Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi
June 10th, 2014
Bu protokolde, kılcal kuvvet litografisi kullanılarak iki farklı polimerik malzemeden yapılmış biyomimetik kardiyak hücre kültürü substratının imalatını gösteriyoruz. Açıklanan yöntemler, in vitro ve in vivo uygulamalar için makroskopik kardiyak dokuların yapısını ve işlevini tasarlamak için ölçeklenebilir, uygun maliyetli bir teknik sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, makroskopik kalp dokularının yapısını ve işlevini tasarlamak için biyomimetik hücre kültürü substratı üretmektir. Bu, önce derin reaktif iyon aşındırma ile istenen topografik mimariye sahip bir silikon master'ın üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, istenen topografik deseni UV destekli kılcal kuvvet litografisi kullanarak silikon master'dan bir PUA kalıbına aktarmaktır.
Daha sonra, PUA kalıbı, UV destekli veya solvent aracılı kılcal kuvvet litografisi yoluyla istenen uygulamaya bağlı olarak çeşitli polimerik malzemelerden hücre kültürü substratını imal etmek için bir şablon olarak kullanılır. Son adım, birincil veya kök hücreden türetilmiş kardiyomiyositleri, sonraki analiz için nano model hücre kültürü substratı üzerine plakalamaktır. Sonuç olarak, kardiyomiyositler içindeki hücre morfolojisindeki ve sözleşmeli protein düzenlemesindeki değişiklikleri göstermek için parlak alan ve immünofloresan mikroskobu kullanılır.
Bu tekniğin mikro kontakt baskı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kılcal kuvvet litografisinin, hücre çoğalmasına veya göçüne dayanmadan kardiyak doku tek tabakalarının yapısal hizalamasını indükleyebilen nano model hücre kültürü substratı üretmesidir. Bu yöntem, kalp dokularının yapı, fonksiyon, ilişki hakkında fikir vermek için kullanılabilse de, kanser mekanobiyolojisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Matris topografyasının hücre göçü üzerindeki etkisini incelemek için, silikon ana yüzeyini %100 etanol veya ksilen ile temizleyerek ve oksijen nitrojen gazı altında kurutarak bu işleme başlayın.
Ardından, silikon ana desenini, iki santimetreye iki santimetre yüzey deseni pipeti olan bir silikon ana için bir Petri kabına 40 mikrolitre PUA yerleştirin. Ardından, dağıtılan PUA'nın üzerine dört santimetreye dört santimetre şeffaf polyester filmden oluşan bir tabaka yerleştirin, PET tabakasının üzerine bastırın ve PUA'yı bir rulo veya düz kenar yüzeyi kullanarak tabakanın altına desen yüzü boyunca yayın, böylece tüm desen PUA ön polimeri ile kaplanır. Ardından silikon ana prepolimeri ve PET'i 50 saniye boyunca 20 watt'lık bir UV ışığının yaklaşık 10 santimetre altına yerleştirin.
Sertleştikten sonra PET filmi forseps ile yavaşça çıkarın. PUA, PET filme Silicon Master nano deseninin negatifi ile yapışmalıdır. Daha sonra, P-U-A-P-E-T nano kalıplarını kullanmadan önce en az 12 saat UV altında kürleyin.
Silicon Master'ları temizlemek için, PUA eklemeden master'ın üzerine başka bir PET filmi yerleştirin. 50 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın ve PET filmi çıkarın. Daha sonra silikon master'ı %100 etanol veya ksilen ile durulayın ve oksijen nitrojen gazı altında kurutun.
Bu prosedürde, 18 milimetre çapındaki dairesel cam slaytları 10 dakika boyunca bir ozon odasına yerleştirerek tedavi edin. Ardından, kolay kullanım için geçici olarak sabitlemek için slaytları PDMS bloklarının üzerine yerleştirin. Ardından, cam slaytın yüzeyine bir kat cam astar uygulayın.
Astarın 30 dakika kurumasına izin verin. Şimdi cam slaytları bir yazıcı kağıdına yerleştirin. Her cam sürgünün ortasına 10 mikrolitre poliüretan pre polimer bırakın ve kabarcık oluşmadığından emin olun.
Ardından, PUA kalıp desenini yüzü aşağı bakacak şekilde cam sürgünün üzerine yerleştirin, bir lastik silindir silindirini PUA kalıbı boyunca yuvarlayarak pu ön polimeri cam sürgünün yüzeyi boyunca eşit şekilde dağıtın. Yazıcı kağıdı, daha sonra polimer taşmasını emecek ve 20 watt'lık bir UV lambası altında 60 saniye boyunca UV kürlemesini sağlayacaktır. Daha sonra, numuneyi UV ışık kaynağından çıkarın ve PUA kalıbını PU kaplı cam slayttan dikkatlice soyun, PU'nun polimerizasyonu tamamlanmış kabul edilir.
PUA kalıbı numuneden temiz bir şekilde soyulduğunda ve PU cam slayt yanardöner bir görünüme sahip olduğunda, numuneleri bir ay kadar saklamak için bir kurumaya koyun. Şimdi bir NFS kapak fişlerini 35 milimetrelik bir doku kültürü polistiren kabına pipet 20 mikrolitre NOA'yı tabağın dibine takın. NPPU kapak fişini yavaşça NOA'nın üzerine yerleştirin ve yapıştırıcının yayılmasına izin verin ve tüm kapak fişi tabanını kaplayın, ardından tabağı 10 dakika UV'ye maruz bırakarak NOA'yı kürleyin.
Daha sonra, NP SUBSTRATA'yı her biri beş dakika boyunca iki mililitre% 70 sulu etanol çözeltisi ile iki kez durulayarak sterilize edin. Etanolü aspirasyon ile çıkarın. Biyolojik güvenlik kabinindeki UV sterilizasyon lambası altında A NFS'nin yaklaşık bir saat boyunca tamamen kurumasına izin verin.
Hücresel yapışmayı arttırmak için, önce di sudaki fibronektini mililitre başına beş mikrograma seyrelterek A NFS'yi gece boyunca fibronektin ile kaplayın. Daha sonra, iki mililitre fibronektin çözeltisini bir tabağa pipetleyin. Ardından A NFS'yi gece boyunca 37 santigrat derece ve %5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
NR VM'leri, HESC CMS veya diğer ilgili kardiyak hücreleri edinin, hücreleri peletlemek için hücre örneğini 1000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyonla dikkatlice çıkarın ve peleti rahatsız etmediğinizden emin olun. Bundan sonra, kültür ortamındaki hücreleri mililitre başına altı hücreye 4.6 kez 10 kata kadar yeniden süspanse edin.
Sterilize edilmiş A NFS'ye 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu dikkatlice pipetleyin ve hücre süspansiyonunun kapak kızağı üzerinde kaldığından emin olun. Daha sonra, hücrelerin A NFS'ye bağlanmasına izin vermek için hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin. Daha sonra tabağa iki mililitre ilave ılık kültür ortamı ekleyin ve hücreleri aynı koşullar altında tekrar inkübatöre yerleştirin.
24 saat sonra, ortamı çıkarın ve fazla hücreleri çıkarmak için iki mililitre DPBS ile iki kez yıkayın. Bundan sonra, yemeğe iki mililitre ılık kültür ortamı ekleyin. Hücreleri aynı koşullar ve kültür altında bir inkübatöre yerleştirin.
Birleşecek hücreler her gün ortamın yerini alır. Bu şekil, yedi günlük kültür ve HESC cms'den sonra NR VM'lerinin temsili parlak alan görüntülerini göstermektedir. 48 saatlik kültürden sonra, NP yüzeylerindeki NR VM'ler ve HESC CMS belirgin yapısal anizotropi ve hizalama gösterirken, UN patern yüzeylerindeki kardiyomiyositler rastgele yönlendirilir.
İmmünohistokimyasal analiz, nano topografinin hücre hücre iskeleti hizalaması, aktin mikro filamentleri ve alfa sarkomerik aktin üzerindeki etkisini vurgular A NFS üzerinde kültürlenen hücrelerde nano sırtlar boyunca hizalanır, ancak desensiz substrat üzerindeki hücrelerde rastgele dağılmış olarak kalır. Bu prosedürü denerken, hücre yerleşiminden önce substratınızı sterilize etmeyi unutmamak önemlidir, çünkü kontaminasyon geliştikten sonra büyük bir sorun olabilir. Bu teknik, kardiyovasküler biyoloji araştırmacılarının kardiyak olgunlaşmayı ve kök hücre kaynaklı kardiyomiyositleri keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, kardiyak doku mühendisliği uygulamaları için kılcal kuvvet litografisi yoluyla bir biyomimetik hücre kültürü substratının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, kılcal kuvvet litografisi kullanarak biyomimetik kardiyak hücre kültürü substratlarının üretimini gösterir. Belirtilen yöntemler, çeşitli uygulamalar için makroskopik kardiyak dokuları mühendisliği yapmak için ölçeklenebilir ve maliyet etkili bir yaklaşım sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak doku mühendisliği
- Hücre kültürü teknikleri
- Polimerik malzemeler
Arka Plan
- Biyomimetik substratlar, kardiyak hücreleri incelemek için gereklidir.
- Kılcal kuvvet litografisi, hassas desen oluşturmayı sağlar.
- Kardiyak dokuların mühendisliği, in vitro ve in vivo çalışmaları geliştirebilir.
- Farklı polimerik malzemelerin kullanılması, uygulamaları özelleştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Biyomimetik hücre kültürü substratları üretmek.
- Kardiyak dokuların yapısını ve işlevini mühendislik yapmak.
- Kardiyomiyosit davranışının analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Derin reaktif iyon aşındırma kullanarak silikon bir ana kalıbın üretimi.
- UV destekli kılcal kuvvet litografisi ile topografik desenlerin bir PUA kalıbına aktarılması.
- Çeşitli polimerik malzemelerden hücre kültürü substratlarının üretimi.
- Mikroskopi teknikleri kullanılarak analiz için kardiyomiyositlerin yerleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Topografik desenlerin hücre kültürü substratlarına başarılı bir şekilde aktarılması.
- Hücre morfolojisindeki değişikliklerin gözlemlenmesi.
- Kardiyomiyositlerde kontraktil protein düzenlemesinin analizi.
- Biyomimetik substratların etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, biyomimetik substratlar oluşturmak için güvenilir bir yöntem sunar.
- Kılcal kuvvet litografisi, doku mühendisliği için çok yönlü bir tekniktir.
- Daha fazla çalışma, kardiyak hücre davranışının anlaşılmasına katkı sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
