Name: Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme In vivo Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin tek molekül hassasiyetinde canlı hücrelerde protein üretimini görüntülemek için CoTrAC yöntemini. Bu teknik E. coli kullanarak transkripsiyon faktörü dinamiklerini bozmadan gözlemlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ubp1 ifade plazmid pCG001 nazik Tıbbi Araştırma John Curtin Okulu&#39;nda Rohan Baker tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Dimes Araştırma Bursu 1-FY2011 Mart Dimes, Basil O&#39;Connor Başlangıç ​​Akademik Araştırma Ödülü # 5-FY20 ve NSF KARİYER Ödülü 0.746.796 Mart tarafından finanse edildi.

1. Gerinim Mühendislik İş Akışı <ol><li> Dizileri kodlama (a) bir zar-yerelleştirme dizisi, (b) bir hızla olgunlaşan floresan protein ve bir ilgi ve protein (örneğin, bir transkripsiyon faktörü) ile çerçeve (c) bir proteaz tanıma sekansı, N-terminalinde. Ekleme Biz Tsr-Venüs muhabiri 2 hedef membran kullanılan ve ifade bakteriyofaj λ repressör CI protein moleküllerinin sayısını saymak için Ubikitin proteaz tanıma dizisi (Ub) için erimiş. Biz bölgenin kodlama CI yabani tip değiştirilmesi ve E. içine yapı birleştiren, füzyon proteini Tsr-Venus-UB-CI inşa nasıl Detayları λ Red 3 rekombinasyon kullanılarak coli kromozomu, ref ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. 1. </li><li> Sıralanmasıyla tüm değişiklikler doğrulayın. </li><li> Bir plazmid kodlama ilgi flüoresan raportör proteini eksprese eden ve bir yük içine yukarıda kullanılan tanıma dizisi için spesifik bir proteaz Dönüşümütranslasyonel füzyon. Bu C-terminal artığı ubikitin 4 hemen sonra parçalayarak proteaz Ubp1 kullanılmıştır. </li></ol> 2. Kültür Hücreler ve örnek hazırlayın <ol><li> Biri E. seçin taze streaked agar plağından ilgi coli kolonisi 1 ml M9 minimal medya içine 5 1X MEM amino asitler ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş. İstenen sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde inkübe yeterince uzun ulaşmak için OD 600&gt; 1.0 (600 nm de optik yoğunluk). </li><li> OD 600 = 0.02 için uygun antibiyotik ile 1 ml taze M9 ortama kültürü seyreltin. Uygun bir sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde inkübe edin. Düşük sıcaklık büyümesi için gerekli olmadığını Ilk hücre yoğunluğunda artış olabilir. </li><li> OD 600 = 0.2-0.3 (37 OD 600 bir başlangıç ​​hücre kültürü ile ° C = 0.02, bu 3-4 saat sürer), agaroz jel pedi (adım 3) hazırlarken başladığınızda. </li><li> Zaman OD hücreleri görüntüleme için hazır <sub&gt; 600 = 0.3-0.4. </li><li> 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir benchtop mikrosantrifüj 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj içine 1 ml İnkübe kültürü aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve 1 ml taze M9 orta ekleyin ve pelet hafifçe tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1.6 ve 1.7 adımları tekrarlayın. Süpernatantı atın. </li><li> Yavaşça 1 ml M9 medyada tekrar süspansiyon haline getirin. Timelapse görüntüleme için düşük hücre yoğunlukları sağlamak üzere 100-kat için - hücreler direkt olarak mikroskop görüntüleme ya da seyreltilmiş 10 için de kullanılabilir. Düşük hücre yoğunlukları uzatılmış timelapse görüntüleme için önemli olduğunu unutmayın. Görüntüleme odası (adım 4) deneme sırasında mühürlenir. Hücrelerin üstel büyüme nedeniyle, yüksek başlangıç ​​hücre konsantrasyonları anlamlı floresan protein olgunlaşması azaltılması ve hücre büyümesini etkileyen, jel pedi uzun süreli büyüme sonra odasının içindeki oksijeni tüketebilir. </li></ol> 3. Agaroz Çözüm hazırlayın <ol><li> 10-20 mg tartılır1,5 ml mikrosantrifüj tüpe düşük erime sıcaklığına agaroz. </li><li> % 3 agaroz çözüm yapmak antibiyotik vermeden uygun miktarda M9 minimal orta ekleyin. </li><li> 70, 30 dakika için agaroz çözelti ısıtılır ° C, çözelti tamamen eritilmiş ve homojen olmasını sağlamak için ters tüp eritir. Jel pedi bu noktada (adım 4) dökülecek veya sıcaklık 50 ° C&#39;ye düşmüş ve daha sonra kullanmak için birkaç saat tutulabilir. </li></ol> 4. Odası Jel Tampon hazırlayın <ol><li> Görüntüleme öncesinde yaklaşık 50 dakika su ile bir Microaqueduct slayt durulayın. </li><li> Bir kapak cam temizliği (6 açıklandığı gibi zaten sıkı bir temizleme yöntemi ile) ve basınçlı hava ile üfleme steril su ve kuru ile slayt Microaqueduct tutunuz. </li><li> Bu uygulamalar için modifiye edilebilir Microaqueduct sürgüyle (arasında cam tarafında giriş ve çıkışları kapsayan, böylece Microaqueduct slayt üzerinde lastik bir contahangi medya) numune içinden perfüze edilmiştir. Microaqueduct slaydın merkezine 50 ul agaroz çözeltisi (adım 3) uygulanır. </li><li> Temiz, kuru cam kapak ile agaroz çözüm ekleyin. </li><li> Agaroz çözelti 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. </li><li> Bu arada, (adım 2), bir hücre örneği hazırlamak. </li><li> Dikkatle jel ped üst cam kapak soyulabilir. Jel yastığı başına 1.0 ul yıkanmış hücre kültürü ekleyin. Jel pedi tarafından absorbe edilecek kültür için ~ 2 dakika bekleyin. O kadar uzun beklemek değil önemli olduğunu jel pedi overdries, ama yeterince uzun hücrelerinin düzgün jel pedi uyduğunu. İdeal bekleme süresi sıcaklık ve nem ile değişir. </li><li> Beklerken, başka precleaned cam kapak kurulayın. </li><li> Cam kapak ve Microaqueduct slayt iyi hizalanmış olduğunu kontrol ettikten yeni cam kapak ile örnek örtün. </li><li> Üreticinin yönergelerini izleyerek sıcaklık kontrollü iklim odasında birleştirin.Şimdi mikroskobu (adım 5) görüntüleme için kullanılabilir. </li></ol> 5. Görüntüleme ve Timelapse Filmler kazanılması <ol><li> Üreticinin talimatlarına (örneğin lazer deney öncesi ~ 0.5 saat süreyle ısınmış gerekebilir) takiben lazer ve mikroskop açın. </li><li> Mikroskop sahne yazısına monte odasına kilitleyin. Büyüme oda sıcaklığı ve 37 ° C ya da istenen diğer büyüme sıcaklıkta amaç ısıtıcı ayarlayın. </li><li> Oda sıcaklığının üzerinde görüntüleme, odak ya da jel pedi genellikle ilk sıcaklık kayması sonra ~ 15 dakika için önemli ölçüde sürüklenir. Uygulamada, ilgi alanları bulmak ve bir deney için gerekli görüntüleme komut dosyalarını değiştirmek için bu kez kullanın. </li><li> Mikroskop hücreleri bulun ve önceden tanımlanmış ve hizalanmış görüntüleme bölgede bu merkezleme sonra her hücrenin konumunu kaydetmek. Birden fazla hücre Her görüntü alımından zaman penceresinde görüntülenebilir. M üzerinde timelapse görüntüleme içinherhangi kuşaklar, diğer koloniler büyüme sırasında görüntüleme bölge girmeyecek şekilde görüntülü hücreleri başlangıçta yüz, en az birkaç mikron ile diğer hücrelerinden ayrılan olduğundan emin olun. </li><li> Böylece lazer uyarma yoğunluğunu ayarlayın ki 6 poz içindeki hemen hemen tüm floresan molekülü photobleach (Şekil 5). </li><li> , Otomatik bir görüntü dosyası / günlük, Şekil 3 &#39;de açıklanan deneysel akışı algoritması kullanılarak veri timelapse elde kullanılması. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

Biz hiçbir açıklama yok.

CoTrAC yöntemi geleneksel N-veya C-terminali floresan proteini füzyon proteini etkinliği bozabilir diğer proteinlerin üretimini ölçmek için yaygın olabilir. CoTrAC stratejisi mevcut yöntemler üzerinde üç benzersiz avantajlara sahiptir. İlk olarak, eş-translasyonel füzyon flüoresan raportör molekülü, gerçek zamanlı olarak protein üretim doğru sayımı izin veren, ilgilenilen proteinin her bir molekül için üretilmiş olmasını sağlar. İkincisi, membran hedefli muhabiri Tsr-Venüs çok düşük seviyelerde ifade proteinlerin tespit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Agaroz (Düşük erime sıcaklığı) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H2O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 x M9 tuzlan </td><td></td><td></td><td> Aşağıda tarif 9&#39;da tarif edildiği gibi </td></tr><tr><td> % 20 glikoz </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x MEM amino asit solüsyonu </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrollü BüyümeBölme Sahne adaptörü </td><td> Bioptechs </td><td> -2 FCS </td><td></td></tr><tr><td> Amaç Isıtıcı </td><td> Bioptechs </td><td> Model mikroskop objektif bağlıdır </td><td></td></tr><tr><td> Slayt Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro kapağı gözlük </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kaynağı zor olabilir; Bioptechs adresinden de bulunabilir </td></tr><tr><td> Cam / slayt conta Kapak </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> Çeşitli </td><td> Örnek kurulum: Tutarlı Innova 308C Argon iyon lazer, Olympus IX-81 mikroskop, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 hedefi, Metamorph yazılım </td><td> Lazer uyarma, otomatik xyz aşamasında, komut dosyası görüntüleme ve otofokus yeteneğine otomasyon yazılımı, resolvin yeteneğine optik olmalıg tek floresan proteinleri </td></tr><tr><td> EM-CCD Kamera </td><td> Çeşitli </td><td> Örnek kurulum: Andor Ixon DU-898 </td><td> Arka plan üstüne tek floresan proteinleri tespit etmek için yeterince düşük gürültü olmalı </td></tr></tbody></table>

gen yönetmelik tek molekül görüntüleme<em&gt; in vivo</em&gt; dilinim tarafından cotranslational aktivasyon (cotrac) kullanma

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC) proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bu mümkün ardışık beş dakikalık bir zaman pencereleri sırasında bir hücre tarafından üretilen protein moleküllerinin sayısını saymak mümkün kılar. Bu canlı hücrelerde tek floresan protein molekülleri tespit etmek için yeterince hassas olan ~ 0,5 1 kW / cm 2, lazer uyarma güç yoğunluğuna sahip bir floresan mikroskop gerektirir. Bir zar hedefleme sırası, bir hızlı-olgunlaşma, sarı floresan protein ve bir proteaz tanıma sekansı: bu yöntemde kullanılan flüoresan raportör üç parçadan oluşur. Raportör Çevrimsel ilgi çeken bir proteinin N-terminusunda için eritilerek birleştirilir. Hücreler bir sıcaklık kontrollü mikroskop sahnede yetiştirilir. Her beş dakikada, hücrelerin içindeki floresan molekülü (ve daha sonra eş görüntülü) floresans görüntüleri analiz ederek unted ve sadece yeni tercüme proteinler sonraki ölçüm sayılan böylece sonradan photobleached. Bu yöntem sonucunda floresans görüntüler, her bir görüntü floresan noktalar tespit tek hücreleri atayarak ve ardından hücre soylarının hücreleri atayarak analiz edilebilir. Belirli bir hücreye bir zaman penceresi içinde üretilen proteinlerin sayısı tek flüoresan moleküllerinin ortalama yoğunluk tarafından lekelerin entegre floresan yoğunluğu bölünmesiyle hesaplanır. Bu tek bir 5 dakikalık bir zaman pencereleri içinde 0-45 molekül aralığında ifade seviyelerini ölçmek için bu yöntem kullanılır. Bu yöntem bize λ repressör CI ifadesi gürültü ölçmek için etkin ve sistem biyolojisi diğer birçok potansiyel uygulamalar vardır.

Λ repressör CI üretim takip bir CoTrAC deneyden elde Tipik sonuçlar Şekiller 4 ve 5 &#39;de gösterilmiştir. Bu deneyde, 12 koloniler 5 dakika aralıklarla görüntülenmiştir. Her zaman noktasında, koloni birinci autofocused edildi ve görüntüleme bölge içinde merkezi. Sonraki odaklı / merkezli pozisyonu saklanan ve aydınlık görüntü elde edildi. Evresi hücrelerin (faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik olmadan bisecting düzlemine aydınlık odak düzlemi taşımak için z ekse...

Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC), proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bir transkripsiyon faktörü, λ repressör CI stokastik ifade dinamik takip etmek için kullanılmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Bu prosedürün amacı, büyüyen e coli kolonilerinin hızlandırılmış floresan görüntülerini elde etmek ve yeni üretilen protein moleküllerinin sayısını tanımlamak için ortak iz yapılarını ifade etmektir. Bu, önce bir hücre numunesi hazırlanarak, bir floresan Cora raportörüne kaynaşmış bir ilgilenilen proteini ifade eden coex ve Cora raportörü ile ilgilenilen protein arasında spesifik olarak ayrılan bir proteaz ile gerçekleştirilir. İkinci adım, M nine minimal medya ile yapılan düşük erime sıcaklığına sahip bir Aris jeli hazırlamaktır.Daha sonra, sıcaklık kontrollü bir numune odası ile kullanılmak üzere bir AROS jel pedi hazırlanır. E coli hücreleri jel üzerine yerleştirilir ve hazne monte edilir. Son adım, odayı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirmek ve birden fazla nesil boyunca düzenli aralıklarla birkaç büyüyen hücre kolonisini görüntülemektir.Yeni üretilen TRE rapor moleküllerinin her seferinde foto-ağartılması, tek molekül ve tek hücre çözünürlüğüne sahip canlı hücrelerde protein üretiminin zaman izlerini elde etmek için kullanılır. Bu tekniğin, floresan protein füzyonu kullanılarak yapılan tek hücreli ölçümlere göre avantajı, protein moleküllerinin herhangi bir kanserinin üretiminin, tek molekül prosedürü ile takip edilebilmesi ve moleküllerin işlevlerini etkileyen sonucun takip edilebilmesidir. Gerinim ekleme dizilerini tasarlamak, bir membran lokalizasyon dizisini, hızlı olgunlaşan bir floresan proteini ve bir proteaz tanıma dizisini kodlamak ve bu özel durumda ilgilenilen bir protein, bir transkripsiyon faktörü veya tf ile çerçeveye ve çerçeve içinde terminal.Bu işlemde membran hedefli TSR venöz raportör kullanıldı. Raportör, eksprese edilen bakteri faj Lambda Repressör, C bir protein molekülünün sayısını saymak için proteaz tanıma dizisi ubikitin ile kaynaştırıldı. Yapıyı e coli kromozomuna dahil ettikten sonra, tanıma dizisine özgü proteazın plazmit kodlaması, translasyonel füzyonda ilgilenilen floresan raportörü ve proteini ifade eden bir suşa dönüştürülür.Bu protokolde, C terminali ubikuitin kalıntısı kullanıldıktan hemen sonra parçalanan proteaz ubikuitin karboksi Hydro bir. Bu protokole başlamak için, bir x minimum esansiyel orta amino asitler ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir mililitre M dokuz, bir mililitre M dokuz, bir e coli kolonisi seçin. Bir çalkalayıcının istenen sıcaklıkta, 600 nanometrede veya OD 600'de 1.0'dan büyük bir optik yoğunluğa ulaşacak kadar uzun süre inkübe edilmesi.Daha sonra kültürü bir mililitre taze M dokuz besiyerine uygun antibiyotiklerle 0.02'lik bir OD 600'e seyreltin. Bir çalkalayıcıyı uygun sıcaklıkta inkübe ederek, düşük sıcaklık büyümesi için gerekirse ilk hücresel yoğunluk arttırılabilir. OD 600 0,2 ila 0,3'e eşit olduğunda, 10 ila 20 miligram düşük erime sıcaklığına sahip aros'u 1,5 mililitrelik mikro tüpe tartarak ARO jel pedini hazırlamaya başlayın.% 3'lük bir çözelti yapmak için uygun hacim M dokuz, antibiyotiksiz minimal ortamı ekleyin. Daha sonra ortaya çıkan çözeltiyi erimesi için 70 santigrat derecede 30 dakika ısıtın. Çözeltinin tamamen eridiğinden ve homojen olduğundan emin olmak için tüpü ters çevirin.Jel ped montajı için, önceden temizlenmiş bir kapak camını ve bir mikro su kemeri sürgüsünü steril suyla durulayın. Kapak camını kurutun ve basınçlı hava ile üfleyerek kaydırın. Lastik contayı, giriş ve çıkışları kaplayacak şekilde mikro su kemeri sürgüsüne yerleştirin.Sürgünün cam tarafında, mikro su kemerinin ortasına 50 mikrolitre ARO solüsyonu uygulayın. ARO solüsyonunu temizlenmiş kuru kapak camı ile kaydırarak kapatın. Agro çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.Hücreler 0,3 ila 0,4 arasında bir OD 600'e ulaştığında, görüntüleme için hazırdırlar. Bir mililitre inkübe edilmiş kültürü, bir tezgah üstü mikro santrifüjde bir dakika boyunca 10.000 kez G'de 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp santrifüjüne aktarın. SUP ajanını attıktan sonra, bir mililitre taze M dokuz orta ve resüs ekleyin.Pelet hafifçe askıya alın, süspansiyonu bir dakika boyunca 10.000 kez G'de tekrar santrifüjleyin. Ardından resus santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlayın, peleti bir mililitre M dokuz ortamda nazikçe yeniden süspanse edin. Bu noktada, hücreler mikroskop görüntüleme için kullanılabilir veya hızlandırılmış görüntüleme için düşük hücre yoğunlukları sağlamak için 10 ila 100 kat seyreltilebilir.Görüntüleme için bir numune hazırlamak için, jel pedin üst kısmından kapak camını dikkatlice soyun. Jel pedin üstüne bir mikrolitre yıkanmış hücre kültürü ekleyin. Kültürün jel ped tarafından emilmesi için yaklaşık iki dakika bekleyin.Jel pedin kuruması için çok uzun süre beklememek önemlidir. Kuru beklerken ideal süre sıcaklık ve neme göre değişecektir. Başka bir önceden temizlenmiş kapak camı.Numune kuruduktan sonra, kapak camının ve mikro su kemeri sürgüsünün iyi hizalandığından emin olarak numuneyi yeni kapak camı ile örtün. Üreticinin talimatlarına göre sıcaklık kontrollü büyüme odasını monte edin. Artık mikroskopta görüntüleme için kullanılabilir.Görüntülemeye başlamak için, üreticinin talimatlarını izleyerek lazeri ve mikroskobu açın. Monte edilmiş odayı mikroskop üzerindeki sahne ekine kilitleyin. Büyüme odasının ve hedef ısıtıcının sıcaklığını 37 santigrat dereceye veya istenen diğer büyüme sıcaklığına ayarlayın.Oda sıcaklığının üzerinde görüntüleme yapılırsa, odak veya jel dolgu genellikle ilk sıcaklık değişiminden sonra yaklaşık 15 dakika boyunca önemli ölçüde kayacaktır. Uygulamada. İlgilendiğiniz bölgeleri bulmak ve görüntüleme komut dosyalarını gerektiği gibi değiştirmek için bu süreyi kullanın.Bir deney için. Lazer uyarma yoğunluğunu, neredeyse tüm floresan molekülleri altı pozlama içinde foto ağartıcı olacak şekilde ayarlayın. Mikroskopta hücreleri bulun ve bunları önceden tanımlanmış ve hizalanmış bir görüntüleme bölgesi içinde ortalayın.Ardından, her hücrenin konumunu saklayın, her görüntüde birden fazla hücre görüntülenebilir. Birçok nesil boyunca hızlandırılmış görüntüleme için edinme zaman penceresi, görüntü hücrelerinin başlangıçta diğer hücrelerden ayrılmasını, ancak en az birkaç yüz mikron olmasını sağlar, böylece diğer koloniler büyüme sırasında görüntüleme bölgesine girmez. Otomatik bir görüntüleme komut dosyası kullanarak, bu videoya eşlik eden metin protokolünde bulunabilecek bu deneysel iş akışında açıklanan algoritmayı kullanarak hızlandırılmış veriler elde edin.Bu görüntüler, bir kod izleme denemesinden alınan tipik zaman atlamalı verileri gösterir. Tek bir koloniden alınan görüntüler 25 dakikalık aralıklarla gösterilir. Bu deneyde, her beş dakikada bir 12 farklı koloniden veri elde edildi.Bu görüntüler, tüm görüntüleme alanının arka planındaki değişikliği hesaba katmak için ortalama arka plan çıkarılmış olarak parlak alan görüntülerini ve Venüs YFP floresan görüntülerini temsil eder. Zamanla, görüntüler üst üste bindirildiğinde, TSR venöz UB raportör moleküllerinin kutup lokalizasyonunu ve farklı hücrelerde beş dakikalık zaman pencerelerinde üretilen molekül sayısındaki heterojenliği ortaya çıkarırlar. Burada, her beş dakikalık zaman aralığının başında elde edilen altı adet 100 milisaniyelik maruziyetin venöz floresan görüntüleri olan bir kod izleme deneyindeki tek bir zaman noktasından tipik bir veri gösterilmektedir.Altı maruziyetin her biri, analiz için floresan hale gelmek üzere yanıp sönen geçici olarak koyu renkli venöz moleküllere zaman tanımak için 900 milisaniye ile ayrıldı. Altıncı görüntü, ağartılmamış molekülleri ve otofloresanı düzeltmek için birinci görüntüden çıkarılır. Bu görüntüdeki arka plan noktaları, belirli hücre soylarına lokalize edilmiştir ve entegre floresan yoğunlukları ile ölçülür.Koloninin ortalama entegre floresansı daha sonra bu çizgiyi üstel bir bozunmaya uyarlayan altı görüntü üzerinde çizilir. Ayrıca, sabit bir ofset, yaklaşık bir saniyelik bir bozunma yarısı süresi verir. Bu deneyde, venöz moleküller hücresel otofloresandan çok daha hızlı bir şekilde foto ağartma yapar.Bu nedenle, her çerçevede toplam venöz molekül sayısının yaklaşık yarısı foto ağartılır. Bu prosedür için, tek hücrelerde üretilen protein moleküllerinin sayısının trismini oluşturmak için başka bir yerde iletkenlik görüntüleme analizi yapılabilir.

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Öğrenin tek molekül hassasiyetinde canlı hücrelerde protein üretimini görüntülemek için CoTrAC yöntemini. Bu teknik E. coli kullanarak transkripsiyon faktörü dinamiklerini bozmadan gözlemlemenizi sağlar.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme

Daha fazla video keşfet