Name: Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin fare beyin dilimlerinde nikotinik asetilkolin reseptör fonksiyonunu yerel ilaç uygulaması ve yama kelepçesi kaydı ile incelemeyi. Bu yöntem canlı nöronlarda iyon kanalı aktivitesini hızlı ve lokalize olarak ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe DA030396 tarafından desteklenmiştir. Yararlı tartışma ve yazının eleştirisi için Drenan laboratuar üyeleri sayesinde. Mi Özel sayesinde erişkin fare beyin dilimleri ile ilgili tavsiyeler için teknik yardım ve Jonathan Thomas Ting için Kim Ran.

1. Beyin Dilim Hazırlama ve Elektrofizyoloji için çözümler hazırlanması <ol><li> Beyin kesitleri hazırlanması için çözümler daha önce 3, 4 tarif edilmiştir. 93. N-metil D-glukamin, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25: N-metil D-glukamin (NMDG)-tabanlı olarak aşağıdaki bileşime sahip bir kesme ve geri kazanım solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması glikoz, 5 Na + askorbat, 2 tioüre, 3 Na + piruvat, 10 MgSO4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl2 • 2H 2 O. NMDG ile 300-310 mOsm ayarlayın. 10 N HCI ile 7,3-7,4 pH ayarlayın. <ol class="lalpha"><li> Her 2 M stok çözeltiler için Millipore suda MgSO4 • 7H 2 O ve CaCl2 • 2H 2 O çözülür. </li><li> Listelenen sırayla diğer bileşenleri tartılır ve çözülmekte isida Millipore su ile kısmen dolu bir ölçülü balona ekleyin. Her eklendikten sonra, dolguMillipore su ile ölçülü balonda. </li><li> PH ölçün ve 10 N HCI ile ayarlayın. </li><li> Osmolarite ölçün ve gerekirse NMDG ile ayarlayın. </li></ol></li><li> 92 NaCl, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glikoz, 5 Na + askorbat, 2 tioüre, 3 Na: aşağıdaki kompozisyonun yapay serebrospinal akışkan (aCSF) (mM), HEPES tutma hazırlanması + piruvat, 2 MgSO4 • 7H 2 O, 2 CaCl2 • 2H 2 O Sukroz ile 300-310 mOsm ayarlayın. HC1 veya NaOH ile pH&#39;ı 7,3-7,4 için ayarlayın. <ol class="lalpha"><li> Listelenen sırayla bileşenleri tartılır ve çözülmekte isida Millipore su ile kısmen dolu bir ölçülü balona ekleyin. Her şeyi bir kez eklendiğinde, Millipore su ile ölçülü balona doldurun. </li><li> PH ölçün ve gerekirse NaOH veya HCl ile ayarlayın. </li><li> Osmolarite ölçün ve sukroz Gerekirse ayarlayın. </li></ol></li><li> 124 NaCl, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 glikoz, 2 MgSO4 • 2 7H O, 2. CaCl2 • 2H 2 O.: Aşağıdaki bileşim standart aCSF kayıt solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması Sukroz ile 300-310 mOsm ayarlayın. HC1 veya NaOH ile pH&#39;ı 7,3-7,4 için ayarlayın. </li></ol> 2. Akut Beyin Dilimleri hazırlanması <ol><li> Daha önce 3, 4 tarif edildiği gibi beyin dilim kesme ve geri kazanım yapılır. Kabarcık iki kristal yemekleri% 95 oksijen /% 5 CO 2 gazı (carbogen), buz üzerinde bir tabak, 33 de diğer ° C ile kurtarma çözümü NMDG dolu </li><li> Kabarcık bir kristal çanak oda sıcaklığında carbogen ile aCSF tutma HEPES ile doldurulur. </li><li> Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip) ile erişkin fare (2 ile 12 ay arası) uyuştur. Hayvan ayak tutam hiçbir yanıt olduğunda prosedürü ile devam edin. </li><li> Gerekirse, daha sonra genotip için bir kuyruk doku örneği kestihayvan ing. </li><li> Göğüs boşluğu açın, kalp maruz ve inen aorta klemp. Sağ atrium yaralamak. </li><li> Transkardiyal 0-4 ° C NMDG-kurtarma çözümü ile 5-10 ml hayvan serpmek. </li><li> Hayvan başını kesmek, beyin çıkarın ve 1 dakika süreyle 4 ° C NMDG-kurtarma çözümü yerleştirin. </li><li> Bir buz soğuk metal plaka üzerinde, ilgi alanına dahil etmek istediğiniz yönü (vb, yatay, parasagital, koronal) beyinde kırpın. </li><li> Eke titreşen bir dilimleyici ve kuru aşamasında yüzeye yapıştırıcı ile beyin blok (DSK-Zero 1; Dosaka), 4 daldırın beyin blok carbogen ile ° C NMDG-kurtarma çözümü ve sürekli kabarcık çözüm. </li><li> İlgi beyin bölgesinin dilimleri kesin. Dilim kalınlık özel bir ilgi alanı beyin, hayvan yaş, gerçekleştirilmesi için deney bağlı olarak 200-400 mikron. </li><li> Hemen kesim sonrası içinde inkübe istenen dilim, 33 carbogenated ° C NMDG-kurtarma solutitam 12 dakika boyunca, daha sonra 60 dakikalık bir başlangıç ​​dönemi için tutma carbogenated çözelti, oda sıcaklığında HEPES transfer. Bu 60 dakika inkübasyondan sonra, dilimler kayıt için de kullanılabilir. Dilimler bu kayıt için kullanılana kadar gün boyunca çözelti tutma HEPES içinde muhafaza edilir. </li></ol> 3. Beyin Dilimleri nöronlar Patch Clamp Kaydı <ol><li> Bir programlanabilir Flaming-Kahverengi çektirmesi (Sutter P-97 veya eşdeğeri dikey çektirme) ile standart yama mikropipet çekin. Giga-ohm mühür oluşumu için optimum olan Pipetler genellikle MΩ 4-6 bir dirence sahiptir </li><li> Dik mikroskop (Nikon FN-1) sahnede; kayıt odasına (Warner Instruments RC-27L) bir dilim aktarın. Sürekli superfuse (1.5 - 2.0 ml / dk) 32 ısıtıldı ve muhafaza carbogenated, standart kayıt aCSF ile dilim ° C. Alternatif olarak, dilimler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li><li> Kullanılarak ilgi beyin alan bulmak ve orta10X bir hava hedefi (Nikon Planı Fluor 10X, NA 0.3, WD: 16 mm). </li><li> 40X yakın kızılötesi (IR) su immersiyon objektif (;: 0.80; WD: NA Nikon APO 40XW 3,5 mm) kullanarak tek tek nöronların görselleştirin yakın kızılötesi IR-diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ve yüksek hızda bağlı birleştiğinde cihazı şarj (CCD) video kamera (Hamamatsu C-7500). IR-DIC gözlem altında, sağlıklı nöronların düzgün, açık gri plazma zarı sergilerler. </li><li> Uygun bir hücre içi kayıt solüsyonu ile bir mikropipet doldurun. 135 Potasyum glukonat, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP ve 0,1 GTP (pH Tris baz, osmolarite ile 7,25 ayarlanabilir: Çoğu uygulama için, aşağıdaki çözüm (mM) kullanın 290 mOsm sakaroz ile) &#39;e ayarlanmıştır. Bir görüntülenmiştir nöron bir tam hücreli kayıt oluşturulması. </li></ol> 4. Dilimler nöronlar için Uyuşturucu Yerel Uygulama <ol><li> Yukarıda tarif edildiği gibi, bir standart yama kelepçe mikropipet çekin. Kullanmaçoklu ilaç solüsyonları aynı hücre üzerinde kullanılmak üzere bu tür cam aynı parça iki özdeş &quot;kardeş&quot; uç üreten bir Sutter P-97 gibi bir pipet çekici avantajlıdır. Bunlar yukarıda tarif edilen hücre içi solüsyon ile dolduruldu eğer MΩ ila 5 arasında bir dirence sahip olacak meme çapları optimaldir. </li><li> Carbogenated, standart kayıt aCSF içinde sulandırılmış ilaç içeren bir çözelti ile Dolgu mikropipet. Aşağı ucu gelin ve çözüm sütununda sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için uyuşturucu dolu mikropipet fiske. </li><li> Böyle bir Picospritzer III (Genel Vana Co) gibi uygun bir basınç tahliye sistemine boru ile bağlanan bir pipet tutucu içinde ilaç ile dolu mikropipet monte edin. Manipülatör yaygın olarak (örneğin, Sutter MP-285) yama kelepçe kayıt için kullanılan pipet tutucu aynı çözünürlüğe sahip bir micromanipulator üzerine monte edilmelidir. Buna ek olarak, manipülatör içine ve dışına dilim çapraz hareket için izin vermelidir. Manmanuel bir sıvı kolon arkasında yeterli basınç oluşturmak için mikropipet içine basınç 3-4 kez çıkarır. </li><li> IR-DIC optik altında ucu görselleştirme ederken mikromanipülatör denetimlerini kullanarak, dilim içine ilaç pipet indirin. İdeal olarak, bir görsel olarak belirlemek ve merkez önce dilim içine kayıt mikropipet düşürülmesi için hücre yakın ilaç pipet konumlandırılması ardından gelen kaydedilmiş bir nöron için, olmalıdır. Ilaç pipet konumlandırılması ilaç pipet gigaohm bir mühür oluşturmak sonra konuma getirilir, kayıt bozabilir kaydedilmiş hücrenin çevresinde doku hareket etmesine neden olabilir. </li><li> IR video kullanılarak, doku dilim üst yüzeyinde ilaç mikropipet yerleştirin. Bir basınç ejeksiyon ve monitör 1) ejeksiyon ilgili enkaz hareketi için ucu çevresinde ve ucu tıkanmış veya bloke olduğuna dair herhangi bir işaret için 2) mikropipet ucu yürütün. Uç bloke / tıkanır ise, geri çekme pipette ve yenisi ile değiştirin. </li><li> Bu tür dilim üstünden çapraz olarak kaydedilmiş hücrenin yaklaşıma göre, son konumda, ilaç ile dolu bir pipet ucu kaydedilen hücre ve kayıt elektrot ucu ile aynı odak düzlemi (ya da biraz altında) olarak) 1 iken ve 2) kaydedilmiş hücrenin 10-40 um. Ilaç ile dolu bir pipet ucu kaydedilmiş hücrenin üzerine ise, basınç dışarı çıkmasıyla kuvvet gigaohm mühür bozabilir. </li><li> Gerilim kelepçe modu veya akım pensi modunda hücre tutarken istenilen hücresel yanıt kaydedin. Biz rutin asetilkolin kayıt ve / veya gerilim kelepçe modunda nöronlar tutarak cep akımları nikotin ortaya çıkardı. Bir Picospritzer III kullanırken basınç ejeksiyon elle tetiklenebilir rağmen, daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar için dijital TTL darbe ile toplama sistemi (Akson Digidata 1440 ve pClamp 10.3) kullanılarak basınç ejeksiyon tetiklemek için tavsiye edilir. </li></ol> 5. DenetlemeBir Piezoelektrik Translator ile İlaç dolu Mikropipet <ol><li> Eğer mümkünse, bir tek-boyutlu piezoelektrik çevirmen uyuşturucu dolu pipet tutucu monte (örn. Piezojena PA-100 veya Burleigh PZM-150) sonra bir analog voltaj girişi (yine, edinim sistemi), kabul edebilir yüksek hassasiyetli mikromanipülatör (Sutter MP-285) üzerine monte. Uyuşturucu dolu pipet hareketin içine ve giriş / çıkış zamanlaması ve hızı gibi dilim, üzerinden daha kolay kontrol ve deneyden deneye yeniden olabilir çünkü piezoelektrik çevirmen yararlıdır. Pipet sadece basınç ejeksiyon an için bir piezoelektrik çevirmen ile hücre yakınında taşındığında nAChRs öğrenim görürken, uyuşturucu dolu pipetle nikotin kaçak desensitizan etkileri, onlar hiç gerçekleşmesi gerektiğini, minimize edilir. </li><li> Piezoelektrik voltaj kontrolü amplifikatörü elle kontrollü potansiyometre kullanarak, gerilim çevirmekmaksimal değeri. </li><li> Mikromanipülatör, pozisyon pipet Kaydedilen hücrenin üzerine içeriğini çıkarın ve elle piezoelektrik voltaj kontrolü amplifikatörü sıfır gerilimini düşürerek pipet çekilecektir dilim uyuşturucu dolu pipet kullanarak. </li><li> Kayıt toplama sistemi olan bir analog çıkış sinyali kullanılarak, 250 basınç tahliye TTL nabız msan meydana gelmeden önce 300 milisaniye başlayan bir süre boyunca kesit içine ilaç ile dolu pipet hareket eder. TTL puls sona erdikten sonra 50 msn başlayarak, 250 milisaniye boyunca pipet geri çekin. </li></ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized%2C+high-affinity+%3F6%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li>
<li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li>
<li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li>
<li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li>
<li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li>
<li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%3F4%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%3F4%3F2%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li>
<li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+%CE%B16%CE%B24%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li>
<li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+%CE%B14%CE%B22%2A-%2C+%CE%B16%CE%B22%2A-%2C+%CE%B13%CE%B24%2A-+and+%CE%B17-nicotine+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
<li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li>
<li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222(2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
<li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li>
<li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Paris%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li>
</ol>

Bu çalışmada sunulan yöntem, beyin dilim hazırlıkları ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için geniş yararlıdır. Bununla birlikte, önemli ölçüde deneysel veriler, bu yöntemi kullanarak gelen nihai ürünün kalitesi ve yeniden üretilebilirlik etkileyecek bir dizi faktör vardır. Örneğin, uyarılmış akımları ilaç ile dolu bir pipet ucu çapına karşı çok duyarlıdır. Küçük ipuçları ilaç solüsyonu ve düşük direnç ile büyük ipuçları kaydedilen hücre ve kayıt elektrot arasındaki gigaohm mühür bozma olasılığı artacaktır ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktif&gt; İsim</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-metil D-glukamin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glukoz</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Askorbat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tiyoüre</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Piruvat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230.391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223.506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech İlaç</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Potasyum glukonat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 dilimleme Titreşimli</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown mikropipet çektirmenin</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27 Kayıt odası</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B Perfüzyon ısıtıcı denetleyicisi</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B Çözüm ısıtıcı</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640.102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon FN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD Video Kamera</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; Genel Valve Co</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Mikromanipülatör</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 Piezoelektrik tercümecisi</td&gt;<td&gt; Piezosystem Jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 Piezo amplifikatör</td&gt;<td&gt; Piezosystem Jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

fare beyin dilimleri içinde nikotinik asetilkolin reseptör fonksiyon okumak uyuşturucu yerel uygulama

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tütün kullanımı kanser, kalp hastalığı, amfizem, ve inme gibi birçok sağlık sorunlarına yol açar. Sigara bağımlılığı merkezi sinir sistemi boyunca nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) nikotinin biyofiziksel ve hücresel faaliyetler kaynaklanıyor yaygın bir nöropsikiyatrik bozukluktur. Nikotin bağımlılığı ile ilgili beyin bölgelerinde mevcut çeşitli nAChR alt anlamak önemli bir önceliktir. Bu tür bütün-hücre yama klempi veya iki elektrotlu voltaj kelepçesi elektrofizyolojik kayıtları gibi teknikleri kullanan deneyler ilgi nAChRs farmakolojik karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür memeli doku kültürü hücreleri veya Xenopus laevis oosit olarak Hücreler ifade nAChRs, fiziksel olarak izole edilir ve bu nedenle kolayca modern farmakoloji araçları kullanılarak incelenmiştir. Hedef reseptör zaten bilinen, özellikle çok gelişme, bu teknikler kullanılarak yapılmış birnd ektopik ifade kolayca elde edildi. Akut laboratuar fareleri ya da sıçanlar hasat beyin kesitleri içinde nöronlarda: Ancak, çoğu zaman kendi doğal ortamında nAChRs incelemek için gereklidir. Örneğin, bu tür fareler α4 L9&#39;A fareler 1 ve α6 L9, 2&#39;S fareler gibi &quot;duyarlı&quot; nAChR alt üniteleri ifade eden, spesifik nAChR alt birim olan fonksiyonel ekspresyonu esas nöronların kesin tanımlanması için izin verir. Beyin dilimleri içerisinde nöronlardan gelen tüm-hücre yama klemp kayıtları rutin yetenekli elektrofizyolog tarafından yapılmasına rağmen, yerel olarak böyle asetilkolin veya bir beyin dilim içinde kaydedilen hücreye nikotin gibi ilaçların uygulamak zordur. Superfusate içine ilaçların seyreltilmesi (banyo uygulaması) hızla geri dönüşü yoktur, ve U-tüp sistemleri kolayca beyin dilimleri ile çalışmak için adapte değildir. Bu yazıda, hızla yetişkin m Kaydedilen nöronlar nAChR-aktive edici ilaçları uygulamak için kullanılan bir yöntem tarifbeyin dilimleri Ouse. Standart tam hücre kayıtları dilimleri nöronların yapılır ve ilgi bir ilaç ile dolu ikinci bir mikropipet kaydedilen hücrenin yakınında pozisyon içine manevra edilir. Ilaç ile dolu pipet içine basınçlı hava, nitrojen veya inert bir enjeksiyon kaydedilmiş hücrenin üzerine pipetle çıkartılabilmesi için ilaç solüsyon bir miktar neden olur. Bu yöntemi kullanarak, nAChR-aracılı akımları milisaniyelik doğrulukla çözülecek edebiliyoruz. İlaç uygulama zamanları kolayca değiştirilebilir ve uyuşturucu dolu bir pipet konsantrasyon-cevap eğrileri tek bir nöron için oluşturulmuş olması için izin veren yeni bir pipet yardımıyla çekilerek değiştirilebilir. NAChR nörobiyolojide bağlamında tarif olmasına rağmen, bu yöntem beyin kesitleri nöronları içinde ligand-kapılı iyon kanalları ya da reseptörleri birçok türleri çalışmak için yararlı olacaktır.

Deneylerde, rutin dopamin (DA) üreten ventral tegmental alan (VTA) ve substantia nigra pars compactadaki (SNC) nöronlardan kaydedebilirsiniz. Voltaj-clamp modunda, asetilkolin veya bu hücrelere nikotin basınç uygulama tipik olarak 100-200 ms (Şekil 1A-B) dahilinde zirveye ulaştığı bir hızlı, içe doğru katyon akım neden olur. Mevcut bozulması büyük ölçüde etki bölgesinden ilacın difüzyon tarafından dikte edilir ve dilim enzimler mevcut olup olmadığı, bir inaktif biçim içine ilaç metabolize. Örneğin, ACh ...

Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin farelerden türetilen akut hazırlanmış beyin dilimlerinden nöronlardaki ligand kapılı iyon kanalı fonksiyonunu incelemektir. Bu, ilk olarak, özel yapay beyin omurilik sıvısı ile trans Cardi perfüze edilmiş yetişkin bir fareden sağlam bir beynin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, beynin ilgilendiği bölgeden istenen oryantasyonda beyin dilimleri hazırlamaktır.Daha sonra, mikroskop altında bir kayıt odasına yerleştirilen bireysel beyin dilimleri ve dilim içindeki bireysel nöronlar kayıt için tanımlanır. Son adım, bir nöronun tüm hücre yama kelepçesi kaydı ve ardından ikinci bir cam mikro pipet kullanılarak ligand kapılı iyon kanallarını aktive etmek için ilaçların lokal olarak uygulanmasıdır. Sonuç olarak, ligand kapılı iyon kanallarını incelemek için bu yöntem, canlı nöronlar üzerindeki doğal reseptörlerin biyofiziksel özelliklerini göstermek için kullanılır.Bu tekniğin banyo uygulaması veya YouTube ilaç verme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kaydedilen nörona ilaç dağıtımının çok hızlı ve lokalize olmasıdır. Küçük miktarlarda ilaç verilebilir ve tek bir dilimden birden fazla nöron incelenebilir. Bu yöntem, biyofiziksel hücr

local-application-drugs-to-study-nicotinic-acetylcholine-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR'ler) aracılı sinaptik iletimin presinaptik mekanizmalarını analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye izin veren in vitro ventral hipokampal - accumbens devresinin gen-kimerik bir preparatını geliştirdik. Bu hazırlık aynı zamanda sinaptik plastisitenin sinaptik öncesi ve sonrası mekanizmalarını incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Nöropsikolojik ve nörofizyolojik testler doğrulanmış bilgisayarlı dövülmesinin Farmakodinamik merkezi sinir sistemi erken geliştirme yeni geliştirilen ilaçların etkisini incelemek için kullanılır. Test pil göstermek için mecamylamine akut etkilerini ve bu etkilerin iki agonist ilacın tarafından ters açıklanmıştır.

Farmakodinamik etkileri erken faz ilaç geliştirme kolinerjik ilaçların merkezi sinir sistemi üzerinde çalışmak için bir bilgisayarlı Test batarya

Biz daha fazla ateş altında yatan erken etkinlik kazandırabileceğini kurulan eski-vivo beyin tekniğine dayalı bir yöntemini in vivo ve in vitro deneyler avantajlarını birleştiren mevcut. Ayrıca, tedavi ve tedavi edilmezse grubun aynı anatomik düzlemde doğrudan karşılaştırma için eşsiz bir fırsat temsil eder.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Bu makalede nikotin uncaging tarafından fare Beyin dilimleri nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChRs) çalışmak için bir yöntem sunar. Eşzamanlı yama kelepçe kayıt ve mikroskobu tarama 2-foton lazer ile birleştiğinde nikotin uncaging nikotinik reseptör işlevi kolinerjik Nörobiyoloji daha derin bir anlayış sağlayan hücresel morfoloji ile bağlanır.

Fare beyin dilim Photoactivatable nikotin lazer Flash Photolysis üzerinden nikotinik asetilkolin reseptör işlevinde sondalama

Erişkin farelerden gelen akut dilimlerde tek kortikostatal glutamaterjik sinapslarda glutamat salınımı ile açıklık arasındaki dengeyi değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Bu protokol glutamat tespiti için floresan sensör iGluu, sinyal alımı için bir sCMOS kamera ve odak lazer aydınlatma için bir cihaz kullanır.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Bu yöntem, akut beyin dilimleri kullanılarak endojen monoamin salınımının tespiti için basit bir teknik sunar. Kurulum, monoamin salınımı için bir doku tutucu içeren 48 kuyulu bir plaka kullanır. Serbest bırakılan monoamin, elektrokimyasal algılama ile birlikte HPLC tarafından analiz edilir. Ek olarak, bu teknik ilaç keşfi için bir tarama yöntemi sağlar.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Bu protokol, memeli Neuro-2a hücre hattı kullanılarak nöronal nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin ifadesi ve nicelendirilmesini açıklar. pH duyarlı floresan etiketler ve konfokal mikroskopi, plazma membranındaki reseptör lokalizasyonunun pH-nötr hücre içi bölmelerdeki ekspresyonlarla karşılaştırıldığında hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu da nAChR taşığı ve farmakolojik modülasyonun incelenmesini kolaylaştırır.

Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

Öğrenin fare beyin dilimlerinde nikotinik asetilkolin reseptör fonksiyonunu yerel ilaç uygulaması ve yama kelepçesi kaydı ile incelemeyi. Bu yöntem canlı nöronlarda iyon kanalı aktivitesini hızlı ve lokalize olarak ölçer.

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Daha fazla video keşfet