Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doğal ortamlarında e coli hücre bölünmesi proteinleri hakkında nicel yapısal bilgi elde etmektir. Bu, canlı hücrelerde bir fotoaktif floresan füzyon proteininin eksprese edilmesi ve bu hücrelerin bir akro jel ped üzerinde hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. Hücreler daha sonra video akışı yoluyla görüntülenir.

Tek molekül konumlarını görselleştirmek için uyarma ve aktivasyon lazerleri uygulanırken, elde edilen filmler, molekül konumlarını nanometre hassasiyetinde çıkarmak ve süper çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için üst üste bindirmek için hesaplamalı olarak analiz edilir. Bu görüntü daha sonra, boyutları ve molekül yoğunluğu da dahil olmak üzere ilgilenilen yapıyı tanımlayan çeşitli nicel ölçümlerle analiz edilebilir. Foto ile aktive edilen lokalizasyon, mikroskopi veya avuç içi, kolayca uygulanan bir süper çözünürlüklü floresan mikroskobu tekniğidir.

Enstrümantasyon basittir, ancak güvenilir sonuçlar elde etmek için veri toplama ve analizinin dikkatli bir şekilde optimizasyonu gereklidir. Bir diğer önemli adım, sonuçlarınızın biyolojik olarak alakalı olmasını sağlamak için füzyon proteininizin ve ekspresyon seviyenizin karakterizasyon derecesidir. Aşağıdaki protokol, FTSZ proteini kaynaşmış Muse iki için optimize edilmiştir ve ilgilendiğiniz proteine uyarlanmalıdır.

Başlamak için, LB besiyerini, yazılı protokolde tarif edildiği gibi hazırlanan, floresan olarak yapıştırılmış bir protein içeren ilgilenilen suşun tek bir kolonisi ile aşılayın. Bu videoya eşlik ederek, ertesi gün 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda gece boyunca büyütün. Kültürü bir ila 1000 M dokuz artı minimum ortama seyreltin.

Oda sıcaklığında uygun antibiyotik varlığında orta log fazına kadar büyütün ve daha sonra kültürü iki saat boyunca 20 mikromolar IPTG ile protein üretmeye teşvik edin. Bu arada, M dokuz eksi ortamda% 3'lük bir tarımsal çözelti yaparak görüntüleme odasını monte edin. Agroları 70 santigrat derecede tezgah üstü bir ısı bloğunda 40 dakika eritin.

Erimiş agrosları 50 santigrat derecede beş saate kadar saklayın. Görüntüleme odasının üst yarısına, elektrotlar aşağı bakacak şekilde temiz bir mikro su kemeri sürgüsü yerleştirin. Alt contayı, perfüzyon kanallarını kapatacak şekilde mikro su kemeri sürgüsü üzerine hizalayın.

Erimiş aroslardan yaklaşık 50 mikrolitre olarak bardağın ortasına sürün. Agros jel damlacığını hemen temiz, kuru bir örtü sürgüsü ile kaydırın. Protein indüksiyonunu takiben jelin oda sıcaklığında en az 30 dakika katılaşmasına izin verin.

Kültürü bir mikro santrifüjde peletleyin. Resus. Peleti eşit bir hacimde M dokuzda askıya alın, ayrıca ikinci yeniden süspansiyondan sonra santrifüjlemeyi ve yeniden süspansiyonu tekrarlayın. İki saat boyunca oda sıcaklığında büyümeye devam edin.

Daha sonra, %4'lük bir paraform aldehitlik nihai konsantrasyonu elde etmek için PBS'ye paraform aldehit ekleyerek indüklenen kültürü sabitleyin. Canlı hücrelerin görüntülenmesi, prosedürdeki değişiklikler için bu videoya eşlik eden yazılı protokole bakarsanız, kültürün oda sıcaklığında 40 dakika inkübe etmesine izin verin. Kültürü peletleyin ve eşit hacimde PBS'de yeniden süspanse edin.

Daha sonra, 50 nanometre altın boncukları, bir ila 10 oranında Yeniden Askıya Alınmış kültür ile seyreltin. Numuneyi hazırlanan görüntüleme odasına uygulamak için, jel pedi mikro su kemeri sürgüsü üzerinde bırakarak kapak fişini dikkatlice çıkarın. Jel pedin üstüne hemen bir mikrolitre hücre kültürü örneği ekleyin.

Solüsyonun jel ped tarafından emilmesi için yaklaşık iki dakika bekleyin ve jel pedi yeni, temiz, kuru bir örtü astarı ile doldurun. Tüm görüntüleme odasını üreticinin görüntü alma talimatlarına göre monte etmeye devam edin. Mikroskop kamerasını ve lazerleri açın.

Moleküler cihazlarla metamorf yazılımı açın. Uygun uyarma ve emisyon filtrelerini, bu videoya eşlik eden yazılı prosedürde bulunabilecek olan bu mikroskop şemasında gösterildiği gibi görüntüleme yoluna yerleştirin. Ardından, Lazer güçleri ve edinme ayarlarını ayarlayın.

Görüntüleme odasını tamamlayıcı s'ye uygun şekilde kilitleyin.tage adaptörü. Kapak kayma dudağına en yakın hücrelerin yüzeyine odaklanın. Her üç lazer tarafından homojen bir şekilde aydınlatılan uygun bir görüntüleme bölgesi belirleyin.

Hem hücreleri hem de referans işaretleyicileri içeren, birbirine yakın ancak örtüşmeyen altın boncuklar olan bir örnek alanı tanımlayın. 50 milisaniye entegrasyon süresine sahip bir parlak alan görüntüsü elde edin ve odağı 0,5 mikrometre boyuttaki örneğe taşıyın. Ardından, 50 milisaniyelik bir entegrasyon süresi kullanarak 488 nanometre lazerden uyarılmış bir topluluk yeşili floresan görüntüsü elde edin.

Ardından, 405 nanometre ve 561 nanometre lazerlerden sürekli aydınlatmalı video akışı elde edin. Sabit hücreler için, toplam 20.000 kare için 50 milisaniyelik bir kare hızı kullanılır. Burada her 1000 karede bir yaklaşık %10 oranında artırılan 405 nanometre lazer gücü ile ilk 500 kare gösterilmektedir.

Elde edilen çerçeve sayısının bu sistem için optimize edildiğini ve belirli hücresel yapıya bağlı olduğunu unutmayın. Etiketleme, yoğunluk, aktivasyon oranı ve tüm zemin zemin havuzunun tüketilip tüketilmediği, görüntü yapısını gerçekleştirmek için analiz için önemlidir. İlk olarak, görüntü akışındaki olası noktaları, ampirik olarak belirlenmiş bir eşiğin üzerindeki yoğunluklara sahip üç bitişik piksel olarak, her bir olası noktanın yoğunluğunu iki boyutlu bir Gauss fonksiyonuna uydurarak tanımlayın.

Molekül konumunu ve yayılan fotonların toplam sayısını belirlemek için, tespit edilen toplam foton sayısını kullanarak her bir noktanın lokalizasyon konumunu hesaplayın. Daha sonra, lokalizasyon hassasiyetinin bir eşiğini uygulayarak kötü oturan noktaları atın ve numune kayması için doğru olan herhangi bir ilerleyen noktanın 45 nanometre ve altı kare içindeki herhangi bir noktayı göz ardı ederek aynı molekülün tekrar gözlemlerini kaldırın. Altın boncukların her molekül konumundan çerçeveye bağlı yer değiştirmesini çıkararak, düzeltilmiş tüm molekül konumlarını 15 x 15 nanometre pikselden oluşan tek bir görüntü üzerine bindirin, her benzersiz molekülü bir birim alan, iki boyutlu Gauss profili olarak çizin.

Ortaya çıkan görüntü, bir pikselin yoğunluğunun bir molekül bulma olasılığıyla orantılı olduğu bir olasılık yoğunluk haritasıdır. Bu Pikselde gösterilmiştir. İşte Palm Görüntüleme Yönteminden oluşturulan ZR'nin iki boyutlu süper çözünürlüklü bir görüntüsü.

Niteliksel olarak, Z halkasının, geleneksel floresan görüntülerde ayırt edilemeyen tek bantlar veya sarmal yaylar gibi çoklu konfigürasyonları benimseyen düzensiz bir yapı olduğu gözlemlendi. Bu gibi gözlemler, belirli bir yapısal konfigürasyon sergileyen hücre popülasyonunun yüzdesini belirlemek için kullanılabilir. ZR'nin boyutları da bu grafikten ölçülebilir.

Halka genişliği ise 113 nanometre olarak belirlendi. Bu değer, in vitro elektron mikroskobuna dayalı olarak beş ila 10 nanometre olan tek bir FDSC proto filamentinin beklenen genişliğinden daha geniştir. Burada halka çapı 1050 nanometre olarak ölçülmüştür.

Bu çap, hücre bölünmesi sırasındaki daralma derecesini kantitatif olarak tanımlamak için kullanılabilir. Başka bir nicel yaklaşım, tanımlanmış bir bölge içinde lokalize olan moleküllerin sayısını sayarak molekül yoğunluğunu hesaplamaktır. Avuç içi görüntüleri, 3B nesnelerin 2B projeksiyonları olduğundan, algılama düzlemini Z halkasının tek bir tarafıyla sınırlamak için toplam iç yansıma veya TIR avuç içi kullanılmalıdır.

Çizilen moleküller toplam FDSC popülasyonunun bir alt kümesini temsil ettiğinden, belirlenen yoğunluk gerçek yoğunluğun bir alt sınırıdır. Z halkasının TIR görüntülerinde gözlemlenen maksimum yoğunluk, bazı bölümlerin üst üste binen proto filamentler içerdiğini göstermektedir. Bu prosedüre katılırken, füzyon proteininizin ekspresyonunun hücre canlılığını etkilemediğinden emin olmak için hücre morfolojisini ve büyüme hızını izlemek önemlidir.

İlgilendiğiniz protein için bu prosedür oluşturulduktan sonra, hücre döngüsü ilerlemesi ile ilişkili yapısal değişiklikleri test etmek için kullanılabilir veya birden fazla proteinin yüz dağılımlarını karşılaştırmak için iki renkli görüntülemeye daha da genişletilebilir.