Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme In vivo Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

Bu prosedürün amacı, büyüyen e coli kolonilerinin hızlandırılmış floresan görüntülerini elde etmek ve yeni üretilen protein moleküllerinin sayısını tanımlamak için ortak iz yapılarını ifade etmektir. Bu, önce bir hücre numunesi hazırlanarak, bir floresan Cora raportörüne kaynaşmış bir ilgilenilen proteini ifade eden coex ve Cora raportörü ile ilgilenilen protein arasında spesifik olarak ayrılan bir proteaz ile gerçekleştirilir. İkinci adım, M nine minimal medya ile yapılan düşük erime sıcaklığına sahip bir Aris jeli hazırlamaktır.

Daha sonra, sıcaklık kontrollü bir numune odası ile kullanılmak üzere bir AROS jel pedi hazırlanır. E coli hücreleri jel üzerine yerleştirilir ve hazne monte edilir. Son adım, odayı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirmek ve birden fazla nesil boyunca düzenli aralıklarla birkaç büyüyen hücre kolonisini görüntülemektir.

Yeni üretilen TRE rapor moleküllerinin her seferinde foto-ağartılması, tek molekül ve tek hücre çözünürlüğüne sahip canlı hücrelerde protein üretiminin zaman izlerini elde etmek için kullanılır. Bu tekniğin, floresan protein füzyonu kullanılarak yapılan tek hücreli ölçümlere göre avantajı, protein moleküllerinin herhangi bir kanserinin üretiminin, tek molekül prosedürü ile takip edilebilmesi ve moleküllerin işlevlerini etkileyen sonucun takip edilebilmesidir. Gerinim ekleme dizilerini tasarlamak, bir membran lokalizasyon dizisini, hızlı olgunlaşan bir floresan proteini ve bir proteaz tanıma dizisini kodlamak ve bu özel durumda ilgilenilen bir protein, bir transkripsiyon faktörü veya tf ile çerçeveye ve çerçeve içinde terminal.

Bu işlemde membran hedefli TSR venöz raportör kullanıldı. Raportör, eksprese edilen bakteri faj Lambda Repressör, C bir protein molekülünün sayısını saymak için proteaz tanıma dizisi ubikitin ile kaynaştırıldı. Yapıyı e coli kromozomuna dahil ettikten sonra, tanıma dizisine özgü proteazın plazmit kodlaması, translasyonel füzyonda ilgilenilen floresan raportörü ve proteini ifade eden bir suşa dönüştürülür.

Bu protokolde, C terminali ubikuitin kalıntısı kullanıldıktan hemen sonra parçalanan proteaz ubikuitin karboksi Hydro bir. Bu protokole başlamak için, bir x minimum esansiyel orta amino asitler ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir mililitre M dokuz, bir mililitre M dokuz, bir e coli kolonisi seçin. Bir çalkalayıcının istenen sıcaklıkta, 600 nanometrede veya OD 600'de 1.0'dan büyük bir optik yoğunluğa ulaşacak kadar uzun süre inkübe edilmesi.

Daha sonra kültürü bir mililitre taze M dokuz besiyerine uygun antibiyotiklerle 0.02'lik bir OD 600'e seyreltin. Bir çalkalayıcıyı uygun sıcaklıkta inkübe ederek, düşük sıcaklık büyümesi için gerekirse ilk hücresel yoğunluk arttırılabilir. OD 600 0,2 ila 0,3'e eşit olduğunda, 10 ila 20 miligram düşük erime sıcaklığına sahip aros'u 1,5 mililitrelik mikro tüpe tartarak ARO jel pedini hazırlamaya başlayın.

% 3'lük bir çözelti yapmak için uygun hacim M dokuz, antibiyotiksiz minimal ortamı ekleyin. Daha sonra ortaya çıkan çözeltiyi erimesi için 70 santigrat derecede 30 dakika ısıtın. Çözeltinin tamamen eridiğinden ve homojen olduğundan emin olmak için tüpü ters çevirin.

Jel ped montajı için, önceden temizlenmiş bir kapak camını ve bir mikro su kemeri sürgüsünü steril suyla durulayın. Kapak camını kurutun ve basınçlı hava ile üfleyerek kaydırın. Lastik contayı, giriş ve çıkışları kaplayacak şekilde mikro su kemeri sürgüsüne yerleştirin.

Sürgünün cam tarafında, mikro su kemerinin ortasına 50 mikrolitre ARO solüsyonu uygulayın. ARO solüsyonunu temizlenmiş kuru kapak camı ile kaydırarak kapatın. Agro çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.

Hücreler 0,3 ila 0,4 arasında bir OD 600'e ulaştığında, görüntüleme için hazırdırlar. Bir mililitre inkübe edilmiş kültürü, bir tezgah üstü mikro santrifüjde bir dakika boyunca 10.000 kez G'de 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp santrifüjüne aktarın. SUP ajanını attıktan sonra, bir mililitre taze M dokuz orta ve resüs ekleyin.

Pelet hafifçe askıya alın, süspansiyonu bir dakika boyunca 10.000 kez G'de tekrar santrifüjleyin. Ardından resus santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlayın, peleti bir mililitre M dokuz ortamda nazikçe yeniden süspanse edin. Bu noktada, hücreler mikroskop görüntüleme için kullanılabilir veya hızlandırılmış görüntüleme için düşük hücre yoğunlukları sağlamak için 10 ila 100 kat seyreltilebilir.

Görüntüleme için bir numune hazırlamak için, jel pedin üst kısmından kapak camını dikkatlice soyun. Jel pedin üstüne bir mikrolitre yıkanmış hücre kültürü ekleyin. Kültürün jel ped tarafından emilmesi için yaklaşık iki dakika bekleyin.

Jel pedin kuruması için çok uzun süre beklememek önemlidir. Kuru beklerken ideal süre sıcaklık ve neme göre değişecektir. Başka bir önceden temizlenmiş kapak camı.

Numune kuruduktan sonra, kapak camının ve mikro su kemeri sürgüsünün iyi hizalandığından emin olarak numuneyi yeni kapak camı ile örtün. Üreticinin talimatlarına göre sıcaklık kontrollü büyüme odasını monte edin. Artık mikroskopta görüntüleme için kullanılabilir.

Görüntülemeye başlamak için, üreticinin talimatlarını izleyerek lazeri ve mikroskobu açın. Monte edilmiş odayı mikroskop üzerindeki sahne ekine kilitleyin. Büyüme odasının ve hedef ısıtıcının sıcaklığını 37 santigrat dereceye veya istenen diğer büyüme sıcaklığına ayarlayın.

Oda sıcaklığının üzerinde görüntüleme yapılırsa, odak veya jel dolgu genellikle ilk sıcaklık değişiminden sonra yaklaşık 15 dakika boyunca önemli ölçüde kayacaktır. Uygulamada. İlgilendiğiniz bölgeleri bulmak ve görüntüleme komut dosyalarını gerektiği gibi değiştirmek için bu süreyi kullanın.

Bir deney için. Lazer uyarma yoğunluğunu, neredeyse tüm floresan molekülleri altı pozlama içinde foto ağartıcı olacak şekilde ayarlayın. Mikroskopta hücreleri bulun ve bunları önceden tanımlanmış ve hizalanmış bir görüntüleme bölgesi içinde ortalayın.

Ardından, her hücrenin konumunu saklayın, her görüntüde birden fazla hücre görüntülenebilir. Birçok nesil boyunca hızlandırılmış görüntüleme için edinme zaman penceresi, görüntü hücrelerinin başlangıçta diğer hücrelerden ayrılmasını, ancak en az birkaç yüz mikron olmasını sağlar, böylece diğer koloniler büyüme sırasında görüntüleme bölgesine girmez. Otomatik bir görüntüleme komut dosyası kullanarak, bu videoya eşlik eden metin protokolünde bulunabilecek bu deneysel iş akışında açıklanan algoritmayı kullanarak hızlandırılmış veriler elde edin.

Bu görüntüler, bir kod izleme denemesinden alınan tipik zaman atlamalı verileri gösterir. Tek bir koloniden alınan görüntüler 25 dakikalık aralıklarla gösterilir. Bu deneyde, her beş dakikada bir 12 farklı koloniden veri elde edildi.

Bu görüntüler, tüm görüntüleme alanının arka planındaki değişikliği hesaba katmak için ortalama arka plan çıkarılmış olarak parlak alan görüntülerini ve Venüs YFP floresan görüntülerini temsil eder. Zamanla, görüntüler üst üste bindirildiğinde, TSR venöz UB raportör moleküllerinin kutup lokalizasyonunu ve farklı hücrelerde beş dakikalık zaman pencerelerinde üretilen molekül sayısındaki heterojenliği ortaya çıkarırlar. Burada, her beş dakikalık zaman aralığının başında elde edilen altı adet 100 milisaniyelik maruziyetin venöz floresan görüntüleri olan bir kod izleme deneyindeki tek bir zaman noktasından tipik bir veri gösterilmektedir.

Altı maruziyetin her biri, analiz için floresan hale gelmek üzere yanıp sönen geçici olarak koyu renkli venöz moleküllere zaman tanımak için 900 milisaniye ile ayrıldı. Altıncı görüntü, ağartılmamış molekülleri ve otofloresanı düzeltmek için birinci görüntüden çıkarılır. Bu görüntüdeki arka plan noktaları, belirli hücre soylarına lokalize edilmiştir ve entegre floresan yoğunlukları ile ölçülür.

Koloninin ortalama entegre floresansı daha sonra bu çizgiyi üstel bir bozunmaya uyarlayan altı görüntü üzerinde çizilir. Ayrıca, sabit bir ofset, yaklaşık bir saniyelik bir bozunma yarısı süresi verir. Bu deneyde, venöz moleküller hücresel otofloresandan çok daha hızlı bir şekilde foto ağartma yapar.

Bu nedenle, her çerçevede toplam venöz molekül sayısının yaklaşık yarısı foto ağartılır. Bu prosedür için, tek hücrelerde üretilen protein moleküllerinin sayısının trismini oluşturmak için başka bir yerde iletkenlik görüntüleme analizi yapılabilir.