LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

Bu prosedürün amacı, yüksek verimli deneyler için yaprak şekli ölçümünü otomatikleştirmektir. Bu, önce yaprakların diseke edilmesi ve düz yataklı bir tarayıcı ile görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, yaprakları tespit etmek ve ölçmek için yaprak J eklentisini kullanmaktır.

Üçüncü adım, yaprakları mikroskopi için hazırlamak ve bunları bir bileşik mikroskop kullanarak fotoğraflamaktır. Son adım, dokunmatik ekranlı bir tablet kullanarak elde edilen görüntülerdeki satış çizgilerini izlemektir. Sonuç olarak, sonuçlar, bu görüntü analizi kombinasyonu yoluyla yaprak şekli, hücre boyutu ve hücre sayısındaki farklılıkları gösterebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı hızıdır. Manuel ölçümden yaklaşık altı kat daha hızlıdır. Bireyler bu yöntemin zorlanabileceğini biliyorlardı çünkü uygun yaprak yerleşimi aşağı akış analizi için kritik öneme sahiptir ve yaprakları slaytlara monte etmek teknik olarak zor olabilir.

Bu yöntem için ilk fikri, analiz etmemiz gereken yaklaşık 15.000 yaprağımız olduğunu fark ettiğimde aklıma geldi ve bunu elle yapmak aylar sürecek ve inanılmaz derecede sıkıcı olacaktı, bitki diseksiyon tekniğinin nöro zue'ye neden olacağını gösterdi. Laboratuvarımdan bir araştırma bilimcisi 8,5 x 11 inç şeffaflık sayfaları hazırlayarak başlayın. Her bir tabaka, bir bitkinin yapraklarını barındıracak kadar büyük dikdörtgen çerçevelere bölünmeli, yaprakların kurumasını önlemek için bir örtü görevi görmesi için basılı tabakaya ikinci şeffaflık tabakasını inceltmelidir.

Bitki, genotip ve büyüme durumu ile etiketleyin. 26. dayle bitkilerinin yapraklarını inceleyin. Şeffaflığın üzerindeki yaprakları en küçüğünden en büyüğüne doğru taktik sıraya göre düzenleyin.

Kenarlıklara dokunmadan veya diğer yaprakların üzerine binmeden yaprakları çerçeve içinde dikey olarak konumlandırın. Aksi takdirde, ortaya çıkacak sorunlar ortaya çıkacaktır Analiz sırasında, oryantal yaprakların dikey olarak değmemesi, çerçevelenmesi, üst üste binmemesi ve yaprakların düzenlenmesi önemlidir. Yaprakları düz tutmak için ikinci boş şeffaflık sayfası ve bir raf ile sandviçleyin.

Ardından, inç başına en az 600 nokta çözünürlüğe sahip düz yataklı bir tarayıcı kullanarak bir görüntü oluşturun. Eklentiyi yükleyerek başlayın. J görüntüsünü indirin ve yaprak jja dosyasını J görüntüsünün eklentiler klasörüne sürükleyin. J görüntüsü kullanıldığında, yaprak J eklentisi artık kullanılabilir olacaktır.

Resim J'deki yaprak resim dosyasını açmaya devam edin.Resim J'nin sürüm 1.45 s veya üzeri olduğundan emin olun. Görüntü renk bölme kanallarını tıklatarak görüntüyü kırmızı, yeşil ve mavi olmak üzere üç renk kanalına bölün. Ardından, mavi kanaldaki görüntüye bir eşik uygulayın.

Şimdi dikdörtgen seçim aracını kullanarak bir bitkiden tüm yaprakları seçin ve ardından yaprak J eklentisini seçin. Eklenti şimdi, deney grubu ve genotip gibi deneyin çeşitli koşullarının ayarlanmasına izin veren bir kutu açacaktır. Devam etmeden önce bu seçenekleri düzenleyin, ardından ilgili bölgedeki seçili yapraklar için koşulları seçin ve açıklayıcı bir ad girin.

Devam düğmesine basın ve J yaprağı, her yaprağı benzersiz bir ROI görüntüsüyle otomatik olarak özetleyecektir. J rutinleri bıçağa elips şeklinde sığar ve gerekirse bu elipsin ana ve küçük eksenlerini hesaplar. ROI yöneticisi penceresini kullanarak izleme çizgilerini düzenleyin.

Harici monitör olarak bağlanan dokunmatik ekranlı bir tablet bu prosedür için yararlı olabilir. Sınırlar doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, düğmesine basarak analizi gerçekleştirin. Tamam, şimdi J yaprağı, yaprak bıçağının taç yaprağı uzunluğunu ve çeşitli geometrilerini verir.

Son olarak, ölçüm sonuçlarını ve ilgili bilgileri bir elektronik tabloya aktarın. Yaprakları taradıktan sonra F-A-A-F-A'ya sabitleyin. Sabit bir yaprak altı aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir.

Yaprakları görüntülemeden bir veya iki saat önce ileri doğru hareket ederek, FAA fiksatifini klorohidrat çözeltisine değiştirerek yaprakları temizleyin. Temizlendikten sonra, bir bileşik mikroskop görüntüsünde 40 x büyütme kullanarak, her yaprağın merkezinin mesil tabakası ana damarın her iki tarafında, trikomların veya damarların yakınındaki hücrelerden kaçınarak, trikomlar yukarı bakacak şekilde yaprakları slaytlara monte edin. Görüntü işlemedeki zorlukları önlemek için, yaprakları monte ederken slaytlardaki tüm hava kabarcıklarını gidermek ve bir sonraki adımda odak içi görüntüler elde etmek önemlidir.

İstenen görüntüleri topladıktan sonra, resim J'de bir tane açın ve dokunmatik ekranlı tablet ve bir ekran kalemi yardımıyla görüntü JROI yönetici aracıyla yaprak hücre ana hatlarını izleyin. Bu, LEAF J eklentisini kullanmaz. Deney için LEAF J'yi kullanmadan önce, eklentinin doğruluğu ve hızı deneyimli bir araştırmacınınkiyle karşılaştırıldı. Genel.

Leaf J, manuel hesaplamalardan daha hızlı bir şekilde 5.7'yi tamamladı ve iki yöntemden elde edilen verilerin karşılaştırılması, sonuçların karşılaştırılan 3.532'nin ölçülen tüm parametreleri için sıkı bir şekilde ilişkili olduğunu gösterdi. Veri noktaları 172 aykırı değerlerdi. Bu aykırı değerlerden 29'u LEAF J eklentisinden kaynaklanıyordu, insan hatasından kaynaklanan 143'ten çok daha az.

Manuel ölçüm sırasında, yaprak J o zamandan beri hata sayısını daha da azaltmak için güncellendi. LEAF J ölçümlerine güvenerek, karışık efektler modeli kullanılarak gölgeden kaçınmayı test etmek için kullanıldı. Tedavi ve yaprak sayısı sabit etkilerdi ve replikasyon rastgele bir etki olarak oldu.

Birçok parametre gölge işleminden önemli ölçüde etkilenmiştir. Alternatif olarak, bazı parametreler gölgeden önemli ölçüde etkilenmedi. Hücre parametrelerinin tablet destekli görüntülü analizi kullanılarak, 224 bitkinin 877 yaprağından toplam 8.629 hücre olmak üzere 67 Arabidopsis ANA genotipi incelendi.

Genotipler daha sonra altı sınıfa ayrıldı. Çoğu genotipin normal bir hücre boyutu ve sayısı vardır. Bununla birlikte, birkaçı normal hücre sayısı ile daha büyük hücre boyutuna sahipti.

Bu prosedürü denerken, bitkilerinizi yetiştirirken randomizasyon ve deneysel tasarım kullanmak önemlidir, Formaldehit ve klorhidrat ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu yüzden bu işlem yapılırken eldiven giymek ve çeker ocakta çalışmak gibi önlemler alınmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürü izleyerek kendi deneysel koşullarınızı kullanarak yaprak ve hücre şekli fenotiplerinin yüksek verimli taramasının nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.

RNA dizilimi gibi ek yöntemler, hangi genlerin etkili bir şekilde şekillendiği gibi soruları yanıtlamak için kullanılabilir.