Name: Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Öğrenin, retrograd perfüzyon ile domuz kalbinden hücresel bileşenleri hızla uzaklaştırarak kardiyak ekstraselüler matriks iskeleti oluşturmayı. Bu yöntem doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Brogan Konuk, Michelle Weaver, ve Kristen Lippert kabul etmek istiyorum. Bu çalışma için Fon NIH Grant R03EB009237 yanı sıra, National Biomedical Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü T32HL076124-05 NIH Eğitimi Teşvik T32EB001026-06 ile sağlanmıştır.

1. Doku Hazırlanması ve Deney Kurulumu <ol><li> Hemen bir mezbaha veya araştırma tesisi ötanazi sonra ve aşırı kan durulayın Hasat domuz organdır. Atrium ve aorta sağlam tutmak, aşırı yağ ve doku kalp kesin. Uzaklıkta aortadan pulmoner arter ayırmak için yağ kesin. Dokusunda herhangi bir kesik varsa, uygun atın. </li><li> Dondurucu kağıt ayrı ayrı her kalp sarın ve tam donma sağlamak için en az 24 saat için -80 ° C derin dondurucuda tüm doku saklayın. </li><li> Zaman kullanımı (genellikle 3 aydan daha az), gecede 4 ° C&#39;de 4 L beher batık Tip 1 su çözülme biri sağlam dondurulmuş domuz kalbi hazır </li><li> Kalbi tamamen çözülmüş sonra, kalp kurulayın kalp tartmak ve ağırlığı kaydetmek. Bir pazar kilo domuz kalbi yaklaşık 375-450 g tartmak gerekir. </li><li> Bir dikenli redüktör ¼ &quot;sonuna kadar boyutu 18 Masterflex hortumu bağlayın. Dikenli redüktör yerleştirin veaort içine hortum. Sadece brakiyosefalik gövde altındaki Sıra 2 hortum kelepçeleri veya aort etrafında güvenli zip bağları,. Redüktör ve hortum aort kapak üzerinde kalmalıdır, koroner arterler (Şekil 1) perfüze böylece. </li><li> Tip I su boruları doldurmak için 30 ya da 60 ml şırınga kullanın. Onun yaklaşık orta noktasında bir Masterflex silindir pompa kartuş içinde tüp yerleştirin. Akış 2.5 L su ile doldurulmuş bir 4 L ölçeğinin alt boru ucu ve boru güvenli daldırmak. </li><li> Su ile doldurulmuş behere kalp ve hava kabarcıklarını çıkarmak için pompayı yerleştirin. Kabarcıklar tüp eklenen aort gelen gözlenirse, aort ilave bağları ile yerleştirilmesi veya temin edilmesi gerekebilir. Hava geçirmez bir mühür decellularization işlemi (Şekil 2) sırasında yeterli basınç sağlamak için önemlidir. </li><li> % 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 L içeren 4 L kabı yerleştirinPlaka karıştırın ve 37 ısıtın üzerine ° C decellularization sürecinin hazırlanmasında 3 çözüm. </li></ol> 2. Doku durulamak <ol><li> Doğru boru boyutu seçilir sağlanması, 400 ml / dak &#39;lık bir akış oranı ile pompa ayarlayın. 15-25 dk Ben su yazın ile kalp yıkayın. Pompa çalışmaya başladığında, kalp şişer ve karıncıklar kan dökmek gerekir. Taze çözelti her 5-10 dakikada ikame edilmiş, ya da kalp kaldırılır kan miktarına dayalı olarak gerek yoktur. Kan kalp effused ise, gerekli olduğu gibi tüp ve kelepçeler ayarlayın. </li><li> Pompa durdurun ve 2X Fosfat dolu ayrı bir behere kalp aktarmak Salin (PBS) Tamponlanmış. Boru çözelti içine daldırılmış sonra, pompa ve 700 ml / dk &#39;ya kadar akış oranını artırmaktadır. Kalp çözümü her 5 dk değişen, 15 dakika için çözüm kalmalıdır. Her çözüm değişim doku ve boru hareket ederken geçici olarak kesilmelidir pompa gerektirirYeni behere. </li><li> 10 dakika boyunca bir su tipi ve 750 ml / dakika akış hızı ile artmaya kalp aktarın. </li></ol> 3. Decellularization ve Çözüm Perfüzyon <ol><li> 37 NaN 3 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% içeren behere kalp aktarın ° C. 1.200 ml / dk pompa hızını artırın ve pompa başlar. Beher içinde çözelti sirküle beher altına yerleştirilmiş bir karıştırma çubuğu kullanın. Kalp üç saat olmak üzere toplam 37 ° C&#39;de% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 çözüm kalmalıdır. 1 saat sonra, 1.500 ml / dk pompa hızını artırın. Ek bir saat sonra, 1.800 ml / dk pompa hızını artırın. Doku yavaş koşulu doku artmış perfüzyon hızları tabi ve damarların yırtılması önlemek edilir. Kalp protokolün bu adımı sırasında boyutu şişer ve neredeyse çift olacaktır. Doku inci boyunca atriyumlar apekse ilerliyor, doğal rengini kaybedere protokolü (Şekil 3). </li><li> Her çözüm perfüzyon sonra durulama iki adım hücresel enkaz, kimyasal kalıntı ve yardım hücre lizis kaldırmak için yapılır. Her durulama bir 10 dakika oluşan bir 10 dakika, ardından oda sıcaklığında su 2X PBS çözeltisi ile durulama Tip durulama. Her bir yıkama durulama çözüm, ekleme ve batık kalp içeren deney şişesi içinde dolaşan perfüzat, ilk kaptan çıkarılmasını çözelti oluşur. Ardından% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 çözeltisi ardından, perfuse 1,900 ml / dakika, su ve 1950 ml / dk &#39;da PBS 2X serpmek. </li><li> % 3 oda sıcaklığında, Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 ihtiva eden bir çözeltiye kalp aktarın. 2.000 ml / bir saat dakika ve perfuse çözüm pompa hızını artırın. Kaptan çözüm çıkarın ve taze solüsyon ile değiştirin, 2100 ml / dk pompa hızını artırmak, ve ek bir buçuk saat için taze solüsyon serpmek, toplam zamanı getirerek3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 2.5 hr. </li><li> 2180 ml / 10 dk için her bir dakikada 2150 ml / dakika ve 2x PBS de Tip I su içinde doku durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında, bir% 4 Sodyum deoksikolatın çözeltisine kalp aktarın. 2.200 ml / dk ve 3 saat süreyle perfuse çözüm pompa hızını artırın. </li><li> De Tip I su içinde doku durulayın ve 2x PBS 2.200 her bir çözelti için 5-10 dakika sonra çözüm değişen 15 dakika her biri için, ml / dakika. Açıklanan perfüzyon adımları iki kez durulayın adımı gerçekleştirdikten ve 4 ° C gecede ekli boru ile kalp depolayarak birden fazla gün içinde bölünmüş ve Tip I suya sokulmasına olabilir. </li><li> Ertesi gün, 5 dakika ml / dk 1,500 1X PBS ile durulayın, 5 dakika, ardından 750 ml / dk hızla Tip I su ile durulama gerçekleştirmek. Bu protokol daha sonra uygun bir solüsyon içinde tarif akış hızında devam edilebilir. </li></ol> 4. Dezenfeksiyon ve Nihai İşleme <ol><li> % 0.1 &#39;lik perac için kalp aktarınetic asit / 2,200 ml / dk &#39;da% 4 etanol ve çözelti 1.5 saat için çözelti perfuse. </li><li> Doku için son çalkalamalar hepsi 2,200 ml / dk &#39;da gerçekleştirilir. Tip I su içinde iki yıkamadan 5 dakika, ardından 15 dk için 1X PBS ile doku serpmek. Durulama Bu bir dizi çözüm perfüzyon işlemi tamamlamak için bir kez daha tekrar edilir. </li><li> Pompayı kapatın ve kalp boşaltmak için çözüm kalp çıkarın. Aortadan bağları kes, tüm tüp kaldırın ve 1 saat boyunca boşaltmak için boş bir behere kalp yerleştirin. Aşırı sıvı periyodik tahliye edilmesi gerekir. Tam kalp (Şekil 4) boşaltmak için bir emici ped üzerine kalp yatırın. </li><li> Su en kaldırıldıktan sonra, kardiyak hücre dışı matris (C-ECM) ağırlığını kaydedin. Kalp decellularization işlemi sırasında iç ağırlığının yaklaşık olarak% 20-25 kaybetmeye beklenebilir. </li><li> Sağ ve sol ventrikül, hem de DNA quantificati için ventriküler septum teşrihve histolojik işlem sırasında doku tam decellularization (Şekil 5) teyit etmek için. </li><li> Liyofilizasyon önce en az 2 saat süreyle -80 ° C&#39;de C-ECM dondurun. </li></ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+journal+%3A+official+journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li>
<li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li>
<li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li>
<li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+tissues%2C+organs%22%5BJournal%5D)">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li>
</ol>

Gilbert çalışma yapılmakta idi ise ACell, Inc Bilimsel Danışma Kurulu, ve son zamanlarda Araştırma ve Geliştirme Başkan Yardımcısı oldu. ACell, Inc mesane matrisi satıyor ve bu çalışmada hiçbir ticari çıkarı vardır.

Çalışmada domuz kalp tutarlı ve verimli decellularization için metodoloji açıklanmalıdır. Protokol, daha önce yayımlanan bir raporunda, 1 bir değişiklik oldu ve daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar elde akışına uzun pozlama ve artan basınç, dahil. Çıkan decellularized doku doku 2 başarılı decellularization için yayınlanmış tüm ölçütleri bir araya geldi. Sık çözüm değişikliklerin doku hücresel materyalin yeniden yerleştirilmesi sınırlamak için yapılmıştır ve her decellularization maruziyet süresi ECM...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Balıkçı </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Balıkçı </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum deoksikolatın </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Perasetik Asit </td><td> Pfaltz ve Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex Pompa Tahrik </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Boru </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Boyutu 18 </td></tr><tr><td> Dikenli Redüktör </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L Beaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

retrograd koroner perfüzyon tarafından domuz kalp decellularization prosedürü

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Büyük ölçüde iskele yerli mimarisi koruyarak Perfüzyon tabanlı tüm organ decellularization son zamanlarda, siteye özgü ekstraselüler matriks iskelelerinin oluşturmak için bir araç olarak doku mühendisliği alanında ilgi kazanmıştır. Bugüne kadar, bu yaklaşım, kalp, akciğer, karaciğer ve 1-5 de dahil olmak üzere, organ sistemlerinin çeşitli kullanılmıştır. Kolay erişilebilir bir damar ağı olmadan dokuların Önceki decellularization yöntemleri deterjanlar, asitler veya çevredeki ekstraselüler ortamda 6-8 hücresel ve nükleer bileşenleri kaldırmak için bir araç olarak enzimatik tedavi çözümleri doku uzun süre maruz başvurmuşlardır. Bununla birlikte, çözeltilerin yeteneği bu yöntemlerin menteşeli etkinliğini difüzyon yoluyla doku nüfuz. Buna karşılık, doğal damar sistemi aracılığıyla organ perfüzyon etkili bir difüzyon mesafe ve decellularizati kolaylaştırılmıştır taşıma azaltılmışdoku dışarı doku ve hücresel bileşenlerine ajanlardır. Bu yazıda, tam koroner retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbi decellularize için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol bozulmamış kalp üç-boyutlu bir yapıya sahip bir tam decellularized kardiyak hücre dışı matris (ECM c) iskele elde edilmiştir. Önerilen yöntem, enzimler, deterjan ve hücre lisisi ve çıkarmaya yardım etmek için hipertonik ve hipotonik durulama ile birlikte asit dizisi kullanılır. Protokol hücresel malzeme çıkarmaya yardım etmek için Triton X-100 ve sodyum deoksikolatın çözümler ardından matris hücreleri ayırmak için bir tripsin çözelti kullanılmıştır. Açıklanan protokol, aynı zamanda daha büyük 2 L / uzun süre için min perfüzyon hızlarını kullanır. Hücresel enkaz kirlenme olmadan dokuya ajanlar taşıma izin ve çözüm değişiklikler ile birleştiğinde yüksek debi, doku durulama etkili sağlanmalıdır. Burada tarif edilen yöntem nati tüm nükleer malzeme ayrılmıştırçeşitli uygulamalar için kullanılan bir site-spesifik kardiyak ECM iskele oluşturarak, domuz kardiyak doku ve.

Bütün domuz kalpleri üzerinde decellularization etkisi doğal boyutunda farklılıklar, baskılar ve damar düzenleme nedeniyle değişir. Bu nedenle, elde edilen hücre dışı matris iskelelerinin tam kompozisyon kalp kalp ile aynı olmaz. Açıklanan protokol tamamlanması hücresel malzeme kaybı gösteren beyaz ya da yarı saydam görünür bir kalp ortaya çıkarır. Ancak, yaygın bir doku bir kaç daha fazla kantitatif parametreleri 8 kombinasyonuna dayalı &quot;decellularized&quot; kabul edilebilir olduğu kabul edilmektedir. B...

Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Bu prosedürün genel amacı, bölgeye özgü bir kardiyak hücre dışı matris iskelesi elde etmek için retrograd bolluk yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri hızlı ve tamamen çıkarmaktır. Bu, sağlam bir domuz kalbinin aortu olan ilk kanülasyon ile gerçekleştirilir. Daha sonraki boru peristaltik bir pompaya bağlanır ve doku düşük akış hızlarında su ve tuz çözeltileri ile yıkanır.Kalp daha sonra hücresel bileşenleri uzaklaştırmak için kademeli olarak artan bir akış hızında bir dizi deterjan ve enzimatik çözelti ile perfüze edilir. Son adım, bir dezenfektan solüsyonunun perfüze edilmesidir. Hortumu çıkarın ve işlem için ventriküler duvarları kesin.Sonuç olarak, hücresel ve nükleer materyalin dokudan tamamen çıkarıldığını doğrulamak için kalp analiz edilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü kanülasyon ve ilk bolluk adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü borunun tam konumu deneyin başarısının anahtarıdır. Domuz organı, ötenaziden hemen sonra bir mezbaha veya araştırma tesisinden elde edilir.Fazla kanı durulayarak başlayın. Daha sonra, atriyum ve aortu sağlam tutarak fazla yağ ve dokunun kalbini kesin. Ek yağı keserek pulmoner arteri aorttan ayırın.Kesildikten sonra, her bir kalbi ayrı ayrı dondurucu kağıdına sarın ve tam donmayı sağlamak için eksi 80 santigrat derecede en az 24 saat saklayın. Kullanıma hazır olduğunda, kalbi birinci tip su ile doldurulmuş dört litrelik bir behere batırarak çözün ve gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Kalp tamamen çözüldükten sonra, kurulayın ve ağırlığını kaydedin.Piyasa ağırlığındaki bir domuzun kalbi yaklaşık 375 ila 450 gram ağırlığında olmalıdır. Kalp hazır olduğunda, 18 numara Master esnek boruyu dikenli bir redüktörün çeyrek inçlik ucuna bağlayın. Ardından, dikenli redüktörü ve hortumu aortun içine yerleştirin.Brakiyosefalik gövdenin hemen altındaki aortun etrafına iki hortum kelepçesi yerleştirin veya Zip bağlarını sabitleyin. Koroner arterlerin perfüze edilebilmesi için redüktör ve hortum aort kapağının üzerinde kalmalıdır. Ardından, boruyu birinci tip suyla doldurmak için bir şırınga kullanın ve yaklaşık orta noktasında bir ana esnek silindirli pompanın kartuşuna yerleştirin.Daha sonra, borunun giriş ucunu, kalple birlikte 2,5 litre su ile doldurulmuş bir beherin dibine batırın ve sabitleyin. Bu prosedürün en zor yönleri, kalbin uygun şekilde kanülasyonu ve prosedür boyunca yeterli pompa hızlarının korunmasıdır. Prosedür boyunca dokuyu hava kabarcıkları açısından görsel olarak inceleyerek ve prosedür boyunca ventriküllerden uygun efüzyonu koruyarak deneyimizin başarısını sağlıyoruz.Hava kabarcıkları gözlenirse, tüpteki hava kabarcıklarını çıkarmak, yeniden konumlandırmak veya aort ve boru çevresinde ek bağlar sağlamak için pompayı doldurun. Hücre giderme işlemi sırasında yeterli basıncı korumak için hava geçirmez bir conta önemlidir. Bu noktada, hücre giderme işlemine hazırlanırken üç litre tuz dengeli tripsin çözeltisi içeren dört litrelik bir kabı ısıtın.İlk olarak, pompayı dakikada 400 mililitrelik bir akış hızına ayarlayın ve doğru boru boyutunun seçildiğinden emin olun. Pompayı çalıştırın ve kalbi 15 ila 25 dakika boyunca bir tip su ile yıkayın, kalp şişmeli ve ventriküllerden kan yayılmalı, her beş ila 10 dakikada bir veya gerektiği gibi taze çözelti ikame edilmelidir. Kan alındıktan sonra, pompayı durdurun ve kalbi iki XPBS ile doldurulmuş ayrı bir behere aktarın.Boruyu batırın. Akış hızını dakikada 700 mililitreye yükseltin ve pompayı çalıştırın. Kalbi 15 dakika solüsyon içinde bırakın, solüsyonu her beş dakikada bir değiştirin.Hazır olduğunda, kalbi 10 dakika boyunca bir su yazın ve akış hızını dakikada 750 mililitreye çıkarın. Hücre giderme işlemine başlamak için, kalbi ılık tuz dengesi deneme solüsyonu içeren behere aktarın. Hızı dakikada 1200 mililitreye yükseltin ve pompayı çalıştırın.Dolaşım için beherin altına bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve kalbi bu çözeltide üç saat bekletin. Dokuyu şartlandırmak ve damarların yırtılmasını önlemek için perfüzyon hızları yavaşça artırılır. Bir saat sonra, pompa hızını dakikada 1500 mililitreye yükseltin.Ek bir saat sonra, pompa hızı dakikada 1800 mililitreye çıkarılır. Kalp şişmeli ve neredeyse iki katına çıkmalıdır. Doku, kulakçıktan tepeye doğru ilerleyerek doğal rengini kaybetmelidir.Her çözelti perfüzyonundan sonra, hücresel kalıntıları, kimyasal kalıntıları gidermek ve hücre lizisine yardımcı olmak için iki aşamalı bir durulama gerçekleştirilir Tuz dengeli geziler ve çözeltiden sonra, dakikada 1900 mililitre su ve ardından her biri 10 dakika boyunca dakikada 1950 mililitrede iki XPBS perfüze edin. Ardından, kalbi oda sıcaklığındaki Triton X 100 tuz dengesi çözeltisine aktarın. Pompa hızını dakikada 2000 mililitreye yükseltin ve bir saat boyunca perfüsyon yapın.Taze çözelti ile yeniden doldurduktan sonra, pompa hızını dakikada 2100 mililitreye yükseltin ve bir buçuk saat daha perfüze edin. Daha sonra, dokuyu daha önce gösterildiği gibi, ancak daha yüksek pompa hızlarında durulayın. Bir sonraki perfüzyon oda sıcaklığında% 4 sodyum deoksi kaplama ile yapılır.Pompa hızını dakikada 2200 mililitreye yükseltin ve üç saat boyunca perfüsyon yapın. Üç saat sonra, durulama adımlarını tekrarlayın, her çözelti için beş ila 10 dakika sonra çözeltileri değiştirin. Son perfüzyondan sonra, kalbi% 0.1 parasetik asit,% 4 etanol çözeltisine aktarın ve aynı pompa hızında dakikada 2200 mililitrede 1.5 saat boyunca perfüze edin, dokuyu 15 dakika boyunca bir XPBS ile perfüze edin, ardından iki beş dakikalık yıkama yapın tip bir su.Solüsyon perfüzyon prosedürünü tamamlamak için bir kez daha tekrarlayın, pompayı kapatın ve kalbi solüsyondan çıkarın. Aorttan bağları kesin. Tüm hortumları çıkarın ve kalbi bir saat boyunca boşaltmak için boş bir behere koyun.Fazla sıvıyı bir saat sonra periyodik olarak çıkarın. Daha fazla boşaltmak için kalbi emici bir ped üzerine koyun. Suyun çoğu çıkarıldıktan sonra, kalbin son ağırlığını kaydedin.Kalp, hücreden arındırma işlemi sırasında başlangıçtaki ağırlığının yaklaşık %20 ila 25'ini kaybedebilir. Bu sürecin sonunda, kalbin beyaz veya yarı saydam görünmesi gerekir, bu da hücresel materyal kaybını gösterir. Daha sonra, ventriküler septum ve sağ ve sol ventriküller ayrılır ve DNA için ayrılır.Kantifikasyon ve histolojik işleme, numuneleri liyofilizasyondan önce en az iki saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurur. Başarılı decellularizasyon, burada doğal ventriküllerle karşılaştırıldığında DNA içeriğindeki önemli azalma ile gösterilmiştir. Bu jel, idrar kesesi matrisi veya UBM ile karşılaştırıldığında hücreden arındırılmış ventriküllerde çok az kalıntı DNA kaldığını gösterir.Bu örnekte, hemat toin ve eozin boyama, nükleer materyalin ventriküllerden tamamen çıkarılmasını göstermektedir. Masson'un boyanması, bu prosedürü denerken kalp kas demetlerinin kaybını ve kollajen ağlarının tutulmasını daha da doğrular. Dokuyu ve koronerleri sık sık görsel olarak incelemek önemlidir.

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, izole edilmiş bir fare kalbinin Langendorff retrograd perfüzyonunu gerçekleştiriyoruz. İşlem sırasında, kalbin kardiyak aktivitesi, çıkan aorta yerleştirilen bir kanül kullanılarak koroner arterler yoluyla bir perfüzyon solüsyonu ile retrograd olarak perfüze edilerek korunur. Model, kalbin kardiyak patofizyolojisini incelemek için kullanılır.

Langendorff Retrograd Kalp Perfüzyonu: İzole Fare Kalbini Perfüze Etmek İçin Ex Vivo Bir Teknik

Bu videoda, kalp nakli için bir domuz modelinden kalbi çıkarmak için adım adım bir protokolü açıklıyoruz.

Domuz Kalbi Eksizyonu: Kalp Nakli için Domuz Kalbini Çıkarmak İçin Bir Protokol

Bu videoda, izole edilmiş bir domuz kalbini oksijenli, besin açısından zengin bir perfüzat çözeltisi ile perfüze ederek korumak için ex situ bir teknik açıklanmaktadır. Teknik, fizyolojik koşullar altında kardiyak performansın kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

Ex Situ Kalp Perfüzyonu: İzole Domuz Kalbi Fonksiyonunu Korumak İçin Bir Teknik

Bu yöntem, decellularization karmaşık bir solid organ ozmotik şok ve perfüzyon en az organ matris bozulma ile iyonik deterjan dayalı basit bir protokol kullanarak sağlar. Gerçek zamanlı akış dinamiği ve hücresel enkaz çıkış izleme ile basınçlı bir kese içinde insan kalpleri bir roman decellularization tekniği oluşmaktadır.

Decellularization ters yönde bir basınçlı bir kese içinde bütün insan kalp

Normothermic ex situ kalp perfüzyon (ESHP), kalp atan, yarı fizyolojik devlet korur. Çalışma modunda gerçekleştirildiğinde, ESHP kalp fonksiyonu ve organ canlılık verici sofistike değerlendirmeler yapmak fırsat sağlar. Burada, miyokardiyal performans değerlendirme sırasında ESHP için bizim yöntemi açıklanmaktadır.

Normothermic Ex Situ kalp perfüzyon çalışma modu: değerlendirme kardiyak fonksiyon ve metabolizma

Burada, yeni kardiyokoruyucu stratejileri araştırmak için sıkı bir şekilde kurulan ve kullanılan ortootopik kalp transplantasyonunun klinik öncesi büyük hayvan (porcine) modelini tarif ediyoruz.

Ortootopik kalp transplantasyonunun klinik öncesi porcine modeli

Antegrad perfüzyon tekniği ile yüksek kaliteli bireysel fare kalp hücrelerini izole etmek için basit bire yöntemi geliştirdik. Bu yöntem Langendorff içermez ve kardiyak fibroblastlar veya progenitörler gibi ventrikül ve atriyal miyositleri veya interstisyel hücreleri izole etmek için yararlıdır.

Farelerden Kardiyomiyosit İzolasyonu için Antegrad Perfüzyon Yöntemi

Domuz heterotopik kalp nakli modelinde terapötiklerin tüm kardiyak allogreftlere verilmesi için normotermik ex vivo sanguinöz perfüzyon sisteminin kullanılması için bir protokol sunuyoruz.

Terapötiklerin Kardiyak Allogrefte Verilmesi için Domuz Heterotopik Kalp Transplantasyonu Protokolü

Protokol, özelleştirilmiş bir perfüzyon biyoreaktöründe flep vaskülatürü boyunca sodyum dodesil sülfat deterjanının perfüzyonu ile vaskülarize domuz fleplerinin cerrahi tedarikini ve ardından desellülarizasyonunu açıklamaktadır.

Özelleştirilmiş Perfüzyon Biyoreaktöründe Domuz Vaskülarize Fleplerinin Tedariği ve Perfüzyon-Desellülarizasyonu

Koroner arter hastalığı taraması, genişletilmiş kriterlerle donör kalplerin tedarikini artırabilir. Ex-situ kalp perfüzyonu sırasında tekrarlanabilir koroner anjiyografi yapmak için bir protokol burada bir domuz modelinde açıklanmıştır.

Bir Domuz Modelinde Ex-situ Kalp Perfüzyonu Sırasında Koroner Anjiyografi

Buradaki protokol, allogreftin ex vivo perfüzyonu kullanılarak dolaşım ölümünden sonra bağışı takiben yüksek kaliteli bir domuz nakli modelini açıklamaktadır.

Dolaşım Ölümü Sonrası Bağışı Takiben Ortotopik Kalp Naklinin Yüksek Sadakatli Domuz Modeli

Öğrenin, retrograd perfüzyon ile domuz kalbinden hücresel bileşenleri hızla uzaklaştırarak kardiyak ekstraselüler matriks iskeleti oluşturmayı. Bu yöntem doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli sunar.

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Daha fazla video keşfet