Name: T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, tek hücreli düzeyde T hücre sitotoksisitesini ölçmek için yüksek verimli bir yöntemi. Nano kuyu dizileri ve floresan mikroskopi kullanarak tümör hücrelerine karşı etkili bağışıklık yanıtlarını değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma Ödülü sayısı R01CA174385 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen bu yayında bildirdi. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Reaktiflerin Hazırlanması <ol><li> 500 ml RPMI-1640 ve 5 ml karıştırma ile RPMI-PLGH hazırlanması Penisilin-Streptomisin, L-glutamin, HEPES ve çözelti her biri. </li><li> % 10 fetal bovin serumu (FBS) ile RPMI-PLGH karıştırma ile R10 çözeltisi hazırlayın. FBS ile ilave 30 dakika boyunca 56 ° C&#39;de önceden de ısı ile inaktive edilir. </li><li> 37 ön ısıtma ° C RPMI-PLGH, steril konik tüpler içinde R10 15 ml PBS ve 15 ml ve 50 ml. </li><li> PDMS içinde nanowells diziler İmalatı: silikon ana fotolitografi, esas olarak daha önce anlatılan 10 kullanılarak imal edilir. İyice bir plastik bıçak kullanarak Sylgard 184 elastomer kiti temel ve bir tek fincan 10:01 ağırlık oranında sertleştirici karıştırın. 1 saat boyunca bir vakum odasında Degas karışımı. , Nanowell dizi üzerine karışımı dökün bir cam slayt ile mühür ve 30 dakika bekletin. ° C de 2 saat süre ile 80 olarak ayarlanmış, bir fırın içine montaj aktarın ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Elastomer fark olacakBu dönemde ve irade cam slayt bağ sırasında e. PDMS nanowell dizi içeren cam slayt dikkatlice bant ile kaplanmış ve ileride kullanmak kadar saklanır, silikon ana kaldırdı edilir. </li></ol> 2. Hedef Hücre (T) Etiketleme <ol><li> 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj ile bir steril 15 ml konik bir tüp içinde bir hemasitometre ile pelet hücreleri kullanılarak hücre kültürü ile 5 milyon hedef hücreleri sayın. Hücre kültürü 5 ml toplam hacmi (yoğunluk = 1 milyon / ml) içinde bir önceki güne bölmek ve T-25 şişesi (VWR) içinde yetiştirilir. Hemasitometre kullanarak hücre sayımı için Protokoller önce 11 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir </li><li> Ortam yaklaşık 50 ul geride bırakarak aşırı medya aspire. </li><li> (Son konsantrasyonu 2.5 mcM) 150 ul RPMI-PLGH 0.5 ul TO stok (1 mM) karıştırılarak Hücre Tracker Kırmızı (TO) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Hedef hücrelere çalışma solüsyonu 150 ul ekleyin ve bir P200 pipet kullanarak iyice karıştırın.Alternatif olarak, PKH 26 (2 uM nihai konsantrasyon) imalatçının talimatlarına göre etiketli hedef hücreler olarak da kullanılabilir. </li><li> 20 dk için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 3. Efektör (E) Hücre Etiketleme <ol><li> 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj ile bir steril 15 ml konik bir tüp içinde bir hemasitometre ile pelet hücreleri kullanılarak hücre kültürü ile 5 milyon efektör hücreleri sayın. </li><li> Aşırı medya aspire </li><li> R10 medya 1 ml (5 uM nihai konsantrasyon) ile 5 mM stok Vybrant Violet 1 ul ilave edilerek Vybrant DyeCycleViolet Leke çözeltisi bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Hücrelere çalışma çözeltisi ekleyin ve P200 pipet kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, PKH 67 (2 uM nihai konsantrasyon) imalatçının talimatlarına göre etiketli hedef hücreler olarak da kullanılabilir. PKH 67 kullanılırsa, bunlar aynı flüoresan kanalı olması nedeniyle, daha sonra SYTOX Green kullanılmamalıdır. Apoptotik hedeflerin numaralandırma sadece A kullanılarak yapılırBu durumda nnexinV boyama. Not: time-lapse değil nokta ölçümler yapıyorsanız, Vybrant Violet gibi UV boyalar kaçınılmalıdır. </li><li> 20 dk için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 4. Bir Yoğunluk Gradient Kullanarak Canlı ve Ölü Hücrelerin Ayrılması <ol><li> Sırasıyla, hedef ve efektör hücrelere 6.8 ml ve RPMI-PLGH 6.0 ml ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> Ficoll-Paque Artı hedef ve efektör hücreler içeren her konik tüp alt tabakası 3,5 ml. Katman Ficoll yavaş yavaş Ficoll ve medya arasındaki tabaka iyi oluşumunu sağlamak için. </li><li> 30 dakika boyunca 340 xg&#39;de her iki tüp santrifüjleyin. Hiçbir fren ve hızlanma ile. </li><li> Santrifüj sırasında, bir 4-iyi levhaya önceden ısıtılmış PBS 7 ml aktarın. Nanowell array (PDMS fabrikasyon) hazırlayın: etanol ile cam slayt temiz alt ve 1 dakika boyunca plazma oksitleyici kullanarak yüksek RF ayarda PDMS okside eder. Bu adım adım olacak steAyrıca hidrofilik PDMS sunarken nanowell dizi rilize. Hemen PBS içeren plaka içine nanowell dizi taşıyın. </li><li> Bir biyogüvenlik kabine plaka aktarın ve aşırı PBS aspirat. 30-45 saniye sonra, 10 ml distile su ve mikrodalga buna 100 mg agar tozu ilave edilerek 10 ml% 1 agar asil edin. Dizi hareketsiz ve katılaşmaya agar için 10 dakika beklemek zorunda nanowell dizisi içeren cam slayt üst ve alt kenarda 1% asil agar sıcak uygulayın. 3 ml PBS ve aspirat aşırı agar ekleyin. </li><li> Nanowell dizinin üst üzerine R10, 3 ml ekleyin ve yaklaşık 10 dakika için denge sağlar. </li><li> Santrifüj Ficoll takiben, her tüp üst tabakasından 5 ml medya aspire. Hücreleri içeren katmanı aspire için dikkatli olun. </li><li> P1, 000 pipet ve yeni steril konik tüpler için hamle ile Ficoll ve medya arasındaki tabakası 1-2 ml kurtarma tarafından hücreleri (beyaz tabaka) Harvest. Size maxim emin yaparken hücrelerin iki seti için bu işlemi tekrarlayıniyileşme hücreleri tanımlamak için analiz edildi. </li><li> Tam hızlanma ve fren üzerinde 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj ile pelet ve pipetleme ile her bir tüp, karışım için önceden ısıtılmış RPMI-PLGH 3 ml ilave edilir. </li><li> Fazla ortamı aspire, her bir tüp için önceden ısıtılmış RPMI-PLGH, 5 ml ilave edin ve 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj tekrarlayın. </li><li> Fazla ortamı aspire ve R10, 500 ul hücre pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Bir hemasitometre üzerine Tripan mavi dışlama yöntemi kullanılarak canlı hücreleri saymak. </li></ol> 5. Nanowell Dizi üzerine Hücre Yükleniyor <ol><li> Nanowell diziden aşırı medya aspire ve dizi boyunca taze R10 2 ml ekleyin. Nanowell dizinin üst bu hücrelerin dağılımını etkileyecek gibi çok ıslak / kuru değil emin yaparken tekrar aspire. </li><li> Nanowell dizi yüzey üzerine R10 200 ul içinde depolama 1 x 10 5 efektör hücreler (yoğunluk = 5 x 10 5 hücre / ml). </li><li> Hücreleri 5 dakika boyunca yerleşmek ve en standart bir doku kültürü mikroskobu çek kullanarak Lethücrelerinin dağılımını arzu edilir olduğuna dikkat edin. Gerekirse daha fazla hücre ekleyin. </li><li> Depo 1 x 10 nanowell dizi yüzeyde 200 ul R10 5 hedef hücreler (yoğunluk = 5 x 10 5 hücre / ml). </li><li> Hücreler 5 dakika ve hücrelerin dağılımı tercih edilir olduğundan emin olmak için, standart bir doku kültürü mikroskop kullanılarak kontrol dinlendiriniz. Gerekirse daha fazla hücre ekleyin. </li><li> 2 ml R10 ve aspirat fazla medya ile dikkatlice nanowell dizi durulayın. </li><li> 15 ml steril konik tüp içinde 3 ml önceden ısıtılmış R10 hazırlayın. Leke 0.5mM SYTOX Green nükleik asit 3 ul (0.5 uM son konsantrasyon) ve çalışma çözeltisi hazırlamak için Annexin V-Alexa Fluor 647 60 ul ekle. Hücreleri kuyulardan yerinden değil emin yaparken dikkatli 4-plaka üzerine çalışma çözüm ekleyin. </li><li> 15 dk için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 6. Görüntüleme 1 <ol><li> Bir floresan MICR kullanarak nanowell dizinin görüntüleri Edinmeoscope: Bu örnekte, bir motorlu sahne ve Lambda-DG4 sahip Z-1 mikroskop ZEISS Gözlemci kullanın. </li><li> Yazılım ve mikroskop başlatılamıyor ve iletilen ışık ve diğer floresan kanallarda sinyal yoğunluğu kontrol edin. Genel olarak, karşılık gelen beş kanal olacak: iletilen ışık, Annexin V-647 (Cy5 filtresi), TO (DsRed filtresi), SYTOX Yeşil (FITC filtresi) ve Vybrant Violet (DAPI filtre). Doyuma kaçınarak gürültü maksimum sinyal sağlamak için kurulum mikroskop emin olun. </li><li> X ve nanowell dizisi için Y konumu ayarlayın. Sıfır konumu ayarlama ve nanowell dizi damga sol üst köşesinde üzerine 7 x 7 nanowell dizinin blok merkezine odaklanmak başlatarak süreci başlar. Doğru her blok odağı yansıtmak için her bloğun merkezi ve z-değeri ile çakışacak şekilde x, y konumlarını ayarlayın. </li><li> Pozisyonu ve odak tüm set olduktan sonra, lineer modda görüntü toplama ayarlamak ve görüntüler elde etmek için emin olun. <s&gt; Not Trong: mikroskop inkübatör ve CO 2 gerekli dönüş en az 30 dakika deney öncesinde ise. </li></ol> 7. Post-görüntüleme 6 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO2) içine nanowell dizi içeren 4-plaka aktarın. 8. Görüntüleme 2 6. Adım de tarif edildiği gibi zaman noktası saniyede görüntü elde edin. 9. Görüntü Analizi <ol><li> Nanowells içindeki hücrelerin fazla uygun görüntü bölütleme programları kullanımı (örneğin ImageJ ile tespit edilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ), esas olarak daha önce tarif 9,12. </li><li> Mikroskop (t = 0 saat, t 0) ilk set analizi tam olarak bir hedef hücreye canlı (tanımlanır içeren bireysel nanowells bir veri tabanı oluşturmak için kullanılanRed CellTracker, kırmızı) ve ölü hücreleri (Annexin V boyası ile tanımlanır, yeşil) [T1T 0 nanowells]. </li><li> Mikroskop (t = 6 saatte, t 6) ikinci küme analizi. Bağımsız olarak 1, hedef hücre (kırmızı) [T1T 6 nanowells] nanowells ihtiva eden ikinci bir veri tabanı belirlemek için kullanılır Bir bütünlük denetimi (veritabanı sorgu) t 0 bütün canlı hedefler eşleşen hedefleri bir final seti (T1T 0 T1match olarak belirlenmiş = T1T 6, var nanowells olarak uygulanan) üretmek için t 6 hedeflere uyumlu olmasını sağlamak için uygulanan </li><li> Nanowells efektör hücrelerin sayısı t, 0 [E1 nanowells] az Vybrant mor leke kullanılarak belirlenir </li><li> Bir veritabanı sorgu (E1T1 olarak belirlenmiş E1 ve T1 maç var nanowells olarak tanımlanan), tek hedefleri ile birlikte kuluçkaya tek etkileyiciler içeren nanowells belirlemek için uygulanmaktadır </li><li> Efektör apoptosis i tarafından atılırsa<html> t 0 ve pozitif Annexin V t 4 de (t 6 Annexin V hedef boyama ile E1T1) negatif Annexin V hedefleri dentifying. </li></ol> 10. Nikon&#39;un BioStation IM kullanma Öldürme Opsiyonel Time-lapse Görüntüleme <ol><li> Lamel dipli bir Petri kabı alın ve tam olarak lamel uyacaktır nanowell dizi çipi küçük bir parça (Adım 5 hazırlanır) kesip. Kesim sırasında talaş ıslak kalır emin olun. </li><li> Karışım 1 x 10 6 hedefler ve 100 ul ortam içinde 1 x 10 6 T hücreleri ve lamel üzerine bu pipetle. </li><li> Yaklaşık 15-30 dk hücreleri yerleşmek izin ver. </li><li> Hızla küçük nanowell dizi çip ters ve lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Çip çip üstüne görüntüleme, yer içinde bir ya da iki adet 20mm x 20mm lamelleri taşımak mümkün olmayacaktır emin olmak için. Çanak altına çip itmek usulca baskı uygulayın. </li></ol>çadır &quot;&gt; Not: nanowell dizi yongasının altına yüksek çözünürlüklü görüntüleme için çok kalın ve bu yüzden altüst edilmesi gerekir Bu işlem sırasında hücrelerin birçok yıkanır Bu Adım 9.2 &#39;de kolayca kontrollü, hücre sayıları olamayacaktır.. ve Basamak 9.3 &#39;de inkübasyon süresi optimize edilmesi gerekmektedir.

<ol><li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPorter%2C+DL+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. , (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%2B+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li>
<li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+a+house+of+cards%3A+re-evaluating+CD8%2B+T-cell+immune+correlates+against+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li>
<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz nanowells diziler (Şekil 1) etkileyiciler ve hedefleri ko-kuluçka yoluyla etkin bir high-throughput tek hücreli sitolitik tahlil için protokol ana hatlarıyla. Verim ek olarak, tekniğin büyük bir avantaj da hedef hücreleri otolog ya da primer / eşlemeli tümör hücrelerinin kullanımına izin verir hedef hücre mühendisliği için gerek kalmadan istenen hedef hücrelerine karşı sitotoksisite efektör-aracılı izlemek için yeteneğidir. Uzaysal kapatılma tahlil 9 sonunda geri alma ve fonksiyonel T hüc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10.000 IU Penisilin 10.000 mg / ml streptomisin </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200 mM çözelti </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11150 </td><td> Lot test </td></tr><tr><td> Hücre Tracker Kırmızı Leke </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 mikrogram </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Leke </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX yeşil Nükleik Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexin V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Noble Agar </td><td> Difco </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Tripan Mavi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> % 0.4 sıvı steril filtre </td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Parlak hattı </td></tr><tr><td> 4-plaka </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plazma Temizleyici </td><td> Harrick Plazma </td><td> PDC-32G </td><td> Temel plazma temizleyici </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Floresan mikroskobu (aşağıdaki üç bölümden ile çalışır) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Filtre denetleyici </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Ultra Yüksek Hız Dalgaboyu anahtarlayıcı </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> CCD-Mikroskop kamera </td></tr><tr><td> 15 ml konik tüp </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik bir tüp </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Cam alt kültür çanak </td><td> Mattek Corporation, </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm petri, 10 mm kuyucuk </td></tr></tbody></table>

t hücreleri İçin kantitatif yüksek throughput tek hücreli sitotoksisite testi

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kanser immünoterapi tümörleri hedef ve yok etmek için bağışıklık yanıtının özgüllüğü koşum olabilir. Genetik bir kimerik antijen reseptör (SYR) ifade etmek için değiştirilmiş T hücrelerinin evlatlık transferi dayalı evlatlık hücre tedavisi (ACT) klinik çalışmalarda 1-4 önemli olacağını göstermiştir. Orada CAR kullanarak + T hücreleri olmayan MHC kısıtlı antijenleri hedeflemek ve konak içinde homing ve sebat optimum yaşam için T hücreleri, daha işlevsel yeteneği dahil olmak üzere kanser tedavisi için çeşitli avantajları vardır; ve nihayet CAR apoptoza teşvik etmek + ana toksisite 5 durumunda T hücreleridir. CAR optimum işlevlerini tasvir + klinik fayda ile ilişkili T hücrelerinin klinik çalışmaların yeni nesil tasarımı için önemlidir. Multiphoton mikroskopi gibi canlı hayvan görüntülemede son gelişmeler, immün hücre fonksiyonunun çalışma devrim var in vivo 6,7. Bu in vivo çalışmalar, klinik çalışmalarda T-hücresi bazlı ACT T-hücre fonksiyonlarının anlaşılmasını ederken de kullanarak, önceden infüzyon klinik etkinlik sonrası infüzyon ile T-hücresi preparatlar moleküler ve fonksiyonel özelliği bağlamak için ihtiyaç doğurur sitotoksisite ve sitokin salgılanması gibi T hücre fonksiyonlarının izlenmesi vitro tayinlerde. Standart akım sitometri dayalı testler tek hücre düzeyinde T hücre popülasyonları genel işleyişini belirlemek ancak bu konjugat oluşumu ve yaşam süreleri veya birden fazla hedeflere 8 öldürmek için aynı hücre yeteneği izlenmesi için uygun olmadığını geliştirilmiştir. Polidimetilsiloksan (PDMS) gibi biyouyumlu polimerler dizayn Microfabricated diziler mekansal etkileyiciler ve küçük hacimleri 9 hedeflere sınırlandırmak için özellikle çekici bir yöntemdir. Otomatik time-lapse mikroskopi, tho ile birlikteefektör-hedef etkileşimlerin usands bir nanowell dizi görüntüleme bireysel kuyular tarafından aynı anda izlenebilir. Burada genel olarak T hücrelerinin sitotoksik özelliğe incelemek için uygulanabilir ve tek hücre seviyesinde T-hücre aracılı sitotoksisite izlenmesi için bir yüksek hacimli yöntem sunulmaktadır.

Yüksek verimli sitolitik testinin uygulamasının bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Kısaca, CD19 spesifik olarak etiketlenmiş ARAÇ + T hücreleri bir nanowell dizi bireysel haznesi (Bölüm 1-5) olarak etiketli fare hedef EL4 hücreleri ile birlikte inkübe edildi. Bir ilk görüntü dizisi (Bölüm 6) ilgili her nanowell arasında doluluk (etkileyiciler ve / veya hedefler) tanımlamak için otomatik floresan mikroskop kaydedildi. Görüntü işleme tam olarak tek bir hedef ve tek bir efektör içeren tü...

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Bu deneysel sistem, tek hücre düzeyinde T hücresi aracılı sitotoksisiteyi izlemek için yüksek verimli bir metodoloji sunar. İlk olarak, efektör T hücrelerini ve tümör hedef hücrelerini floresan boya kalıpları ile etiketleyin. Her iki hücre tipini de nano kuyu dizilerine yükleyin ve tüm çipi cyt green ve floresan etiketli nexin içeren ortama daldırın. Beş.Hem nekrotik hem de apoptotik hücreleri tanımlamak için, şimdi testin başlangıcında kuyu doluluğunu ve hücre canlılığını belirlemek için bir ilk ön görüntü kaydedin. Altı saatlik bir inkübasyondan sonra ikinci bir görüntü kaydedin. Ardından, araba pozitif T hücreleri tarafından EL dört CD 19 pozitifinin antijene özgü lizizini ölçmek için otomatik görüntü analizini kullanın.Bu yüksek verimli yöntemden elde edilen sonuçlar, sitoksin ile pozitif boyamaya dayalı olarak efektör hücreler tarafından hedeflerin antijene özgü lizisini tarayabilir. Beş. Bu tekniğin krom 51 salınım testi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gerçek bire bir etkili hedef etkileşimlerin elde edilebilmesi ve uydu frekansının ölçülebilmesidir Bu tekniğin anlamı, otolog hücre terapisinde etkinlik korelasyonlarını incelemeye izin verdiği için kanserin hangi ted

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Krom salınım tahlili, sitotoksik T hücresi aktivitesini tespit etmek için ortak bir tahlil, bazı sınırlamalar vardır. Bu madde, antijen spesifik CD8 T hücreleri ve insan göğüs kanseri tümör hattı ile, SKBR3 kullanarak, bir empedans dayalı bir yaklaşım hücre öldürme saptama yeteneğine için incelenmiştir.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Bu video, gerçek zamanlı elektriksel empedans ölçümleri aracılığıyla kanser hücrelerine karşı CAR T hücresi aktivitesini izlemek için bir yöntemi göstermektedir. İmpedanstaki değişikliklerin izlenmesi, CAR T hücrelerinin kanser hücresi sitolizini indüklemedeki etkinliğini değerlendirir ve sitotoksik yetenekleri hakkında bilgi sağlar.

CAR T Hücrelerinin Gücünü Değerlendirmek için Gerçek Zamanlı İn Vitro Sitoliz Testi

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Öğrenin, tek hücreli düzeyde T hücre sitotoksisitesini ölçmek için yüksek verimli bir yöntemi. Nano kuyu dizileri ve floresan mikroskopi kullanarak tümör hücrelerine karşı etkili bağışıklık yanıtlarını değerlendirin.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Daha fazla video keşfet