April 27th, 2013
Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir yöntem Caenorhabditis elegans Tarif edilmektedir. Bir kemotaktik indeksi (CI) tam olarak belli hedeflere solucanlar yanıtı değerlendirmek ve suşları ve ilgi bileşikler arasında karşılaştırma bir platform olarak hizmet için bir yol olarak kullanılmıştır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit ve ucuz bir yöntem kullanarak C. elegans'ın kemotaktik tepkisini ölçmektir. Bu, aşamalı olarak izole edilen solucanları işaretli bir plakanın ortasına yerleştirerek elde edilir. Tüm test ve kontrol bölgelerine eşit uzaklıkta, her bölgeye ilgi çekici bir bileşik veya kontrol bileşiği, her ikisi de solucanların yaklaştıklarında onları durduran bir anestetik ile birleştirilir.
60 dakika sonra, plakanın üzerindeki solucanların son dağılımı sayılır ve solucanların konum oranı, bir deney endeksi sağlamak için kullanılır. Sonunda, deniz şıklığının belirli bileşiklere çekilmesini ölçmek, altta yatan deneysel manipülasyonların davranışsal sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, öncüllerinin birçok faydalı yönünü içerirken, kullanım kolaylığını büyük ölçüde artırmasıdır.
Bu deney, deniz şıklığının davranışı hakkında bilgi sağlar ve nöro-genetik manipülasyonlar ve diğer nörobiyolojik deneylerle birleştirildiğinde özellikle yararlıdır. Beş santimetrelik kimyotaksi agar veya NGM ile yüklenmiş plakalar ile başlayın. Plakaların altını dört eşit dörde bölün.
Test edilen genetik suş ve test edilen her koşul için en az üç plaka hazırlayın. Ardından, orijin çevresinde 0,5 santimetre yarıçapında bir daire işaretleyin. Ardından, zıt dörtlerde, noktaları T ile test veya C ile kontrol olarak işaretleyin, böylece noktaların orijine ve birbirine eşit uzaklıkta olduğundan emin olun.
Bu deney için noktalar orijinin en az iki santimetre uzağında olmalıdır. Senkronize gelişimde beş santimetrelik kimyotaksi plakalarda hazırlanmış genç yetişkin solucanlara sahip olun. Farklı gelişim aşamalarında olan solucanlar analitlere farklı tepki verebilir.
Sonuç olarak, deneyde kullanılan tüm solucanların aynı gelişim aşamasında olması çok önemlidir. Solucanlar OP 50 e coli çimi temizledikten sonra, plakaya iki mililitre S bazal tamponu pipetleyin. Solucanları yıkamak için tüm solucanları tampona almak için plakayı manipüle edin.
Worm süspansiyonundan bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 saniye boyunca santrifüj yapın. 6.600 RPM'de bir pico fuge kullanarak, basil'i aspire edin ve solucanların peletini bozulmadan bırakın. Şimdi bu solucanları aynı yöntemle üç kez daha yıkayın.
S basil tamponunu tüpe ekleyerek ve tüpü ters çevirerek solucanları çözeltiye geri koymaya başlayın. Son yıkamadan sonra, solucanları tekrar 10 saniye boyunca santrifüj yapın ve ardından süpernatantı 100 mikrolitreye kadar son hacme aspire edin. Ardından, yeterli solucan yoğunluğunu sağlamak için pelettekien yıkanmış solucanların iki mikrolitresini NGM plakasına pipetleyin.
En az 50 solucan, ancak 250 solucandan fazla olmamalıdır. Çok fazla solucan varsa, ESP basil çözeltisinin hacmini artırın. Ve çok az solucan varsa, onları aşağı çevirin ve daha düşük bir hacimde yeniden süspanse edin.
Solucan tüpünü bir duman başlığına yerleştirin. Hazırlandıktan sonra, solucanlar kimyotaksik deneyde bir saate kadar kullanılabilir. Önce çözeltileri hazırlayın.
Test çözeltisini test bileşiği ile anestezik 0.5 molar azid eşit hacimlerde karıştırarak karıştırın. Ardından, test bileşiğini seyreltmek için kullanılan solventin 0.5 molar sodyum azid ile bir kontrol çözeltisi karıştırın. Şimdi bir test plakası hazırlayın.
İlk olarak, peletten iki mikrolitre solucan çözeltisini test plakasının orijine pipetleyin. İkincisi, kokuları ekleyin, iki T noktasına iki mikrolitre test çözeltisi ve iki T noktasına iki mikrolitre kontrol çözeltisi pipetleyin. Solucanlar ve koku damlaları agar tarafından emilene kadar kapakları değiştirin, plakaları ters çevirin ve deney süresi için 60 dakika bekletin.
Sodyum. ASI difüzyon süresinin denemeler arasında standartlaştırılması için. Solucanların hemen kokulardan önce eklenmesi önemlidir.
Ayrıca, her plaka tamamen hazırlanmalı ve sonraki plakayı hazırlamadan önce deney başlatılmalıdır. 60 dakikalık denemeden sonra solucanları dört derece Celsius'luk bir buzdolabına yerleştirin. Daha sonra, sayılabileceğinde buzdolabından plakayı çıkarın.
Onları hemen saymamak ve solucanları oda sıcaklığında bırakmak, hareket etmelerine izin verebilir. Tekrar. İçerden çıkmış olan solucanların konumunu verilerden çıkarın. Kemotaksi indeksini hesaplayın.
Değer, maksimum itmeden maksimum çekime kadar negatif bir'den pozitif bir'ye değişecektir. Kontrol çözeltisi hem test hem de kontrol dörtlerinde kullanılarak süreci tekrarlayın. Bu, kontrol plakası olarak hizmet edecektir. Üç.
Her deneysel koşul için bu tür plakalar yapılmalı ve çalıştırılmalıdır. Diacetyl. Bilinen bir C. elegans kemoçekici madde, diyasetil reseptörünü olmayan mutantlara karşı vahşi tip solucanları karşılaştırmak için kullanıldı. Beklentilere göre, diyasetil vahşi tip solucanlardan önemli bir kemoçekici tepki elde etti.
Öte yandan, ODR 10 mutantları diacetyl'e kontrol bileşiği etanol kadar çekilmedi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Bu makale, Caenorhabditis elegans'ın kimotaktik tepkisini nicel olarak değerlendirmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntem açıklamaktadır. Yaklaşım, solucanların çeşitli bileşiklere tepki olarak dağılımını ölçmeyi içerir ve karşılaştırma için bir kimotaktik indeks sağlar.
Quantifying chemotactic responses in model organisms enables early-stage target validation by linking genetic or pharmacological manipulations to measurable behavioral outputs. This assay supports mechanistic de-risking in neuroscience discovery by providing a quantitative, reproducible readout for sensory pathway function. Its simplicity and scalability enhance predictive confidence in target engagement studies prior to lead identification.
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing a functional behavioral readout that informs target credibility.