolonileri gözle görülür sınırları (Şekil 1A, inset) ile, daha karanlık, daha taneli, az ya da çok homojen görünebilir. </li><li> 50 ul pipetteman seti ile, bir 200 ul pipet kullanarak, ilk kuyudan orta sürebilir ve ucu ıslatmaya sınırdışı. Sonra, yavaşça hızla ucu (Şekil 1B) içine emiş tarafından koloni çıkarmak için orta 50 ul çekmeden ucuyla koloni dürtmek. </li><li> Stem hücre ortamı (Şekil 1C) 100 ul ile inaktive edilmiş besleyici hücreleri ihtiva eden bir 48-kuyulu plakanın içine de bir koloni içeren ortam Expel. </li><li> Adımı tekrarlayınKuyu başına 500 ul aşmadan aynı zamanda 8 koloniler 4.3 ve ekleyebilirsiniz. </li><li> Geçit tek SSC kolonileri ile 48 plaka ek kuyuları hazırlamak için 4,3-4,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Wells 7-14 gün veya 500 hücre (Şekil 1D) ortaya çıkmış büyük kümeleri sonra bölmek için hazır olacak. </li></ol> 5. Ufalama tarafından DGM&#39;lerin sonraki Genişleme ve Pasajlanması <ol><li> Geçit birinde Hücreleri 01:06 (her 7 gün) sonra aşağıdaki gibi ilk 3 pasajlar için 1:2 bölünmüş oranı ve ardından 01:04 14 gün sonra taze besleyiciler üzerine kadar pasajlandı edilmelidir. Yavaşça hücreler boyunca orta yıkama tarafından 1 ml pipet ile bir yarı-birleşik de kapalı koloniler (örn. ~ 300.000 DGM&#39;ler / iyi 6-plaka) çiğnemek. Koloniler ayırma görülebilir. Sıvı akışı ile çok fazla kuvvet istenmeyen besleyici hücreler çok çıkmasına sebep olacaktır. </li><li> Için 300 xg&#39;de konik bir tüp ve santrifüj tritüre hücreleri toplayın5 dk. Not: araştırmacı tarafından arzu edildiği takdirde, tripsinizasyonla adım burada güvenli bir şekilde ilave edilebilir. </li><li> Süpernatant aspire ve iyice koloniler bozmaya yukarı ve aşağı pipetleme taze kök hücre ortamda yeniden askıya. </li><li> Mitomisin-C ile inaktive taze hazırlanmış besleyici hücreler levhalar DGM&#39;ler gibi 1. bölümde anlatılan. </li><li> Hücreler haftada aşağıda üç kez besleyin. Birinci ve ikinci besleme için (örneğin, Pazartesi ve Çarşamba) taze orta hacimce% 50 ekleyin. Üçüncü besleme için (örneğin Cuma), tüm orta aspirat ve 2 ml taze ortam ile değiştirin. Tabaklar 7-10 gün içinde confluent olacak. Kültürler somatik hücreleri 10 germ hücreleri ayırt etmek için (örneğin fare germ hücre belirteci GCNA kullanarak) immünboyama esas 5-7 pasajlar sonra&gt;% 98 germ hücrelerinin (yani, &lt;% 1 kirlenmesine somatik hücre) oluşmalıdır. Not: Bu yöntemler Kurum tarafından belirlenen düzenlemeler ve gereksinimler ile uyum içinde geliştirilmiştirWeill Cornell Medical College arkadaşları Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi. </li></ol>

<ol><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li>
<li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125%2B+germline+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li>
<li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li>
<li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li>
<li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li>
<li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li>
<li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li>
<li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li>
<li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li>
<li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545(2012).</li>
<li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%28%2B%29+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li>
<li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li>
</ol>

MS JK1 hücreleri dağıtmak Hücre Biolabs, Inc bir lisans ile Weill Cornell Tıp Koleji&#39;nden telif alır.

Erişkin testis kaynaklı besleyici hücreler kullanılarak erişkin DGM&#39;ler türetmek için bu yöntem sağlam ve ortak genetik kökenden (örneğin FVB, C57Bl6 ve karma 129SV/C57Bl/6) ve farklı mutant suşlar 2,3,7,14 istihdam edildiğinde başarmıştır. 7 Aslında, kültür sistemi tarafından oluşturulan in vivo mikroçevrede yetişkin DGM&#39;ler - (- / hayvan plzf durumunda olduğu gibi) sürdürülmesi için genetik duvarlar bazılarının üstesinden gelmek için yeterlidir. Bu be...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Dissosiyasyon arabelleği için Seyreltici </td></tr><tr><td> Tripsin / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Kök hücre baz ortamı (StemPro-34) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10639-011 </td><td> Shinohara ark başına takviyesi gerektirir. (2003) * </td></tr><tr><td> Hücre orta takviyeleri Kök </td><td> çeşitli </td><td> Tablo 3&#39;e bakınız </td><td> Shinohara ark başına takviyesi gerektirir. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 hücrelerin </td><td> Hücre Biolabs, Inc </td><td> CBA-315 </td><td> Başına Seandel ark erişkin testis stromal hücreleri ile ikame edebilir. (2007) </td></tr><tr><td> mitomisin-C (DİKKAT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Toksik; dikkatli olun. </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Su içinde% 0.4 çözümü </td></tr><tr><td> EVOS xl dijital inverted mikroskop </td><td> Gelişmiş Mikroskopi Grubu </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Özel reaktifleri ve ekipmanları. * Çizelge 3&#39;e bakınız </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Dissosiyasyon arabelleği için Seyreltici </td></tr><tr><td> tripsin (1:250) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 27250-018 </td><td> Ayrılma tamponu: 0.05 Final% ağırlık / hacim </td></tr><tr><td> kollajenaz, 235 U / ml tip I </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Ayrılma tampon: Final% 0.03 ağırlık / hacim </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Ayrılma tampon: Final 80 U / ml </td></tr><tr><td> sığır serum albümin </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Ayrılma tampon: 0.5 Final% ağırlık / hacim </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 2. Ayrışma tampon </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 Besin takviyesi </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Ek takviyeleri ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM vitamini çözüm </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> sığır serum albümin </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik Çözümü </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glikoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml &#39; </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progesteron </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml &#39; </td></tr><tr><td> fetal bovin serumu </td><td> değişken </td><td> n / a </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Sığır sanal-transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 ug / ml </td></tr><tr><td> ensülin </td><td> İkizler Bio-Ürünler </td><td> 700-112P </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> İnsan GDNF </td><td> Yaşam Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml &#39; </td></tr><tr><td> insan bFGF </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml &#39; </td></tr><tr><td> fare EGF </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putressin </td><td> Araştırma Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 uM </td></tr><tr><td> sodyum selenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> piruvik asit </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ug / ml </td></tr><tr><td> DL-laktik asit </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 21985-023 </td><td> 50 uM </td></tr><tr><td> askorbik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 uM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 3. Hücre orta Kök </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Not: orta kullanmadan önce aşağıdaki takviyeleri ekleyin. Filter 4 ° C&#39;de sterilize etmek ve tutmak Ortam, en az 2 hafta boyunca stabildir. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Biz görünürde herhangi bir zararlı etki olmaksızın farklı üreticilerin, formülasyonları ve / veya bu reaktiflerin lot numaraları istihdam var. Genel olarak, hücre kültürü sınıf reaktifler kullanılmalıdır. </td></tr></tbody></table>

uzun vadeli yetişkin fare ssc hatları türetilmesi için kültür spermatogonial kök ve progenitör hücrelerin seri zenginleştirme (dgm)

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial sapı ve testis progenitör hücreler (DGM&#39;ler) yetişkin memeli kök hücreler klasik bir örneği temsil ve hayvanın neredeyse ömür boyu fertilite. In vivo kendini yenileme ve farklılaşma yöneten kesin mekanizmalar çalışmaya zor olsa da, çeşitli sistemler özel kültür ortamı ve 1-3 besleyici hücreler bir arada kullanarak in vitro fare DGM&#39;ler yaymak için önce geliştirilmiştir. DGM&#39;lerin biyoloji içine vitro baskınlarınızda Çoğu yetişkin hücre hatları 4 temininde zorluk nedeniyle muhtemelen yenidoğanlarda, hücre hatları elde var. Ancak testis Birçok fare suşları yaş ~ 5 haftaya kadar olgun devam. Erken post-natal dönemde, dramatik değişiklikler testisin mimarisi ve somatik ve çok sayıda kök hücre ile ilgili ifade düzeylerinde değişikliklere dahil spermatojenik hücrelerde, hem de biyoloji meydanagenler. Bu nedenle, neonatally-türetilmiş SSC hatları tamamen erişkin testis kararlı bir duruma ulaşmıştır sonrasında da devam eden yetişkin DGM&#39;lerin biyoloji recapitulate olmayabilir. Çeşitli faktörler tarihsel yetişkin SSC hatlarının üretim engellemiştir. Birincisi, fonksiyonel kök hücrelerinin oranını intrinsik veya ekstrinsik faktörler 5,6 nedeniyle ya, yetişkinlik döneminde azalabilir. Ayrıca, diğer yetişkin kök hücreler gibi, bu immunoselection veya diğer sıralama stratejileri 7 bir arada kullanarak olmadan toplam erişkin testis hücreleri yeterince DGM&#39;ler zenginleştirmek için zor olmuştur. Yaygın olarak kullanılan stratejilere diğer hücre tipleri 8 için kök hücreleri, daha yüksek bir oranı nedeniyle donör hücrelerinin kaynağı olarak krip farelerin kullanımını içerir. İlk kültürden somatik hücre çıkarılması SSC hayatta kalmak için gerekli olan kök hücre niş ile etkileşimleri bozan hipotezini dayanarak, daha önce yetişkin l türetmek için yöntemler geliştirdiimmunoselection veya inmemiş bağış gerektiren ziyade kültür DGM&#39;lerin seri zenginleştirme istihdam yok ines, SESC 2,3 olarak bundan anılacaktır. Aşağıda açıklanan yöntem testiküler stromal hücre hattı (JK1) 3 oluşan besleyiciler üzerinde hücrelerin kaplama ardından yetişkin donör seminifer tübüller, dissociating erişkin SSC hatları türetmek için basit bir prosedür gerektirir. Seri Through olmayan germ hücreleri kirlenmesine, güçlü savunucusu pasajlanmasını DGM&#39;lerin beraberinde zenginleştirme ile kültürden tüketilmiştir. Bu şekilde üretilen Kültürler uzun süreli kendini yenileme kabiliyeti esas DGM&#39;lerden ihtiva eden çeşitli evrelerinde de spermatogonia bir karışımını içerir. SESC yöntemin en önemli noktası, bir kökten farklı mikroçevresindeki vitro uzun vadeli kendini yenileme in vivo kendini yenileme gelen zor geçiş yapmak için DGM&#39;ler sağlıyor olması, kirletici ücretsiz, uzun vadeli SSC çizgiler üretirsomatik hücre, ve böylece DGM&#39;lerin sonraki deneysel işleme sağlar.

Geçit sıfır vahşi tip görünümü, 7 gün sonra yetişkin SSC koloniler Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Üç-boyutlu koloniler üzerine artan DGM&#39;lerin çoklu katmanlar ile besleyiciler tarafından tevdi besleyiciler veya ast ekstraselüler matriks bağlanmış düz bir hücre tabakası oluşmaktadır. Sağlıklı DGM&#39;ler parlak refraktil ve tekdüze 11-12 mikron çaplı olmasına karşın, hücre kenarlıkları ayırt etmek zordur ve sömürgelerin büyüklüğü de içinde ve farklı fareden hazırlanan kuyuları arasındaki, hem son de...

Erişkin farelerin spermatogoniumların ve progenitör hücre hatları türetmek ve korumak için basit bir yöntem sunulmuştur. Yöntemi yetişkin fare testis somatik hücre bölmesi kaynaklanan besleyici hücreler kullanır. Bu teknik transgenik, knock-out dahil, ortak fare suşları, uygulanabilir ve knock-fareler.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin fare, spermatogonia, kök ve progenitör hücrelerin veya SSC'lerin uzun süreli kültürlerini oluşturmaktır. Bu, önce tonik olarak inaktive edilmiş besleyici hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, erişkin testis dokusunun enzimatik ayrışması ile bir testis hücresi süspansiyonu hazırlanır.Daha sonra testis hücreleri, SSC kolonilerinin oluşmasına izin vermek için besleyici hücrelerin üzerine kaplanır. Prosedürün son adımı, küçük kültür kuyularında alt kültür için varsayılan SSC kolonilerini manuel olarak seçmektir. Sonuç olarak, SSC'lerin birçok pasaj boyunca uzun süreli hücre yenilenmesi ve genişlemesi, in vitro olarak, germ hücrelerinin veya daha spesifik olarak SSC'lerin geniş çapta eksprese edilen belirteçleri için immüno-boyama ile doğrulanabilir.Ve in vivo SSC transplantasyonu kullanılarak fonksiyonel analiz ile. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü küçük SSC kolonilerinin faz mikroskobu ile tanımlanması son derece zordur. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü koloni toplama adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü SSC kolonilerini kültürlerin erken aşamalarında bulunan diğer hücre tiplerini

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Bu video protokolü, embriyonik gün 14-fare beyninde ganglion eminences nöral kök hücrelerin izolasyonu ve genişleme için neurosphere testinin uygulama göstermektedir.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Erişkin nöral kök hücrelerin (aNSC'ler) genişletilmesi için kültür sistemlerinin kurulması, aNSC'lerin tedavi için incelenmesine ve uygulanmasına olanak sağlar. Subkallozal bölge (SCZ) son zamanlarda yetişkin farelerde yeni bir nöroblast oluşturan bölge olarak kabul edilmiştir. Burada, SCZ-aNSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Öğrenin, yetişkin farelerden spermatogonyal kök ve progenitör hücre hatlarını uzun vadeli kültür etmek için feeder hücreleri kullanarak seri zenginleştirme yöntemini. Bu teknik erkek üreme biyolojisi araştırmalarını destekler.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM) (Video) | JoVE Journal

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

Daha fazla video keşfet