T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bu deneysel sistem, tek hücre düzeyinde T hücresi aracılı sitotoksisiteyi izlemek için yüksek verimli bir metodoloji sunar. İlk olarak, efektör T hücrelerini ve tümör hedef hücrelerini floresan boya kalıpları ile etiketleyin. Her iki hücre tipini de nano kuyu dizilerine yükleyin ve tüm çipi cyt green ve floresan etiketli nexin içeren ortama daldırın. Beş.

Hem nekrotik hem de apoptotik hücreleri tanımlamak için, şimdi testin başlangıcında kuyu doluluğunu ve hücre canlılığını belirlemek için bir ilk ön görüntü kaydedin. Altı saatlik bir inkübasyondan sonra ikinci bir görüntü kaydedin. Ardından, araba pozitif T hücreleri tarafından EL dört CD 19 pozitifinin antijene özgü lizizini ölçmek için otomatik görüntü analizini kullanın.

Bu yüksek verimli yöntemden elde edilen sonuçlar, sitoksin ile pozitif boyamaya dayalı olarak efektör hücreler tarafından hedeflerin antijene özgü lizisini tarayabilir. Beş. Bu tekniğin krom 51 salınım testi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gerçek bire bir etkili hedef etkileşimlerin elde edilebilmesi ve uydu frekansının ölçülebilmesidir Bu tekniğin anlamı, otolog hücre terapisinde etkinlik korelasyonlarını incelemeye izin verdiği için kanserin hangi tedavisine kadar uzanır: Silikon ustasını kullanarak nano kuyular üretmek için önce puro 180 4 elastomer kit tabanını ve kürleme maddesini bir Plastik bir bıçak kullanarak tek kullanımlık bir kapta 10'a bir ağırlık oranı. Karışımı bir vakum odasında bir saat boyunca gazdan arındırın.

Daha sonra karışımı silikon ustanın üzerine dökün ve 30 dakika bekletin. Şimdi elastomeri sertleştirmek için, düzeneği oda sıcaklığında bir saat soğuttuktan sonra 80 derecelik bir fırında iki saat ısıtın. PDMS nano kuyu dizisini silikon master'dan dikkatlice çıkarın.

Deney geçişinden bir gün önce kullanana kadar bantla örtün, beş mililitrede 5 milyon hedef hücre. Deneyin yapıldığı gün. Steril 15 mililitrelik konik bir tüpte 5 milyon hücreyi beş dakika boyunca 340 Gs'de santrifüjleme ile peletleyin.

Hücreleri etiketlemek için yaklaşık 50 mikrolitre ortam bırakarak fazla ortamı aspire edin. 150 mikrolitre taze hücre izleyici kırmızı çalışma solüsyonu ekleyin ve bir P 200 pipet kullanarak iyice karıştırın, %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Bir hemo sitometre kullanarak, kültürden toplanan efektör hücreleri numaralandırın.

Daha sonra santrifüjleme ile steril 15 mililitrelik konik bir tüpte 5 milyon hücreyi peletleyin. Fazla medyayı aspire edin. Ardından, beş mikromolar canlı D döngüsü menekşe lekesinden oluşan taze çalışma solüsyonunu ekleyin ve bir P 200 pipet kullanarak yeniden askıya alın.

Hücreleri inkübe edin ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca 6.8 mililitrede% 5 karbondioksit ve 6.0 mililitre R-P-M-I-P-L-G-H ile hedef ve efektör hücrelere ölün ve pipetleme ile karıştırın. Daha sonra yavaşça 3.5 mililitre fial paketi artı her tüpün dibine katman, her iki tüpü de santrifüjleme sırasında kırılma ve hızlanma olmadan 30 dakika boyunca 340 GS'de santrifüjleyin, nano kuyu dizisini hazırlayın Önce yedi mililitre savaş öncesi PBS'yi dört kuyulu bir plakaya aktarın. Cam sürgünün altını bir plazma oksitleyici kullanarak etanol ile temizleyin.

PDMS'yi 30 ila 45 saniye boyunca yüksek RF ayarında tedavi edin. Ardından diziyi PBS'ye yerleştirin. Plakayı bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve fazla PBS'yi aspire edin, diziyi hareketsiz hale getirmek için cam sürgünün üst ve alt kenarlarına sıcak% 1 asil agar uygulayın.

PDMS'nin üç mililitre PBS'de 10 dakika sonra kurumasına izin vermediğinizden emin olun ve fazla agarı aspire edin. Daha sonra nano kuyu dizisinin üstüne üç mililitre R 10 ekleyin ve yaklaşık 10 dakika dengeleyin. Fial santrifüjlemenin ardından, her tüpün üst katmanından beş mililitre ortam aspire edin.

Hücreleri içeren tabakayı P 1000 pipeti ile aspire etmemeye dikkat edin. Fial ve ortam arasındaki beyaz hücre tabakasını hasat edin. Hücreleri yeni steril konik tüplere aktarın.

Şimdi hasat edilen efektörü ve hedef hücreleri üç mililitre savaş öncesi R-P-M-I-P-L-G-H ile iki kez yıkayın. Son santrifüjlemeden sonra, fazla ortamı aspire edin ve hücre peletini yeniden süspanse edin. 500 mikrolitre R 10'da, bir hemo sitometre üzerinde trian mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın, nano irade dizisinden gelen fazla ortamı aspire edin.

Ardından iki mililitre taze R 10 aspirat ekleyin. Yine, nano irade dizisinin üst kısmının ne çok ıslak ne de çok kuru olduğundan emin olmak, hücrelerin dağılımını etkileyecektir. Şimdi, 200 mikrolitre R 10'daki fektor hücrelerinin beşte birine bir kez yatırın, hücrelerin beş dakika boyunca yerleşmesine izin verecek şekilde nano dizi yüzeyine yerleştirin.

Daha sonra standart bir doku kültürü mikroskobu kullanarak, hücrelerin istenen dağılımını doğrulayın. Daha sonra, efektör hücreleri içeren nano kuyu dizisi yüzeyine 200 mikrolitre R 10 içinde beşinci hedef hücrelere bir kez 10 biriktirin. Beş dakika sonra, hücre dağılımını mikroskopi ile değerlendirin.

Daha sonra nano kuyu dizisini iki mililitre R 10 ile dikkatlice durulayın ve fazla ortamı ayrı bir steril 15 mililitre konik tüpte aspire edin. Üç mililitre ön ısıtma R 10'u üç mikrolitre 0.5 milimolar cyt, yeşil nükleik asit boyası ve 60 mikrolitre X in five LOR 6 47'de pipetleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Şimdi leke solüsyonunu dört oyuklu plakaya nazikçe pipetleyin, hücrelerin kuyulardan yer değiştirmediğinden emin olun, 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin,% 5 karbondioksit gibi bir floresan mikroskobu kullanarak nano kuyu dizisinin görüntülerini elde edin.

Yazılımı ve mikroskobu başlatın. İletilen ışıktaki ve diğer floresan kanallardaki sinyal yoğunluğunu kontrol edin. Doygunluktan kaçınırken gürültüye maksimum sinyali sağlamak için mikroskop kurulumunu ayarlayın.

Şimdi nelle dizisi için x ve Y konum listesini açın. XY sıfır konumunu ayarlayın ve odağı, nelle dizisi damgasının sol üst köşesindeki yediye yedi nelle dizisi Bloğunun ortasına sıfırlayın. XY konumlarını her bloğun merkeziyle çakışacak şekilde ve her bloktaki odağı doğru bir şekilde yansıtmak için Z değerini ayarlayın.

Şimdi görüntü alımını doğrusal modda ayarlayın ve görüntüleri alın. İlk görüntüleme serisinden sonra, nano kuyu dizilerini altı saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ajitasyona dikkat etmek hücre yer değiştirmesine yol açabilir.

Ardından, ikinci zaman noktasında görüntülerin alımını tekrarlayın. Bu yüksek verimli sitolitik test, CD 19 olarak işaretlenmiş antijene özgü lizis frekansını ölçer, spesifik CAR pozitif T-hücreleri, bir nano L dizisinin ayrı kuyucuklarında etiketli fare EL dört hedef hücre ile birlikte inkübe edildi. Hedef hücre histogram grafikleri, tek bir efektör hücre ve tek bir hedef hücre içeren kuyucukları temsil eder.

Altı saatlik ko-inkübasyondan sonra, efektörsüz hedef hücrelerin eşleşen histogramları, arka plan hücre ölümünün sıklığını bildirmek için negatif kontroller olarak kullanıldı. % iki ila% 4 aralığında düşük spesifik olmayan lizis frekanslarının elde edilmesi arzu edilir Nano kuyu dizisi, efektörün, hedef konjugasyonun ve müteakip hücre ölümünün gözlemlenmesine izin vermek için hızlandırılmış görüntüleme için uyarlanabilir. Burada, etiketlenmemiş araba pozitif T hücreleri, bir NOL'de NA LM altı GFP hedef hücresi ile birlikte inkübe edildi ve dinamik izlemeye tabi tutuldu.

Kültür ortamına bir Xin beşi eklendiğinde, apoptotik hücreler bir kez ustalaştıktan sonra kırmızı olarak etiketlenir. Bu teknik, bu işlemi takiben 10 ila 12 saat içinde düzgün bir şekilde gerçekleştirilebilir. Hücrelerin sitokin salgı profilini belirlemek için mikro kapma gibi diğer yöntemler de kullanılabilir.