C. elegans Kemotaksis Deneyi
27 Nisan 2013
Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir yöntem Caenorhabditis elegans Tarif edilmektedir. Bir kemotaktik indeksi (CI) tam olarak belli hedeflere solucanlar yanıtı değerlendirmek ve suşları ve ilgi bileşikler arasında karşılaştırma bir platform olarak hizmet için bir yol olarak kullanılmıştır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit ve ucuz bir yöntem kullanarak C. elegans'ın kemotaktik tepkisini ölçmektir. Bu, aşamalı olarak izole edilen solucanları işaretli bir plakanın ortasına yerleştirerek elde edilir. Tüm test ve kontrol bölgelerine eşit uzaklıkta, her bölgeye ilgi çekici bir bileşik veya kontrol bileşiği, her ikisi de solucanların yaklaştıklarında onları durduran bir anestetik ile birleştirilir.
60 dakika sonra, plakanın üzerindeki solucanların son dağılımı sayılır ve solucanların konum oranı, bir deney endeksi sağlamak için kullanılır. Sonunda, deniz şıklığının belirli bileşiklere çekilmesini ölçmek, altta yatan deneysel manipülasyonların davranışsal sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, öncüllerinin birçok faydalı yönünü içerirken, kullanım kolaylığını büyük ölçüde artırmasıdır.
Bu deney, deniz şıklığının davranışı hakkında bilgi sağlar ve nöro-genetik manipülasyonlar ve diğer nörobiyolojik deneylerle birleştirildiğinde özellikle yararlıdır. Beş santimetrelik kimyotaksi agar veya NGM ile yüklenmiş plakalar ile başlayın. Plakaların altını dört eşit dörde bölün.
Test edilen genetik suş ve test edilen her koşul için en az üç plaka hazırlayın. Ardından, orijin çevresinde 0,5 santimetre yarıçapında bir daire işaretleyin. Ardından, zıt dörtlerde, noktaları T ile test veya C ile kontrol olarak işaretleyin, böylece noktaların orijine ve birbirine eşit uzaklıkta olduğundan emin olun.
Bu deney için noktalar orijinin en az iki santimetre uzağında olmalıdır. Senkronize gelişimde beş santimetrelik kimyotaksi plakalarda hazırlanmış genç yetişkin solucanlara sahip olun. Farklı gelişim aşamalarında olan solucanlar analitlere farklı tepki verebilir.
Sonuç olarak, deneyde kullanılan tüm solucanların aynı gelişim aşamasında olması çok önemlidir. Solucanlar OP 50 e coli çimi temizledikten sonra, plakaya iki mililitre S bazal tamponu pipetleyin. Solucanları yıkamak için tüm solucanları tampona almak için plakayı manipüle edin.
Worm süspansiyonundan bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 10 saniye boyunca santrifüj yapın. 6.600 RPM'de bir pico fuge kullanarak, basil'i aspire edin ve solucanların peletini bozulmadan bırakın. Şimdi bu solucanları aynı yöntemle üç kez daha yıkayın.
S basil tamponunu tüpe ekleyerek ve tüpü ters çevirerek solucanları çözeltiye geri koymaya başlayın. Son yıkamadan sonra, solucanları tekrar 10 saniye boyunca santrifüj yapın ve ardından süpernatantı 100 mikrolitreye kadar son hacme aspire edin. Ardından, yeterli solucan yoğunluğunu sağlamak için pelettekien yıkanmış solucanların iki mikrolitresini NGM plakasına pipetleyin.
En az 50 solucan, ancak 250 solucandan fazla olmamalıdır. Çok fazla solucan varsa, ESP basil çözeltisinin hacmini artırın. Ve çok az solucan varsa, onları aşağı çevirin ve daha düşük bir hacimde yeniden süspanse edin.
Solucan tüpünü bir duman başlığına yerleştirin. Hazırlandıktan sonra, solucanlar kimyotaksik deneyde bir saate kadar kullanılabilir. Önce çözeltileri hazırlayın.
Test çözeltisini test bileşiği ile anestezik 0.5 molar azid eşit hacimlerde karıştırarak karıştırın. Ardından, test bileşiğini seyreltmek için kullanılan solventin 0.5 molar sodyum azid ile bir kontrol çözeltisi karıştırın. Şimdi bir test plakası hazırlayın.
İlk olarak, peletten iki mikrolitre solucan çözeltisini test plakasının orijine pipetleyin. İkincisi, kokuları ekleyin, iki T noktasına iki mikrolitre test çözeltisi ve iki T noktasına iki mikrolitre kontrol çözeltisi pipetleyin. Solucanlar ve koku damlaları agar tarafından emilene kadar kapakları değiştirin, plakaları ters çevirin ve deney süresi için 60 dakika bekletin.
Sodyum. ASI difüzyon süresinin denemeler arasında standartlaştırılması için. Solucanların hemen kokulardan önce eklenmesi önemlidir.
Ayrıca, her plaka tamamen hazırlanmalı ve sonraki plakayı hazırlamadan önce deney başlatılmalıdır. 60 dakikalık denemeden sonra solucanları dört derece Celsius'luk bir buzdolabına yerleştirin. Daha sonra, sayılabileceğinde buzdolabından plakayı çıkarın.
Onları hemen saymamak ve solucanları oda sıcaklığında bırakmak, hareket etmelerine izin verebilir. Tekrar. İçerden çıkmış olan solucanların konumunu verilerden çıkarın. Kemotaksi indeksini hesaplayın.
Değer, maksimum itmeden maksimum çekime kadar negatif bir'den pozitif bir'ye değişecektir. Kontrol çözeltisi hem test hem de kontrol dörtlerinde kullanılarak süreci tekrarlayın. Bu, kontrol plakası olarak hizmet edecektir. Üç.
Her deneysel koşul için bu tür plakalar yapılmalı ve çalıştırılmalıdır. Diacetyl. Bilinen bir C. elegans kemoçekici madde, diyasetil reseptörünü olmayan mutantlara karşı vahşi tip solucanları karşılaştırmak için kullanıldı. Beklentilere göre, diyasetil vahşi tip solucanlardan önemli bir kemoçekici tepki elde etti.
Öte yandan, ODR 10 mutantları diacetyl'e kontrol bileşiği etanol kadar çekilmedi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, basit ve maliyet etkin bir analiz yöntemi kullanarak Caenorhabditis elegans'ın kemotaktik yanıtının kantitatif olarak değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, çeşitli bileşiklere yanıt olarak solucanların dağılımının ölçülmesini içerir ve karşılaştırma için bir kemotaktik indeks sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Biyoloji
- Deneysel Analizler
Arka Plan
- Caenorhabditis elegans, davranışsal yanıtların incelenmesinde kullanılan bir model organizmadır.
- Kemotaksi, nicel olarak değerlendirilebilen kritik bir davranıştır.
- Önceki yöntemler hassasiyet ve kullanım kolaylığı açısından yetersizdi.
- Bu çalışma, kemotaktik yanıtların değerlendirilmesine yönelik mevcut teknikleri geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans'ın çeşitli bileşiklere karşı gösterdiği kemotaktik yanıtı nicelendirmek.
- Farklı suşlar ve bileşikler arasında karşılaştırma yapmak için güvenilir bir kemotaktik indeks oluşturmak.
- Deneysel manipülasyonların davranışsal sonuçlarının değerlendirilmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Test aşamasındaki solucanların izolasyonu.
- Solucanların işaretlenmiş bir plakanın merkezine yerleştirilmesi.
- Test ve kontrol bileşiklerinin, anestezikler ile kombine edilerek eşit mesafelere yerleştirilmesi.
- Kemotaktik indeksi hesaplamak için 60 dakika sonra solucan dağılımının sayılması.
Temel Sonuçlar
- Analiz, solucanların belirli bileşiklere olan ilgisini etkili bir şekilde nicelleştirir.
- Sonuçlar, karşılaştırma için net bir kemotaktik indeks sağlar.
- Yöntem, önceki tekniklere kıyasla kullanım kolaylığı sergilemektedir.
- Solucanların tepkilerinin davranışsal sonuçları, elde edilen sonuçlara dayanarak değerlendirilebilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, C. elegans'deki kemotaktik davranışı değerlendirmek için güvenilir bir yol sunmaktadır.
- Bu yaklaşım, çeşitli deneysel bağlamlarda davranışsal yanıtların anlaşılmasını geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, ek bileşikleri ve koşulları araştırmak için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve İlişki
Model organizmalarda kemotaktik yanıtların nicelleştirilmesi, genetik veya farmakolojik manipülasyonları ölçülebilir davranışsal çıktılarla ilişkilendirerek erken aşama hedef doğrulamasını mümkün kılar. Bu analiz, duyusal yolak fonksiyonu için nicel ve tekrarlanabilir bir çıktı sağlayarak nörobilim keşiflerinde mekanistik risk azaltma sürecini destekler. Basitliği ve ölçeklenebilirliği, öncü bileşik tanımlaması öncesindeki hedef etkileşim çalışmalarında öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gen fonksiyonunu bütünsel organizma bağlamında duyusal davranışla ilişkilendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Kantitatif davranışsal fenotipleme yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Gözlemlenebilir kemotaktik fenotipler temelinde hedeflerin riskini azaltarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik tarama kampanyaları için uygun, standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Dört kadranlı tasarım, örnek boyutunu artırır ve yanlılığı azaltarak güvenilir replikat testlerine olanak tanır.
- İş Akışı Entegrasyonu: Keşif hatlarında verimliliği artıran, gözetimsiz çalışma ve uç nokta puanlamasına imkan verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Genetik bulguları davranışsal çıktılarla ilişkilendirerek hastalığa özgü model doğrulamasını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Doza ve genotipe bağımlı kemotaktik yanıtlar aracılığıyla yolak fonksiyonunu netleştirir.
- Preklinik Uyum: Genetik olarak yönetilebilir bir sistemde, hedef modülasyonundan kaynaklanan davranışsal sonuçların değerlendirilmesine olanak tanır.
İşleme Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef güvenilirliği hakkında bilgi veren fonksiyonel bir davranışsal çıktı sağlayarak, hedef hipotez testinden öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Bileşiklere veya genetik perturbasyonlara verilen davranışsal yanıtları nicelleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Farklı koşullar ve suşlar arasında karşılaştırma yapmaya olanak tanıyan, tekrarlanabilir ve kantitatif kemotaktik indeksler sağlar.
- Analitik: Veri karşılaştırmasını ve istatistiksel değerlendirmeyi kolaylaştıran normalize edilmiş bir kemotaksi indeksi (−1 ile +1 arası) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Nörogenetik manipülasyonları fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek, hedeften davranışa translasyonu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla keşif projesine uyarlanabilen, modüler ve düşük maliyetli bir davranışsal analiz yöntemini temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Davranışsal fenotiplerdeki belirsizliği azaltarak hedef doğrulamasındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş solucan evrelemesi, plaka hazırlama ve körleme puanlama yoluyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel davranışsal verilere dayalı erken devam/durdur kararlarına olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: in vivo ortamda güçlü fenotipik doğrulamaya sahip hedeflerin belirlenmesiyle riskle uyumlu ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Solucan tutma, senkronizasyon ve gelişimsel evreleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Santrifüjler, mikrosantrifüj tüpleri ve inkübatörler dahil olmak üzere standart laboratuvar ekipmanlarına bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için solucan hazırlama ve assay zamanlamasının ekipler arası standartlaştırılması gerekir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, arena tasarımında ve anestezik uyumluluğunda düzenlemeler gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, kontrol altında tutulması gereken solucan yoğunluğuna ve gelişimsel evre değişkenliğine olan hassasiyet yer almaktadır.
