Name: Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin bakteriyel hücre bölünmesinde FtsZ-halka yapısını PALM tekniği ile süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik E. coli sitoskeletal proteinlerinin nanometre hassasiyetinde analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hibe: 5RO1GM086447-02.

1. Örnek Hazırlanması <ol><li> Suşu JB281 tek bir koloni ile LB ortamı aşılamak [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. 37 bir çalkalayıcı gecede büyümek ° C. </li><li> M9 içine kültür 1:1,000 + asgari medya [M9 Tuzlar,% 0.4 glikoz, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, MEM Amino Asitler ve Vitaminler] seyreltin ve orta-log fazı (= 0.2-0.3 OD 600) büyümek Oda sıcaklığında (RT) de kloramfenikol (150 ug / ml) varlığında. </li><li> 20 uM (Not # 1) 2 saat süreyle IPTG ile kültür øndükle. </li><li> Pelet mikrosantrifüj (8.000 rpm, 1 dak) ve kültür M9 + eşit hacimde tekrar süspansiyon haline getirin; tekrarlayın. Ikinci yeniden süspansiyon sonra 2 saat oda sıcaklığında büyüme devam etmektedir. </li><li> 40 dk için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehid (pH = 7.4) ile indüklenen kültür düzeltildi. PBS eşit hacimde Pelet kültür ve tekrar süspansiyon; tekrarlayın. Görüntüleme canlı hücreler varsa, eşit hacimde fiksasyon, pelet kültür ve tekrar süspansiyon atlayınM9 arasında - [M9 Tuzlar,% 0.4 glikoz, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, MEM Amino Asitler]; tekrarlayın. </li><li> Yeniden süspanse kültürü ile 1:10 altın boncuk seyreltin. (Adım 2.4) hazırlanmış görüntüleme odasına örnek uygulayın. </li></ol> [1] Not: Yukarıdaki indüksiyon protokol (adım 1.1-1.3) suşu JB281 ifade sistemi için optimize edilmiştir. Ayrıntılı indüksiyon koşullarında diğer ilgi ifade sistemleri veya proteinler için değişebilir. 2. Görüntüleme Odası Meclis <ol><li> - M9 içinde bir% 3 (w / v) solüsyonu agaroz edin. 40min bir tezgah üst ısıtma bloğu 70 agaroz ° C eritin. Mağaza kadar 5 saat için 50 ° C&#39;de agaroz eridi. </li><li> Aşağı bakacak şekilde elektrotlar ile görüntüleme odasının üst yarısında bir temiz microaqueduct slayt yerleştirin. Perfüzyon kanalları kapsayacak şekilde microaqueduct slaytta alt contasını. </li><li> Cam merkezine eritilmiş agaroz ~ 50 ul uygulaslayt. Temiz, kuru bir lamel ile hemen üst agaroz jel damlacık. Jel 30 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya bırakın. <ol><li> Lamelleri temizlemek için: bir seramik tutucu lamelleri düzenlemek ve aseton, etanol ve cam kavanozlarda 1M KOH banyoları dönen 20 dakika sonikasyon. DH 2 O., tek bir sonikasyon takiben, 9 sonications toplam döngüsü, üç kez tekrarlayın Taze dH 2 O içinde temizlenmiş lamelleri Mağaza Kullanmadan önce, filtrelenmiş hava ile kuru lamelleri darbe. </li></ol></li><li> Dikkatlice microaqueduct slayt üzerinde jel pedi bırakarak, lamel çıkarın. Hemen jel pedi üst hücre kültürü örnek 1 ul (adım 1.6 bakın). Çözüm jel pedi tarafından absorbe edilmesi için izin ~ 2 dakika bekleyin. Yeni, temiz, kuru lamel ile Top jel pedi. Üreticinin talimatlarına göre tüm görüntüleme odasının birleştirin. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Mikroskop, kamera ve lazer açın. MetaMorph yumuşak açmal (Moleküler Cihazlar). </li><li> Görüntüleme yolu uygun uyarma / emisyon filtresi (Şekil 1) yerleştirin. </li><li> Buna göre lazer güçler ve satın alma ayarları. <ol><li> 488-nm lazer = 15 mW (Not # 2) </li><li> 561-nm lazer = 75 mW </li><li> 405-nm lazer = 2 mW ± nötral yoğunluk filtresi (Not # 3) </li></ol></li><li> Tamamlayıcı sahne adaptör aracılığıyla aşamaya görüntüleme odasına kilitleyin. </li><li> Homojen üç lazerler ile aydınlatılan uygun bir görüntüleme bölgesi (100x100 piksel) atayın. </li><li> Hücreleri ve yakın konvansiyonel işaretleri (altın boncuk) ama örtüşmeyen her ikisini içeren bir örnek alan tanımlayın. </li><li> Lamel en yakın hücrelerin yüzeyi üzerinde odaklanma. 50 ms entegrasyon süresi ile bir aydınlık görüntü Edinme ve (Şekil 3Ai) örnek içine odağı 0,5 mikron taşıyın. </li><li> 488-n gelen vak&#39;aları ile topluluğu yeşil floresan görüntü Edinme<html> m lazer 50 ms entegral süre (Şekil 3Aii) kullanarak. </li><li> 405-nm ve 561 nm lazerler sürekli yanması ile kırmızı kanalda streaming video edinin. Sabit hücreler için, 50 ms çerçeve hızı her 1000 kare ~% 10 Rampalı 405-nm lazer gücü ile 20.000 kare (~ 17 dk toplam) toplam (Not # 4) için kullanılır. Canlı hücreler için, 10 ms çerçeve hızı sabit 405 nm lazer gücünde 3.000 kare (~ 30 toplam) toplam için kullanılır. </li><li> Hücrelerin alt yüzeyine odak geri hareket ettirmek ve aşama 3.7 &#39;de olduğu gibi başka bir aydınlık alan görüntü alma. </li></ol> [2] Not: bir hücrenin yeşil floresans yoğunluğunu entegre hücre içinde ifade FtsZ-mEos2 moleküllerinin toplam sayısıyla doğru orantılıdır. 488-nm uyarma ve güç elde etme topluluk floresan ayarlar göreli FtsZ-mEos2 çeşitli hücrelerde ifade seviyeleri karşılaştırıldığında, böylece tüm hücreler için sabit tutulmalıdır. ontent &quot;&gt; [3] Not:. sabit hücreler her bir molekülün kesin olarak tespit edilebilir, böylece yavaş bir aktivasyon oran elde etmek için yerinde Doğal Yoğunluk (ND) filtre (Şekil 1, optik bileşeni # 5) ile görüntülü bir kırınım-sınırlı bir alanda aynı anda aktif olan iki molekül bir düşük olasılık korurken görüntüleme, hücrelerin aktivasyonu oranını artırmak için yaşamak ne ND filtre kaldırılır. hızlı bir oranda canlı hücre görüntüleme uygulanan toplam satın alma süresini azaltmak için gereklidir, böylece zaman içinde Z-halka &quot;dondurma&quot; ve hücre için fotohasar etkisini sınırlayan. [4] Not: Elde edilen kare sayısı bizim sistem için ve belirli hücre yapısına bağlıdır edildi, yoğunluk etiketleme aktivasyon oranı ve florofor tüm havuz yorucu olup olmadığını analiz için önemlidir. Canlı hücreler, bu ti olduğu kadar kısa bir süre içinde lokalizasyonları yeterli sayıda elde etmek için önemlidirBana en hücresel yapının hareketinin neden olduğu görüntünün bulanık olmaması için. 4. PALM Görüntü İnşaat <ol><li> Algılanan her nokta Centroid konumunu belirleyin. <ol><li> Matlab (MathWorks, Inc) içine görüntü yığınını yükleyin. </li><li> Tüm indirgeme boncuk dışlayan bir hücre etrafında bir bölgeye Görüntü yığını kırpın. </li><li> Arka seviyesinden, ama ortalama spot yoğunluğu altında nokta tespiti için bir yoğunluk eşik seçin. Biz 150 çerçeve penceresini kullanarak maksimum yoğunluk çalışan ortalaması hesaplanarak bir deney boyunca arka düzeyde varyasyon için hesap. Her çerçeve için yoğunluğu eşik sonra çalışan ortalama değerlerden enterpolasyonlanan. </li><li> Her bir çerçeve ilgili eşik çıkarın. Aday noktalar eşiğin üstünde şiddetleri ile üç bitişik pikseller olarak tanımlanır. </li><li> Iki boyutlu Gaussia her prospektif spot floresan yoğunluğu Fitn işlevi [Denklem # 1] doğrusal olmayan en küçük kareler algoritması (Şekil 2) kullanılarak. Her nokta lokalizasyonu hassas tespit fotonların toplam sayısı [Denklem # 2] kullanılarak hesaplanır. Bir yerelleştirme hassas Herhangi kötü kesim yerinde 20&#39;den fazla nm (sabit hücreler) ya da 45 nm (canlı hücreler) (Not # 5) atılır. Örtüşen yayıcılar nedeniyle muhtemelen ortalama yoğunluk, iki kat daha fazla bir yoğunluk ile her bir nokta da atılır. </li><li> Sabit hücreler için, kimin sentroid pozisyonu 45 nm içinde herhangi bir nokta göz ardı tarafından aynı molekülün tekrarlanan gözlemlere kaldır 6 veya daha az çerçeve tarafından öncesinde başka bir nokta. Canlı hücreler için tüm noktalar korunur. </li></ol></li><li> Indirgeme işaretleyici hareket kullanarak örnek sürüklenme kalibre. <ol><li> Bir indirgeme işareti etrafında bir 10x10 piksel bölgedeki kırpın. </li><li> Her bir çerçeve 4.1.3 olarak belirlenen ilgili eşik çıkarın. </li><li> Her yoğunluk profili Fiten küçük kareler uydurma algoritması ile çerçevesi iki boyutlu bir Gauss şekli varsayarak. </li><li> Çerçeve 1 göreli Centroid pozisyonları arasındaki deplasman hesaplayın. </li></ol></li><li> 4.2 hesaplanan uygun numune sürüklenme ile 4.1 belirlenen her benzersiz molekülün Centroid konumunu düzeltin. 3.7 ve 3.10 &#39;da elde edilen aydınlık görüntüleri karşılaştırın. Hücreler indirgeme işaretleri göre hareket gözlenirse, veri dışarı atılır. </li><li> 15x15 nm piksel oluşan tek bir görüntü üzerinde tüm düzeltilmiş Centroid pozisyonları Superimpose. Localisation hassas [Denklem # 2] eşit bir standart sapma ile Centroid konumda merkezli bir birim alanı, iki boyutlu Gauss profil olarak her benzersiz molekülün çizilir. Bir pikselin yoğunluğu o pikselin bir molekül bulma olasılığını (Şekil 3Aiv) ile orantılı bir olasılık yoğunluk haritası, bu sonuçlar. </li><li> Topluluğu görüntüleri PALM görüntülerini karşılaştırarak. <ol><li> Centro Replot4.4 gibi, ancak 150x150 nm piksel ve 250 nm eşit bir standart sapma ile bir düzlem üzerinde kimliği pozisyonları. Bu 3.8 (Şekil 3Aiii) edinilen kırınım-sınırlı, topluluk görüntü karşılaştırmak için kullanılabilecek bir kırınım-sınırlı bir görüntü, taklit eden bir PALM görüntü oluşturur. </li><li> Tespit molekülleri bütün halkın temsilcisi olduğunu onaylamak için, her iki görüntünün benzer şekil yapılarını göstermek olduğunu onaylamak için deneysel topluluk floresan görüntü (Şekil 3Aii, adım 3.8) ile yeniden topluluğu görüntü (Şekil 3Aiii, adım 4.5.1) karşılaştırmak , yönlendirme ve bağıl yoğunluğu. </li></ol></li></ol> [5] Not: minimum yerelleştirme hassas bir numunedeki tüm moleküller presizyonları çizilmesi ve uygun bir kesme belirleyerek, her bir görüntüleme yöntemi için deneysel olarak tespit edilmiştir. 5. PALM Görüntü Analizi <ol><li> Z-Ring widt Ölçmeh ve Çap. <ol><li> Böylece dikey olarak yönlendirmek hücrenin uzun ekseni (Şekil 4A) ile PALM görüntü döndürün. </li><li> Z-halkası içeren hücresel bölge kırpın. </li><li> Hücrenin uzun ekseni boyunca bir yoğunluk profili yansıtarak kümülatif yoğunluğu hesaplayın. </li><li> Bir Gauss dağılımı yoğunluk profili takın. Halka genişlik donatılmış Gauss dağılımı tam genişliğinde yarı maksimum (FWHM) (Şekil 4B) olarak tanımlanır. </li><li> Hücrenin kısa ekseni boyunca 5.1.2 kümülatif yoğunluk profili yansıtın. Halka çapı yoğunluk profili (Şekil 4C) olan tam uzunluğu olarak tanımlanır. </li></ol></li><li> (Not # 6) FtsZ Yoğunluk çiziliyor. <ol><li> (4.4) &#39;de anlatılanla sentroid pozisyonları Replot, ancak her bir eşsiz molekül 1 değeri verilmiştir ve sentroid pozisyonu karşılık gelen bir tek piksel tayin edecek şekilde Gauss profil olmadan. Her biri, bu şekilde, yoğunlukbu piksel piksel tespit moleküllerinin toplam sayısını temsil eder. Yoğunluk PALM görüntü de bir kontur arsa (Şekil 5E) olarak görüntülenebilir. </li></ol></li><li> Uzaysal Çözünürlük belirlenmesi. <ol><li> Teorik-başarılabilir uzaysal çözünürlüğü: algılanan tüm moleküllerinin ortalama tespit lokalizasyonu hassas kullanarak tüm numune için temsili bir PSF oluşturun ve FWHM (Denklem # 3) hesaplayabilirsiniz. </li><li> Deneysel-elde uzaysal çözünürlüğü: Aynı molekül tekrar gözlemler arasındaki ortalama deplasman hesaplamak. </li></ol></li></ol> [6] Not: hücre / cam arayüzü üzerinde ince bir tabaka (~ 200 nm) aktivasyon ve uyarma kısıtlamak için (TIR-PALM, Şekil 1 ve 5) toplam iç yansıma PALM kullanılır. böylece lamel en yakın olan membran ile ilişkili sadece FtsZ molekülleri tespit edilecektir.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

PALM görüntüleri başka yollarla elde etmek zordur hedef protein moleküllerinin dağılımı ve düzenlenmesi detaylı analizi izin molekül sayısı ve hücre içindeki konumları hakkında bilgi içerir. Aşağıda PALM görüntülerin biyolojik alaka korurken doğru kantitatif bilgileri ayıklamak için alınması gereken önlemler özetlemektedir. Biz de en iyi canlı vs sabit hücreler kullanılarak elde edilebilir bilgileri inceleyebilirsiniz. Son olarak, biz hücre bölünmesi makine hakkında ek süper-çözünürlük bilgi edinme yolları önermek. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 50 x MEM Amino Asitler </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitaminler 100 x </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td> Elektron Micrsocopy Bilimleri </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agaroz </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Altın Boncuk </td><td> Mikroküreler-nanokürecikler </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Görüntüleme Odası </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sahne Adaptör </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Ters Mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, 60x Amaç </td><td> Olimpos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Kamera </td><td> Andor Teknoloji </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Safir Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Safir Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

bakteriyel bölümü makine super çözünürlüklü görüntüleme

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bakteriyel hücre bölünmesi midcell 1,2 de daha on temel proteinin koordineli montaj gerektirir. Bu sürecin temelinde bölünme planı 3,4 de FtsZ protein tarafından bir halka benzeri suprastructure (Z-ring) oluşumudur. Z-halka birden fazla tek sarmallı FtsZ protofilaments oluşur, ve Z-halka içinde protofilaments düzenlemesini anlama bir güç jeneratörü 5,6 olarak Z-halka montaj ve işlevi mekanizma fikir sunar. Bu bilgiler, geleneksel floresan ve elektron mikroskopi nedeniyle mevcut sınırlamalar zor kalmıştır. Geleneksel floresan mikroskobu ışığın kırınım sınırı (~ 200 nm) nedeniyle Z-halkasının bir yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayamaz. Elektron cryotomographic görüntüleme küçük C. FtsZ protofilaments dağınık algıladı crescentus 7 hücreleri, ancak bu gibi büyük hücreleri uygulamak zordurE. coli ya da B. subtilis. Burada bir süper-çözünürlük floresans mikroskopi yöntemi uygulama tanımlamak, fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM), kantitatif E. yapısal organizasyonu karakterize etmek coli Z-ring 8. PALM görüntüleme hem yüksek uzaysal çözünürlük (~ 35 nm) ve hedef proteinleri açık olarak tanımlaması sağlamak için özel etiketleme sunmaktadır. Biz 405 nm 9 aktivasyonu üzerine kırmızı floresan (eksitasyon = 561 nm) ve yeşil floresan (eksitasyon = 488 nm) geçer photoactivatable floresan proteini mEos2 ile FtsZ etiketli. Bir hurma deney esnasında, tek FtsZ-mEos2 moleküller stokastik olarak aktive edilir ve tek molekül karşılık gelen pozisyonlarda sentroid &lt;20 nm hassas bir şekilde tespit edilir. Z-halkasının bir süper çözünürlüklü görüntü sonra tüm tespit FtsZ-mEos2 moleküllerin Centroid pozisyonları atma tarafından yeniden yapılmıştır. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu yöntemi kullanarak, biz Z-ring ~ 100 nm sabit bir genişliğe sahip ve üç boyutta birbirleriyle örtüşen FtsZ protofilaments gevşek bir paket oluştuğunu buldu. Bu veriler, Z-halka 10, hücre devre bağımlı değişiklikleri daha ileri araştırmalar için bir sıçrama sağlamak ve ilgili diğer proteinler ile uygulanabilir.

Yukarıda tarif PALM görüntüleme yöntemi üretilen Z-halkanın iki-boyutlu, süper-çözünürlük oluşturmasıdır Şekil 3Aiv &#39;de gösterilmiştir. Aşağıda, onları elde edilebilir nitel ve nicel bilgiyi özetleyebilir. Nitelik, biz Z-ring konvansiyonel floresans görüntüleri (Şekil 3A-Dii ve iv karşılaştırın) olarak ayırt edilemeyen çoklu konfigürasyonlar (tek band veya sarmal yay) benimser düzensiz bir yapıda olduğu görülmektedir. Bu gibi gözlemler, ...

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doğal ortamlarında e coli hücre bölünmesi proteinleri hakkında nicel yapısal bilgi elde etmektir. Bu, canlı hücrelerde bir fotoaktif floresan füzyon proteininin eksprese edilmesi ve bu hücrelerin bir akro jel ped üzerinde hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. Hücreler daha sonra video akışı yoluyla görüntülenir.Tek molekül konumlarını görselleştirmek için uyarma ve aktivasyon lazerleri uygulanırken, elde edilen filmler, molekül konumlarını nanometre hassasiyetinde çıkarmak ve süper çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için üst üste bindirmek için hesaplamalı olarak analiz edilir. Bu görüntü daha sonra, boyutları ve molekül yoğunluğu da dahil olmak üzere ilgilenilen yapıyı tanımlayan çeşitli nicel ölçümlerle analiz edilebilir. Foto ile aktive edilen lokalizasyon, mikroskopi veya avuç içi, kolayca uygulanan bir süper çözünürlüklü floresan mikroskobu tekniğidir.Enstrümantasyon basittir, ancak güvenilir sonuçlar elde etmek için veri toplama ve analizinin dikkatli bir şekilde optimizasyonu gereklidir. Bir diğer önemli adım, sonuçlarınızın biyolojik olarak alakalı olmasını sağlamak için füzyon proteininizin ve ekspresyon seviyenizin karakterizasyon der

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır...

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Bu makale, Proteus mirabilis biyofilmleri için özel olarak tasarlanmış bir Genleşme Mikroskobu tekniği olan PmbExM için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. PmbExM, izotropik, 4,3 kat genişleme elde etmek için biyofilm numunelerinin aşamalı olarak enzimatik bir şekilde işlenmesini kullanır ve bu sapsız mikrobiyal topluluklar içindeki hücresel ve hücre altı yapıların uzamsal organizasyonunun süper çözünürlüklü analizini sağlar.

Proteus mirabilis Biyofilminin Genleşme Mikroskobu ile Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Öğrenin bakteriyel hücre bölünmesinde FtsZ-halka yapısını PALM tekniği ile süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik E. coli sitoskeletal proteinlerinin nanometre hassasiyetinde analizini sağlar.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Daha fazla video keşfet