Name: Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin hipokampal nöronlarda DNA hasarını Comet Assay yöntemiyle ölçmeyi. Bu hassas teknik, tek tek hücrelerde DNA bütünlüğünü değerlendirerek nörodejeneratif hastalık araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Radyasyon Onkolojisi, Alabama-Birmingham Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi&#39;nde, Dövüş Çocuk Kanser Vakfı ve Gabrielle&#39;in Angel Vakfı (ESY için.) Bölümü IMPACT Ödülü ile desteklenmiştir.

1. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür nöronal hücrelerin ve onları gerektiği gibi davranın. </li><li> 15 ml&#39;lik tüp içine hasat hücreleri: aspiratı ortam, fosfat ile durulama (PBS, kalsiyum ve magnezyum serbest) tamponlu tuzlu su, 15 ml tüp içinde toplamak ve uygun bir serum ihtiva eden ortam ile nötralize tripsin, tripsin ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 xg Spin. </li><li> Medya aspire. </li><li> PBS içinde hücreler yeniden süspanse edin. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 xg Spin. </li><li> Taze PBS içinde medya ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. </li><li> Bir hemasitometre veya tercih ettiğiniz hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Hücre numuneleri deney başlamadan hemen önce hazırlanmalıdır. </li><li> Tüm numuneler, morötesi ışık DNA hasarı önlemek için ya da koyu sarı ışık altında ele alınmalıdır. </li></ol> 2. Comet Assay 1. Slayt Hazırlama <ol><li> % 1 agaroz (1X Tris Base, Borik asit, EDTA, TB ve 1 g / 100 ml eritinE) 3 dakika süreyle mikrodalga tüm granül kayboluncaya kadar. </li><li> Dip erimiş agaroz içine slaytlar ve bir tarafı silin bir Kimwipe ile temizleyin. Şeffaf bir film kuruması için agaroz izin verin. Bu muhafaza edilebilir ve önceden kızak içinde yapılabilir. </li></ol> 2. Nötr Comet Assay <ol><li> Kullanımdan önce en az 1 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta erimesi Chill çözeltisi (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris baz,% 1 sodyum lauril sarkosinat, ve% 1 Triton X-100, pH 10). </li><li> 2.2.2. Tüm granül kayboluncaya kadar bir mikrodalga% 1 düşük erime noktası agaroz (1X Tris Bankası&#39;ndaki 1 g / 100ml, Borik asit, EDTA) 3 dakika eritin. Agaroz kuyruklu kuyruk yapay indüksiyon önlemek için ° C&#39;de bir su banyosu içinde 37 kadar soğutuldu gerekmektedir. İdeal olarak, agaroz kullanımdan önce yarım saat için soğutulması gerekmektedir. </li><li> 2.2.3. , Ml başına 100,000 hücre olup, böylece hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Düşük erime noktası agaroz (37 ° C) ile hücre süspansiyonu Kombine1:10 (v / v), girdap kısaca, oranı ve hemen Comet slayt üzerine 50 ul pipetle. Örnek alan üzerinde eşit hücre süspansiyonu yaymak için pipet ucu tarafını kullanın. Her tedavi grubu en az üç kopya halinde olmalıdır. </li><li> Bir daire slayt periferinde görünene kadar Sıra 30 dakika boyunca buzdolabında düz kayar. </li><li> Prechill 4 karanlıkta 30 dakika için bu çözelti içinde lizis çözelti daldırın ve slaytlar ° C&#39;de (ya da bir soğutma cihazı olarak). </li><li> Kapalı dökün veya lizis çözüm aspirat ve 1X nötr elektroforez tamponu (Tris baz, Borik asit, EDTA, 1X TBE) ekleyin. Buzdolabında yarım saat bu tampona slaytlar bırakın. </li><li> Elektroforez odasında önceden soğutulmuş 1X Nötr Elektroforez Tamponu (TBE), elektroforez slayt tepsisine yerleştirin slayt ekleyin. Onlar elektrotlar eşit uzaklıkta olacak şekilde slaytlar hizalayın. </li><li> 1X nötr elektroforez slaytlar üzerinde 0,2 inç kadar tampon dökün. Aşırı tampon arası olacakelektroforezi ile Fere. </li><li> Cm başına 1 V (elektrot elektrot ölçülür) güç kaynağı gerilimini ayarlayın ve karanlıkta 4 ° C (veya soğuk oda) 30 dakika boyunca çalıştırın. </li></ol> 3. Alkali Comet Assay <ol><li> Kullanımdan önce en az 1 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta erimesi Chill çözeltisi (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris baz,% 1 sodyum lauril sarkosinat, ve% 1 Triton X-100, pH 10). </li><li> Tüm granül kayboluncaya kadar 3 dakika boyunca mikrodalga içinde% 1 düşük erime noktası agaroz (1X Tris Bankası&#39;ndaki 1 g / 100 ml, Borik asit, EDTA) eritin. Sonra en az 30 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda soğutulur. </li><li> 1:10 (v / v), girdap kısaca, bir oranında erimiş düşük bir erime noktasına sahip agaroz 1 x 105 / ml arasındadır (37 ° C) hücreleri ile birleştirin ve hemen Comet slayt üzerine 50 ul pipetle. Örnek alan üzerinde eşit hücre süspansiyonu yaymak için pipet ucu tarafını kullanın. Her tedavi grubu en az üç kopya halinde olmalıdır. </li><li> Sıra kaydırdıes düz 30 dakika buzdolabında bir daire slayt periferinde görünene kadar. </li><li> Lizis çözelti içinde önceden soğutulmuş ve 4 ° C&#39;de bırakmak karanlıkta gece boyunca, 1 saat için Immerse kayar. </li><li> Lizis çözüm slaytları çıkarın, slaytlar boşaltın ve alkali gevşemek adım öncesinde kalan deterjan ve tuzları kaldırmak için 5 dakika süreyle soğuk nötralizasyon tamponu ile bir kez yıkayın. </li><li> Bir jel elektroforez odasında Sıra slaytlar slaytları yukarıda 0.5 cm geçmeyecek şekilde önceden soğutulmuş taze yapılmış elektroforez tamponu (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,&gt; 13 pH) ile doldurulur. Onlar elektrotlar eşit uzaklıkta olacak şekilde slaytlar hizalayın. </li><li> Slaytlar DNA ve alkali sorumlu hasar ifade çözülmesi için izin vermek için karanlıkta 30 dakika süreyle alkalin tampon bekletin. </li><li> Cm başına 1 V (elektrot elektrot ölçülen) güç kaynağı gerilimi ayarlayın ve 4 az 30 dakika çalıştırın ° C (veya soğuk oda). </li></ol> 4. Tespit ve Staining Hücreler <ol><li> Aşırı Elektroforez Tampon boşaltın </li><li> Daldırın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca önceden soğutulmuş damıtılmış su içinde kayar. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca önceden soğutulmuş% 70 etanol içinde Immerse kayar. </li><li> Gecede Kuru örnekleri. Parlak ışık slaytlar maruz bırakmayın. Numuneler bu aşamada puanlama için oda sıcaklığında ay boyunca muhafaza edilebilir. </li><li> Buzdolabında 20 dakika SYBR Green (PBS içinde seyreltilmesi 1X) daldırarak slaytlar Leke. </li><li> Slaytları çıkarın ve onları karanlıkta tamamen kurumasını bekleyin. Tamamen kuru agaroz şeffaf hale gelecektir. </li></ol> 4. Görüntü Toplama ve Analizi <ol><li> Yeşil filtre (Zeiss AxioVision) ve Comet Assay yazılım (Algısal Instruments) kullanılarak analiz ayarlanır floresan mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. </li><li> &quot;Kuyruklu kafa&quot; (çekirdeği) üzerine tıklayın ve yazılımı içinde ortalama kuyruk momenti ve DNA miktarı dahil parametreleri hesaplarçekirdek. </li><li> Tedavi başına en az 200 hücre analiz edin. </li><li> Microsoft Excel&#39;e veri verme. </li><li> Her tedavi grubu ve uygun arsa verileri için kuyruk momenti ortalama hesaplayın. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Nöron hücreleri üzerinde kuyruklu tahlil analizinin bir örneği Şekil 2 ve Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu durumda, nöronal hücrelerin ışınlama DNA hasarına neden olmaktadır. Hücreler elektrik alanına maruz gibi, DNA daha sonra Comet Test yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir boyut farklılıklara bağlı olarak farklı hızlarda geçirir. Daha fazla DNA hasarı, uzak DNA çekirdek dışında geçirir. Bu sonradan yüksek kuyruk anda yazılım ve sonuçları tarafından alınır çekirdeğinde floresan yoğunluğu azalır. Tablo 1 comet assay analizi ve Şekil 4 bir temsilci tablo gösteriyor bir temsilcisi gösterirniteliksel grafiği comet assay ile ölçülen radyasyon sonrasında nöronal hücrelerde DNA tahribatına karşılaştırarak. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Kuyruklu testin Akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Nöron hücrelerinin Örnek görüntü (A) olmaksızın ve (B) kuyrukluyıldız kuyruk ile. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Comet Assay yazılımı kullanarak Şekil 3. Comet assay analizi. (A) görüntü Temsilcisi ekran görüntüleri Carl Zeiss floresan mikroskop kullanılarak kazanılmış ve Comet kullanılarak analizTest yazılımı. (B) nukleus ya da &quot;kuyruklu kafa&quot; (yeşil daire) tıkladığınızda bir floresan harita ve grafik (sarı daire içinde) ve (C) veri tablosu (kırmızı daire) oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> Şekil 4. Nötr comet assay kullanarak ışınlanmış ve ışınlanmamış nöronal hücrelerde DNA tahribatına çözümlenmesiyle elde edilen ortalama kuyruk momenti komplo ile elde Temsilcisi grafiği. Beklendiği gibi ışınlanmış nöronal hücrelerde yüksek ortalama kuyruk momenti tarafından gösterildiği gibi, 3 Gy radyasyon (x-ray), DNA hasarı indükler. , ** P &lt;0.01 - ortalama kuyruk momenti (Standart hata + /) olduğu gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tablo 1"/> Tablo 1. </strong&gt; ışınlanmış ve ışınlanmamış nöronal hücreler üzerinde kuyruklu testi analizi ile elde Örnek tablo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li>
<li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li>
<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Comet assay bireysel hücrelerin analiz eşsiz kapasitesine sahiptir. Bu sitotoksik ajanlara diferansiyel tepki göstermek hücrelerinin alt popülasyonlarının belirlenmesi avantajlıdır. Birkaç pratik sınırlamaları dikkate alınmalıdır. Ayrı ayrı değerlendirilebilir hücrelerin sayısı her bir bağlı olarak değişebilir. Bir popülasyon içindeki DNA hasarı varyans varsa örneklem büyüklüğü artırılmalıdır. Nekrotik ya apoptotik hücrelerin baskın varlığı hata katacak yana Yaşayabilir tek hücre süspansiyonu Bu tahlil için kritik öneme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 1.5 ml&#39;lik tüplere </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris baz, borik asit, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tüp </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Alüminyum folyo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Deney şişesi </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Comet Assay yazılımı </td><td> Comet Assay IV Görüntü Analiz Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silindir </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroforez odası </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan mikroskop </td><td> Zeiss Axio Vizyon </td><td></td><td> Yeşil filtre ile herhangi bir floresan mikroskop yeterli olacaktır </td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük erime noktası agaroz </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrodalga </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat ücretsiz tuzlu, kalsiyum içermeyen, magnezyum tamponlu </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Güç kaynağı </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Buzdolabı </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cetvel </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Slayt </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum hidroksit </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum lauril sarkosinat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Tepsi </td><td> FisOnu Bilimsel </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Baz </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Girdap </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay kullanma hipokampal nöronlar dna hasarı assaying

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Ilaçların bir dizi DNA onarım yolakları hedef ve hücre DNA hasarı oluşturarak öldürmeye teşvik. Böylece, doğrudan DNA hasarı ölçmek için süreçlerin kapsamlı değerlendirilmiştir. Geleneksel yöntemler zaman alıcı, pahalı, kaynak yoğun ve kopyalayan hücrelerin gerektirir. Buna karşılık, kuyruklu testi, tek hücre jel elektroforezi testi, DNA hasarı ve onarımı daha hızlı, non-invaziv, ucuz, direkt ve duyarlı bir ölçüsüdür. DNA hasarı yanı sıra DNA tamir bütün formları bu güçlü tekniği kullanarak tek hücre düzeyinde görüntülenebilir. Comet assay yatan prensip DNA hasarı bu organizasyon bozan ise intakt DNA çok sipariş olmasıdır. Hasarlı DNA&#39;nın agaroz matriks içine girer ve bir elektrik alanına maruz kaldığında, negatif yüklü DNA pozitif yüklüdür katoda doğru göç eder. Büyük hasarsız DNA ipliklerini çok çekirdek göç etmek mümkün değildir. DNA hasaruzak bozulmamış DNA daha seyahatlerinizde küçük DNA parçaları oluşturur. Comet Assay, bir görüntü analiz yazılımı, tedbirler ve çekirdeğin dışına göç etmiş DNA ile DNA&#39;dan genel floresan yoğunluğu karşılaştırır. Göç DNA&#39;dan Floresan sinyal DNA hasarı ile doğru orantılıdır. Uzun parlak DNA kuyruk artmış DNA hasarı anlamına gelir. Ölçülen parametreler bazıları kuyruk DNA&#39;sının miktarı ve kuyruk, kuyruk uzunluğundaki DNA dağıtımı ve DNA yüzdesi her ikisi de bir ölçüsüdür kuyruk an vardır. Bu testte DNA hasarının çözünürlüğü tamir yerini almıştır anlamına beri yanı DNA onarım ölçmek için sağlar. Duyarlılık sınırı diploid memeli hücre 1,2 başına yaklaşık 50 iplikli kırılır. Örneğin etoposid gibi herhangi bir DNA hasarına neden olan ajan ile muamele Hücreler, bir pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Böylece comet assay DNA hasarı ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemdir.

Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Bu prosedürün genel amacı, COMET testini kullanarak nöronlardaki DNA hasarının miktarını ölçmek ve ölçmektir. Bu, önce nöronları çeşitli DNA hasar koşullarına maruz bırakarak, nöronları toplayarak ve bunları düşük erime noktalı arolarla karıştırarak gerçekleştirilir. İkinci adım, nöronları slaytlar üzerinde hareketsiz hale getirmektir.Daha sonra, nöronlar parçalanır ve daha sonra son adımda elektroforeze tabi tutulur. DNA siber yeşil ile boyanmıştır. Sonuç olarak, floresan mikroskobu ve COMET test yazılımı, bireysel nöronlardaki DNA hasar seviyelerini görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.Merhaba, benim adım Eddie Yang ve Birmingham'daki Alabama Üniversitesi Radyasyon Onkolojisi Bölümü'nde yardımcı doçentim. Bugün, hücrelerdeki DNA hasarını tespit etmek için basit bir yöntem olan COMET testini göstereceğiz. Bu tekniğin, Gamma H iki A X odak boyama ve nabız alanı jel elektroforezi gibi diğer mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu tekniğin DNA hasarını ölçmek için doğrudan ve hassas bir yöntem olmasıdır.Ek olarak, bu tekniğin küçük modifikasyonlarıyla, DNA hasarının türü belirlenebilir, çünkü birçok kanser tedavisi tümörlerde DNA hasarını indükleyerek etki eder ve genellikle DNA onarım kapasitesini değiştirerek etki eder. Bu tekniğin etkileri, kanser tedavisinin etkinliğine doğru genişletilebilir. Bugünkü prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Bayan Samara Noshin olacak, İstenilen deneysel koşullar altında tedavi edilen nöronal hücreleri 15 mililitrelik tüplere toplayarak başlayın.Süpernatan resüsü aspire ettikten sonra tüpleri 1000 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika aşağı döndürün. Peleti PBS'de askıya alın ve ikinci yıkamadan sonra hücreleri tekrar döndürün. Resus, hücreleri daha fazla PBS'de askıya alır, sayın ve kuyruklu yıldız tahlilinde kullanılana kadar karanlıkta tutun.DNA hasarını önlemek için, tahlil işlemine başlamadan önce, tüm granüller kaybolana kadar bir mikrodalgada% 1 aros'u üç dakika eritin. Ardından slaytları erimiş agroslara batırın ve bir tarafını Kim mendiliyle silerek temizleyin. Agros kururken agrosun şeffaf bir film halinde kurumasına izin verin, en az bir saat boyunca dört santigrat derecede soğuk lizis solüsyonu ve daha fazla eritin.% 1 düşük erime noktalı agros. Serin. Bu agros partisi, yarım saat boyunca bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar. Bir kuyruklu yıldız kuyruğunun yapay indüksiyonunu önlemek için, şimdi hasat edilen nöronal hücre süspansiyonunu mililitre başına 100.000 hücre olacak şekilde seyreltin.Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derece düşük erime noktalı agros ile bir ila 10 oranlı bir girdapta kısaca birleştirin ve 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu havayla kurutulmuş kuyruklu yıldız Slaytının numune alanına eşit şekilde yaymak için hemen bir pipet ucunun yan tarafını kullanın. İşlem görmüş slaytları, slaytın çevresinde bir daire görünene kadar 30 dakika boyunca buzdolabında düz bir şekilde yerleştirin. Daha sonra slaytları önceden soğutulmuş lizis çözeltisine batırın, karanlıkta dört santigrat dereceye batırın.30 dakika sonra, lizis çözeltisini aspire edin. Daha sonra slaytları bir x nötr elektroforez tamponunda buzdolabında yarım saat inkübe edin. Ardından, bir elektroforez odasına önceden soğutulmuş bir x nötr elektroforez tamponu ekleyin ve ardından slaytları elektroforez slayt tepsisine yerleştirin ve slaytları elektrotlardan eşit uzaklıkta olacak şekilde hizalayın.Hazneyi, slaytları 0,2 inç bir x nötr elektroforez tamponu ile kaplayacak kadar doldurduktan sonra, güç kaynağı voltajını santimetre başına bir volta ayarlayın ve testi karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika çalıştırın. Yeni agros ve nöronal hücre ile muamele edilmiş slaytları taze önceden soğutulmuş lizis çözeltisine batırarak başlayın ve daha sonra karanlıkta dört santigrat derecede bir saat ila gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, slaytları lizis çözeltisinden çıkarın, boşaltın ve ardından alkali sarma adımından önce herhangi bir kalıntıyı gidermek için beş dakika boyunca soğuk nötralizasyon tamponu ile bir kez durulayın.Daha sonra slaytları, slaytların üzerinde 0,5 santimetreyi geçmeyecek şekilde önceden soğutulmuş, yeni yapılmış elektroforez tamponu ile doldurulmuş bir jel elektroforez odasına yerleştirin. DNA'nın çözülmesine ve alkali sorumlu hasarın ekspresyonuna izin vermek için slaytları alkali tamponda karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Daha sonra testi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santimetre başına bir voltta çalıştırın.Kuyruklu yıldız tahlilini çalıştırdıktan sonra, fazla elektroforez tamponunu boşaltın ve ardından slaytları oda sıcaklığında önceden soğutulmuş damıtılmış suya batırın. Beş dakika sonra, slaytları oda sıcaklığında da önceden soğutulmuş% 70 etanole batırın. Beş dakika daha sonra, numuneleri parlak ışıktan uzak tutarak gece boyunca kurumaya ayarlayın.Daha sonra slaytları buzdolabında 30 dakika boyunca siber yeşil renkte boyayın. Şimdi slaytları çıkarın ve karanlıkta tamamen kurumasını bekleyin. Arolar tamamen kuruduğunda şeffaf hale gelecektir.Tahlilden görüntü elde etmek için yeşil filtreye ayarlanmış bir floresan mikroskobu kullanın. Ardından, elde edilen görüntüleri analiz etmek için COMET tahlil programını açın. Kuyruklu yıldız kafası düğmesine tıklayarak, yazılım ortalama kuyruk momenti ve çekirdekteki DNA miktarı dahil olmak üzere parametreleri hesaplayacaktır.Tedavi başına en az 200 hücreyi analiz ettikten sonra, ortalama kuyruk momentinin hesaplanması ve veri çizimi için verileri Microsoft Excel'e aktarın. Bu ilk şekil, kuyruklu yıldız kuyruğu olan ve olmayan nöronal hücrelerin bir COMET tahlil analizinin bir örneğini göstermektedir. COMET tahlil yazılımı kullanılarak analiz edilen bu ikinci kuyruklu yıldız tahlilinde, nöronal hücrelerin ışınlanmasının, hücreler elektrik alanına maruz kaldıkça DNA hasarına neden olduğu belirlendi.DNA, daha sonra ortak tahlil yazılımı ile analiz edildiği gibi, boyuttaki farklılıklar nedeniyle farklı oranlarda göç etti. Bu ilk ekran görüntüsü, COMET test programı kullanılarak floresan mikroskobu kullanılarak elde edilen temsili görüntüleri göstermektedir. Bir görüntünün çekirdeğine veya kuyruklu yıldız kafasına tıklamak, bir floresan harita grafiği ve veri tablosu oluşturdu.DNA'ya verilen hasar ne kadar fazlaysa, DNA çekirdekten o kadar uzağa göç eder. Bu, yeşil renkle gösterildiği gibi çekirdekteki floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden oldu ve daha sonra daha yüksek bir kuyruk momenti üreten yazılım tarafından tespit edildi. Bu son şekilde, nötr bir COMET testi kullanılarak ışınlanmış ve ışınlanmamış nöronal hücrelerdeki DNA hasarının analiz edilmesiyle elde edilen ortalama kuyruk momentinin temsili bir grafiği, ışınlanmış nöronal hücrelerde daha yüksek ortalama kuyruk momenti ile gösterildiği gibi, beklenen üç gri radyasyonun neden olduğu DNA hasarını göstermektedir.Bu prosedürü denerken, hücreleri dikkatli bir şekilde tutmayı, doğrudan ışığa maruz kalmayı önlemeyi ve pH cinsinden sıcaklığı kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Bu, hücrelerin ek strese maruz kalmaması içindir, bu da sonuçlarınızı değiştirebilir Bu prosedürü takiben. DNA analizi, immünofloresan boyama yoluyla onarım odakları gibi diğer yöntemler, hangi DNA onarım yolaklarının değiştirildiği hakkında ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.Örneğin, RAD 51 odakları veya fosfolar için immünofloresan boyama, DNA PK Odakları sırasıyla homolog rekombinasyon onarımını veya homolog olmayan onarımı ve birleştirme onarımını ölçmek için yapılabilir.

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, zararlı ajanlara maruz kaldıktan sonra DNA hasarını tespit etmek için kuyruklu yıldız testini göstermektedir. Alkali koşullar altında, DNA gevşer ve denatüre olur ve elektroforez üzerine, hasar görmemiş ve hasar görmüş DNA, agaroz jeli içinde farklı şekilde göç ederek kuyruklu yıldız şeklinde bir yapı oluşturur. Yavaş göç eden hasarsız DNA, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluştururken, hızla göç eden hasarlı DNA parçaları, uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturur.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Alkali kuyruklu yıldız testi, ökaryotik hücrelerde DNA ipliği kırılmalarını ölçer. Bir Endonükleaz III veya insan 8-oksoguanin-DNA-N-glikosilaz sindirim adımı ekleyerek, test oksidatif DNA hasarını etkili bir şekilde tespit edebilir. Sıçan karaciğerinde DNA hasarını tespit etmek için bu tahlilleri kullanma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Bu protokol, kuyruklu yıldız tahlilinin uygulanması yoluyla FLT3 mutant hücrelerinde tip I ve tip II inhibitörlerin neden olduğu DNA hasarındaki farkı ölçmek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Biz uzun bir süre boyunca floresan mikroskobu ile yaşam nöronlar mitokondri görüntüleme sağlayan bir protokol açıklar. Uzun süre üzerinden Görüntüleme mitochondrially hedef floresan protein ve laboratuvarımızda tasarlanmış ve inşa edilmiştir ucuz bir sahne top inkübatör kullanımı lentivirüs aracılı ifade aracılığıyla gerçekleştirilir.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

Öğrenin hipokampal nöronlarda DNA hasarını Comet Assay yöntemiyle ölçmeyi. Bu hassas teknik, tek tek hücrelerde DNA bütünlüğünü değerlendirerek nörodejeneratif hastalık araştırmalarına katkı sağlar.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

Daha fazla video keşfet