Name: Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Keşfedin hiperdallanmış poligliseroil ile fonksiyonel kırmızı kan hücrelerinin yüzey antijenlerini nasıl koruyabilirsiniz. Akış sitometrisi ile değerlendirilen bu yöntem, kan transfüzyonu uyumluluğunu artırabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Kanada Kan Hizmetleri (CBS) ve Sağlık Bilimleri (CIHR) Araştırma Ortaklığı Fonu Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. Yazarların kendi araştırma tesislerinin kullanımı için Kan araştırma UBC Merkezi&#39;nde LMB Makromolekül Hub ederim. Altyapı tesisi Yenilik Kanada temeli (CFI) ve Sağlık Araştırma Michael Smith Vakfı (MSFHR) tarafından desteklenmektedir. R. Chapanian (CIHR / CBS) doktora sonrası Transfüzyon Bilim burs ve MSFHR araştırma stajyer doktora sonrası dostluk bir alıcı bir alıcı olduğunu. JN Kizhakkedathu MSFHR Kariyer Araştırmacı Scholar Ödülü bir alıcı olduğunu.

A. Hyperbranched poligliserol Modifikasyonu (SS-HPG) <ol><li> Sıra bir tabanı yuvarlak bir şişe içerisinde 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mol) HPG liyofilize edildi ve 90 C&#39;de vakum altında gece boyunca kurutun ° C. </li><li> Oda sıcaklığına soğutmak şişeye, ve susuz piridin (3 ml) içinde kuru HPG çözülür. </li><li> Karboksil grupları ile HPG üzerinde yaklaşık olarak sekiz hidroksil gruplarının fonksiyonalize, HPG çözeltisine dimetilaminopiridin ve katalitik miktarda (piridin içinde 5 mg / ml çözeltisinin bir damla) ekleyin. Bu karışıma, 10 dakika boyunca akıllı 0.5 ml piridin içinde çözülür damla (0.0067 g, 0,0664 mmol) ve süksinik anhidrit ilave edin. Argon altında oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılır. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne soğuk aseton (4 ° C) 40 ml karışım çökelti, ve 15 dakika süreyle 27,000 x g bir Beckman J2-MC santrifüjü kullanılarak santrifüj. Süpernatant süzün ve oda sıcaklığında, argon püskürtülerek kalıntı aseton çıkarın. </li><li> Karboksi etkinleştirmek içinsüksinimidil süksinat (SS) grupları ile l gruplan, susuz DMF içindeki 3 ml karboksil fonksiyonalitesine sahip HPG çözülür. HPG çözelti, N-hidroksisüksinimid (0.0077 g, 0,0664 mol) ve N, N&#39;-diizopropilkarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mol) eklenir ve argon altında oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılır. </li><li> Soğuk aseton yağış tarafından SS-HPG arındırın. </li><li> Argon püskürtülerek kalıntı aseton çıkarın. </li><li> NMR analizi değiştirilmiş - HPG saflık ve proton (1 H) karboksil ve SS işlevsellik derecesini belirler. </li></ol> B. Tam Kan Toplama ve kırmızı kan hücrelerinin ayrılması (eritrositler) <ol><li> Bir sitrat Vacutainer tüpüne sağlıklı insan donörlerden razı tam kan (% 40 Hematokrit, 3 ml) toplayın. </li><li> 4 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de sitrat tüp santrifüjleyin. </li><li> Plazma ve trombosit içeren Süpernatantı ve beyaz kan hücreleri ve platele içeren ara buffy coatPasteur pipeti kullanarak ts. </li><li> 12 ml Falcon santrifüj tüpü içine paketlenmiş eritrositler (% 80 Hematokrit, 1.2 ml) aktarın ve eritrosit yıkamak için PBS tamponu (8 mL, pH = 8.0) ilave edilir. </li><li> Üniform hücre dağılımı elde etmek için ters çevirerek RBCs karıştırın. </li><li> 4 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de Falcon tüp santrifüjleyin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> 5. ve 6. adımları tekrarlayarak PBS iki kez daha sahip eritrositler yıkayın. </li><li> Sıra 1.6 ml Eppendorf tüpüne (100 ul)-alyuvarlar paketlenmiş ve% 20 Hematokrit, eritrositler elde etmek için PBS tamponu (300 ul, pH = 8.0) ilave edilir. </li></ol> C. HPG eritrositler için Aşılama <ol><li> Hemen adımda A6 aseton içinde değiştirilmiş HPG, yer çökelme sonra bir cam şişeye (1 dram) ve PBS tamponu (300 ul, pH = 8.0) içinde çözülür SS-HPG (150 mg). </li><li> % 20 Hematokrit içine SS-HPG polimer solüsyonu eklenir ve 400 ul 0.5 mM ile 3 mm arasında değişir ve SS-HPG konsantrasyonunun bir nihai hacim elde etmek için eritrositler yıkanır. Örneğin, 0.5 mM ile muamele eritrositler hazırlamak için SS-HPG, yıkanmış eritrosit gelen PBS 36 ul kaldırmak ve SS-HPG polimer çözeltisine 36 ul yerleştirin. </li><li> Girdap nazikçe ve süspansiyon 1 saat boyunca oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde Eppendorf tüpleri. </li><li> 4 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de Eppendorf tüpler Santrifüj ve supernatant dışarı Pipeti. </li><li> , RBC yıkama santrifüjden süpernatant kaldırmak PBS 1 ml ekleyin. </li><li> 1 ml serum fizyolojik ekleyin ve iki kat 5. adımda RBCs yıkayın. </li><li> % 20 Hematokrit, bir nihai konsantrasyona kadar paketlenmiş eritrositler 100 ul (% 80 Hematokrit) ile tuzlu su 300 ul ekle. </li></ol> Modifiye RBCs HPG D. Karakterizasyonu I. Kompleman aracılı lizis <ol><li> Sağlıklı insan donörlerden alınan serum BD Vacutainer cam tüp içine tam kanın yaklaşık 8 ml toplamak, ve 30 dakika süreyle oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin kan. </li><li> 10 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de tüp santrifüjleyin ve serum yaklaşık 3 ml toplamak. </li><li> Seru Bir mililitrem ısıyla inaktive serum hazırlamak için 30 dakika için 60 ° C sıcaklıkta bir su banyosuna yerleştirildi. </li><li> 20% Hematokrit HPG modifiye eritrositler veya değiştirilmemiş RBCs 60 ul içeren bir Eppendorf tüp içine taze serum veya ısı inaktive serum 60 ul ekleyin. </li><li> 37, 1 saat boyunca inkübe eritrositler ° C. </li><li> Hücre süspansiyonu hemoglobin miktar yer 96 kuyulu plaka içinde üç kopya olarak değiştirilmiş ya da değiştirilmemiş alyuvarlar hücreleri HPG% 20 hematokrit 5.9 ul ölçmek için. Drabkin reaktifi (spectrophotomerically hemoglobin miktarını ölçmek için kullanılan bir reaktif) 294 ul ekle. Ve dışarı pipetleme Drabkin reaktifi ile hücreleri karıştırın. SPECTRA MAX 190 plaka okuyucu kullanarak 540 nm&#39;de hemoglobin cyanoderivative arasında absorbansları ölçülür. </li><li> Üstte yüzen madde içindeki hemoglobin miktarını ölçmek için, 1 dakika için 13.000 x g santrifüj hücreleri. 96 plaka üç nüsha halinde süpernatant Yeri 50 ul. Drabkin reaktifi 250 ul ekleyin. Drabkin reaktifi ile karıştırın hücrelerive dışarı pipetleme. SPECTRA MAX 190 plaka okuyucu kullanarak 540 nm&#39;de hemoglobin cyanoderivative arasında absorbansları ölçülür. </li><li> Örnek olarak üstte yüzen madde içindeki hemoglobin oranı (adım 7) ve toplam hemoglobin (adım 6) 8, 11, 12 gelen erimiş hücrelerinin miktarını ölçmek. </li></ol> II. MTS kartlarını kullanarak majör ve minör antijenlerinin kamuflaj <ol><li> Sıra 50 bir Eppendorf tüp HPG modifiye RBC (10% Hematokrit), 1 dk için 1.000 xg&#39;de santrifüj ul ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre pelletini MTS seyreltici 110 ul ekleyin ve dışarı pipetleme hücre süspansiyonu homojenize. </li><li> Her mini jel kolon hücre süspansiyonu 11 ul ekleyin. Ilavesi sırasında jel dokunmaktan kaçının. </li><li> Bir santrifüj kartı yuvasına MTS kartları bulun ve 6 dakika boyunca 156 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Yüzey antijenlerinin korunması üretimi esas olarak, mini jel kolon içinde RBC konumu belirlenirr açıklaması. </li></ol> III. Sulu iki faz bölüm ölçümleri <ol><li> Dekstran 500 kDa 13 &#39;e göre (% 5 dekstran 500K,% 4 PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosfat) oluşan / PEG 8 kDa iki faz ayırma sistemi hazırlayın. </li><li> Iki fazlı bir sistem (alt dekstran) elde etmek üzere oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 433 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatlice iki aşamadan ayırın. </li><li> Bir etiketli tüp (konkav dipli) içine üst PEG faz kısım 1.0 ml getirerek yavaşça 20% 20 hematokrit HPG modifiye RBC ul ve karıştırın hücreleri ekleyin. </li><li> Daha düşük bir faz ile 0.5 mL hücre içerir, ve hafifçe vurarak yavaşça sistemi karıştırmak üst faz 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Ayırmak ve sistemindeki hücrelerin in yerini belirlemek için sistem için ~ 2 dk için tezgah üzerinde yerleştirilir. Eritrosit lokalizasyonu (üst faz PEG, alt dekstran faz ya da her ikisi de) ve moleküler değişiklik derecesi ile işlevHPG ağırlığı. </li></ol> IV. Ozmotik frajilite ölçümleri <ol><li> 0 ila 0.9 (w / v)% arasında değişmektedir ve konsantrasyonu NaCl çözeltisi hazırlayın. </li><li> 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine NaCl solüsyonlarının Yeri 0.4 ml. </li><li> NaCl solüsyonlarının içine eritrositler (% 20 hematokrit) 20 ul ekleyin. </li><li> Inversiyon ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de su banyosunda koyun tarafından dikkatle Mix hücreleri. </li><li> Inversiyon tarafından dikkatle hücreleri erteleyin. RBC süspansiyonu 50 ul al ve bir küvet içine yerleştirilmiş 1 ml Drabkin reaktifi, eklemek. Ve dışarı pipetleme Drabkin reaktifi ile hücreleri karıştırın. BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS okuyucusu kullanarak 540 nm&#39;de hemoglobin cyanoderivative arasında absorbansları ölçülür. </li><li> Üstte yüzen madde içindeki hemoglobin miktarını ölçmek için, 1 dakika için 1000 x g hücreler santrifüj. Bir küvet içinde Drabkin reaktifi 1 ml süpernatan 200 ul ekle. Ve dışarı pipetleme Drabkin reaktifi ile hücreleri karıştırın. Hemogl ve absorbansı ölçülürBECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS okuyucusu kullanarak 540 nm&#39;de Tobin cyanoderivative. </li><li> Hücre süspansiyonu (adım 5) içinde hemoglobin toplam miktarı için üstte yüzen madde içindeki hemoglobin miktar oranı (adım 6) farklı NaCI çözeltisi içinde lize hücrelerinin miktarını hesaplar. </li></ol> V. Flow sitometri ölçümleri - Rh-D Korunması (Rh) antijen <ol><li> 5 kontrol ul ve 25 ul toplam hacim ile% 0.5 BSA ile takviye PBS tamponu ile üç kopya halinde HPG değiştirilmiş eritrositler (% 20 hematokrit) ekleyin. </li><li> Bölüm Biodiagnostics (PA, ABD) satın FITC monoklonal anti-Rh D (RHD) 25 ul ekle. </li><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika için karışımın inkübe edin. </li><li> 1.5 ml PBS tamponu ile iki kere yıkayın karışım. Süpernatant kaldırmak için 1 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 ml serum fizyolojik içine RBCs Askıya ve 4 ml akım BD flow sitometri tüpüne süspansiyonu aktarın. </li><li> FACSCanto II flo kullanılarak analizw sitometresinin, RBC kontrol kapısı üzerinde 5000 olayları edinme ve analiz için tüm olayları kullanın. </li></ol> VI. Flow sitometri ölçümleri - CD47 ekspresyonu <ol><li> 1.54 kontrol ul ya da 44 ul toplam hacim ile% 0.5 BSA ile takviye PBS tamponu ile üç kopya halinde HPG değiştirilmiş eritrositler (% 20 hematokrit) ekleyin. </li><li> BD Biosciences (New Jersey, ABD) &#39;den satın fare anti-insan CD47 etiketli phycoerythrin (PE) ve 6 ul ekle. </li><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika için karışımın inkübe edin. </li><li> Iki kere 1.5 ml PBS tamponu ile karışım yıkayın. Süpernatant kaldırmak için 1 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 ml serum fizyolojik içine RBCs Askıya ve hücre topaklanma en aza indirmek için 26 G 5/8 iğne geçer. </li><li> 4 ml akım BD flow sitometri tüpüne süspansiyonu aktarın. </li><li> RBC kumanda ızgarası üzerinde 10.000 olayları edinme, FACSCanto II akış sitometresinin kullanarak analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+consequences+of+linker+chemistry+and+polymer+size+on+stealth+erythrocytes%3A+size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).</li>
<li>Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+antigenic+modulation+of+red+blood+cells+with+methoxypoly%28ethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol.</a> Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).</li>
<li>Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+camouflage+of+antigenic+determinants%3A+Stealth+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).</li>
<li>Daniels, G., Reid, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+groups%3A+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Blood groups: the past 50 years.</a> Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).</li>
<li>Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+cells%3A+Prevention+of+major+histocompatibility+complex+class+II-mediated+T-cell+activation+by+cell+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification.</a> Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).</li>
<li>Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biological+evaluation+of+high+molecular+weight+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).</li>
<li>Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+testing+of+branched+and+linear+polyglycidol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol.</a> Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+circulation%2C+clearance%2C+and+biodistribution+of+polyglycerol+grafted+functional+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polymer+architecture+on+antigens+Camouflage%2C+CD47+protection+and+complement+mediated+lysis+of+surface+grafted+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell+surface+polymer+grafting+in+concentrated+and+nonreactive+aqueous+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+membrane+grafting+of+multi-functional+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+complement+activity+assay+in+microtitration+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolytic complement activity assay in microtitration plates.</a> J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).</li>
<li>Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalter%2C+H+%22Partitioning+in+aqueous+two-phase+systems%3A+theory%2C+methods%2C+uses%2C+and+applications+to+biotechnology%22">Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology</a>. , Academic Press Inc. London. (1985).</li>
<li>Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte-based drug delivery.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).</li>
<li>Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+properties+other+than+charge+involved+in+cell+separation+by+partition+in+polymer%2C+aqueous+2-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems.</a> Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+complement-mediated+elimination+of+red+blood+cells+modified+with+biotin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin.</a> Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Evrensel donör eritrositler kan transfüzyonu tedavisi için artan kan kullanılabilirliği ve güvenliği büyük bir potansiyele sahiptir. Eritrosit aynı zamanda uzun sirkülasyon ve doğal biyolojik uyumluluk, 14, 15 bağlı olarak umut verici bir ilaç verme araçları olarak kabul edilir. Bu yazıda sunulan deneyler modifiye RBCs HPG in vitro özellikleri değerlendirir. In vitro özelliklerine ve HPG modifiye RBCs vivo dolaşımda son 8, 11 bizim grupta incelenmiştir. NaCl ve sodyum fos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Glisidol </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> Trimetilolpropan </td><td> Fluka </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> Potasyum metilat </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> Susuz piridin </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> 4-Dimetilaminopiridin </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> Süksinik anhidrit </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> Aseton </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> Susuz dimetil formamid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> N-hidroksisüksinimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diizopropilkarbodiimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> MTS kartları </td><td></td><td></td><td> Micro Typing System (MTS) kartlar (FL, ABD) </td></tr><tr><td> Dekstran 500 kDa </td><td> Pharmacia Fine Chemicals </td><td></td><td> (İsveç) </td></tr><tr><td> PEG 8 kDa </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td> FITC monoklonal anti-Rh D (Rh) </td><td> Bölüm Biodiagnostics </td><td></td><td> (PA, ABD) </td></tr><tr><td> PE monoklonal anti-CD47 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> (NJ, ABD) </td></tr><tr><td> Drabkin reaktifi </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Kanada) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo. RBC membran ve onların analizi polimerlerin HPG aşılama için kullanılan kimyasallar ve reaktifler. </td></tr></tbody></table>

antijenler kompakt hyperbranched polyglycerols of aşılama membran by fonksiyonel kırmızı kan hücreleri korumalı

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Kırmızı kan hücresi (RBC) transfüzyonu gibi talasemi ve orak hücreli anemi 1-3 gibi akut ve kronik sağlık sorunları bir dizi tedavi için hayati önem taşımaktadır. RBC yüzey (~ 308 bilinen antijen 4), kronik kan transfüzyonu hastalarda eritrosit transfüzyonu, 4, 5, küçük antijen bayan maçı nedeniyle alloantibodies geliştirmek üzerinde çok sayıda antijen varlığı nedeniyle. Polietilen glikol (PEG) ve hyperbranched poligliserol (HPG) gibi hidrofilik polimerler eklenme oksijen, glukoz, ve iyon 3 gibi küçük moleküllerin geçit etkilemeden yüzey antijenleri ile antikorların etkileşimi engelleyen RBC zar üzerinde bir dışlama bir tabaka oluşturur. Şu anda herhangi bir yöntem çünkü RBC yüzey ve D antijenlerinin çok sayıda (göre protein ve karbonhidrat) varlığı tarafından sunulan zor bir meydan okuma parçası olarak evrensel verici kırmızı kan hücrelerinin üretimi için kullanılabilirBu tür yöntemlerin evelopment anlamlı transfüzyon güvenliği artırmak ve dramatik RBCs durumu ve kullanımı artıracaktır. Bu raporda, HPG ve karakterizasyonunu greftleme membran antijen korunan fonksiyonel RBCs geliştirmek için kullanılan deneyler sunulmuştur. HPGS son derece kompakt polimerler 6, 7, biyo-uyumlu, ve lipid membran 8, 9 ve maske RBC yüzey antijenleri 10, 11, çevreleyen hücre glycocalyx içinde bulunması beklenmektedir.

Rh D antijen CD47 ve RBC yüzey proteini Kamuflaj floresan işaretli monoklonal antikorlar kullanılarak akış sitometresi ile ölçüldü, ve bir temsili sonucu, Şekil 1 &#39;de verilmiştir. HPG-aşılı eritrositler durumunda (gri), sinyalin yoğunluğu yüzeyi proteinlerini maskeleme belirtmek hücre yüzeyine bağlanarak antikorlar bir azalma gösteren kontrol eritrositler (kırmızı ve yeşil) ile karşılaştırıldığında (sola doğru kayar tepe noktası) azalmıştır . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Hyperbranched poligliserol (HPG) ile kırmızı kan hücrelerinin hücre zarı modifikasyonu (eritrositler) sunulmuştur. Modifiye RBCs sulu iki faz bölümleme, osmotik frajilitesi ve kompleman aracılı lizis ile karakterize edildi. Yüzey proteinleri ve antijenlerin kamuflaj akım sitometri ve Mikro Yazma Sistemi (MTS) kan fenotipleme kartları kullanılarak değerlendirilmiştir.

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Bu işlemde amaç antijenden korunmuş fonksiyonel kırmızı kan hücrelerinin hazırlanmasıdır. Bu, ilk olarak ikinci adımda HPG polimerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. HPG, süksinil süksinat gruplarının eklenmesiyle işlevselleştirilir.Daha sonra sağlıklı donörlerden alınan tam kan, kırmızı kan hücrelerini ayırmak için salin ile yıkanır. Son adımda, izole edilen kırmızı kan hücreleri işlevselleştirilmiş HPG ile tedavi edilir. Sonuç olarak, modifiye edilmiş hücreler üzerindeki yüzey antijenlerinin işlevselleştirilmiş HPG ile korunması, akış sitometrisi ile test edilir.Tekniğimizin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, HPG konjugasyonlarının normal dolaşımda olan fonksiyonel kırmızı kan hücrelerini vermesidir. Bu tekniğin etkisi kronik kan transfüzyonuna kadar uzanır. HPG modifiye edildiğinden, kırmızı kan hücreleri in vivo olarak antijeniteye ve normal dolaşıma sahiptir.Prosedürü gösteren, bir doktor, bir arkadaş ve sürekli okul, laboratuvarımda bir teknisyen olan Dr.Ian, rıza gösterilen sağlıklı donörlerden tam kan almadan üç gün önce, gece boyunca yuvarlak tabanlı bir şişede kuru liyofilize HPG ve 90 santigrat derecede bir vakum olacak. Ertesi sabah, şişeyi yağ banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve ardından kurutulmuş HPG'yi iki mililitre susuz piridin içinde çözün. Daha sonra, HPG üzerindeki hidroksil gruplarının yaklaşık sekizini karboksil grupları ile işlevsel hale getirmek için HPG çözeltisine katalitik miktarda dimetil amino paridin ekleyin.Sonraki 10 dakika boyunca, 0.5 mililitre içinde çözülmüş Sica hidrit, çözeltiye damla damla ekleyin ve ardından karışımı gece boyunca Argonne altında oda sıcaklığında karıştırın, ertesi gün HPG karışımını 40 mililitre dört santigrat derece çökeltin. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde aseton, dört santigrat derecede 27.000 kez G'de 15 dakika boyunca. Daha sonra supinatı boşaltın ve kalan asetonu çıkarmak için çökeltiyi oda sıcaklığında Argonne ile yıkayın.Karboksil gruplarını Sakson ve Mial süksinat grupları ile aktive etmek. Gruplar, karboksil işlevselleştirilmiş HPG'yi iki mililitre susuz DMF'de çözer. Daha sonra HPG çözeltisine NHS ve Diop profili KARBİMİDİ ekleyin ve karışımı gece boyunca oda sıcaklığında Argonne altında karıştırın.Ertesi sabah, S-S-H-P-G'yi soğuk asetonda çökelterek saflaştırmaya devam edin. Daha sonra, kalan asetonu çıkarmak için argon ile yıkayın. Daha sonra proton NMR analizi ile modifiye HPG'nin saflığını ve karboksil ve süksinil süksinat işlevselleştirme derecesini belirleyin.Bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, S-S-H-P-G'nin saflığı değerlendirilirken sağlıklı donörden kan alın. Santrifüj, donör tam kanını 1000 kez G ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca yapmalıdır. Supinat ve buffy kaplamayı çıkarmak için bir macun pipeti kullanın ve ardından paketlenmiş kırmızı kan hücrelerini 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.Hücrelere PBS ekleyin ve ardından düzgün bir hücre dağılımı elde etmek için ters çevirerek karıştırın. Daha sonra hücreleri PB S3 kez santrifüjleyin ve SUP natantını çıkarın. Her yıkamadan sonra, pakt RBC peletini 1.6 mililitrelik bir eend orph tüpüne aktarın ve modifiye HPG'nin saflığını onayladıktan hemen sonra hacmi 400 mikrolitreye çıkarmak için 300 mikrolitre PBS ekleyin, 150 miligram S-S-H-P-G'yi tek bir Dr.Glass şişesine aktarın.Polimeri tarttıktan sonra, S-S-H-P-G'ye 300 mikrolitre PBS ekleyin ve polimeri çözmek için girdaplayın. Daha sonra S-S-H-P-G polimer solüsyonunu %20 hemid ile yıkanmış kırmızı kan hücrelerine ekleyin. Ardından, süspansiyonu nazikçe girdap haline getirin ve ardından kırmızı kan hücresi HPG karışımını oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.Bir saat sonra, çözeltiyi PBS ve tuzlu su ile dört kez yıkayın ve her seferinde supinatı çıkarın. Daha sonra, paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin son 100 mikrolitrelik palına% 20 hematokrit konsantrasyonuna 300 mikrolitre salin ekleyin. Şimdi sekiz mililitre donör tam kan hücresinin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca pıhtılaşmasına izin verin.Daha sonra hücreleri döndürdükten sonra, serumun yaklaşık üç mililitresini toplayın, serumun bir mililitresini 60 derecelik bir su banyosuna aktarın. Isıyla etkisiz hale getirilmiş serum hazırlamak için. 30 dakika sonra, 60 mikrolitre taze serum ve 60 mikrolitre ısıyla inaktive edilmiş serumu ayrı eph tüplerine ekleyin.Her biri 60 mikrolitre% 20 hematokrit HPG modifiye edilmiş kırmızı kan hücresi içerir. Daha sonra, aynı hacimde modifiye edilmemiş kırmızı kan hücresi içeren tüplere 60 mikrolitre ekleyin ve tüm kırmızı kan örneklerini 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Hücre süspansiyonlarındaki hemoglobin miktarını ölçmek için, önce numunelerin her birinden 5.9 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya üç kopya halinde yerleştirin.Daha sonra her bir numuneyi 294 mikrolitre drab kins reaktifi ile karıştırın ve supinat santrifüjündeki hemoglobin miktarını, hücre numunelerinin geri kalanını ölçmek için 540 nanometrede bir spektrofotometre ile hemoglobin sano türevinin emilimini okuyun ve daha sonra 96 oyuklu bir plakada supinatın her birinin 50 mikrolitresini üç kopya halinde plakalayın. Hücreleri 250 mikrolitre drab kins reaktifi ile karıştırdıktan sonra, bu adım için gösterildiği gibi hemoglobin ano türevinin emilimini ölçün. 50 mikrolitre HPG modifiye RBC'yi bir eend orph tüpünde% 10 hematokrit ile santrifüjleyerek başlayın.S süpernatantını hücre peletine 110 mikrolitre MTS seyrelticide attıktan sonra ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Şimdi bir mini jelin her bir sütununa 11 mikrolitre hücre süspansiyonu yükleyin. Daha sonra MTS kartlarını bir santrifüj kart tutucusuna yerleştirin ve kartları 156 kez G'de altı dakika boyunca döndürün. Yüzey antijenlerinin korunması daha sonra üreticinin açıklamasına göre mini jel kolonlarındaki kırmızı kan hücrelerinin konumundan belirlenebilir.Bu adım için, bir dextran PEG iki fazlı ayırma sistemi kurduktan sonra, iki fazlı sistemi elde etmek için dextran PEG çözeltisini döndürün. Daha sonra, üst PEG fazının bir mililitresini içbükey bir tabana sahip etiketli bir tüpe dikkatlice ayırın. Tüpe 20 mikrolitre %20 ila 30 hemog crypt HPG modifiye RBC ekleyin, hücre süspansiyonunu hafifçe fiske vurarak karıştırın.Daha sonra, alt dekstran yüzünün 0,5 mililitresine üst faz içeren hücrenin 0,5 mililitresini ekleyin ve ardından sistemi daha yumuşak bir fiske ile tekrar karıştırın. Şimdi sistemin iki dakika sonra ayrılmasını sağlamak için tüpü tezgahın üzerine koyun. Kırmızı kan hücreleri, üst PEG fazında, alt dextra fazında veya her iki kırmızı kan hücresinde lokalize olmalıdır.Yüksek seviyelerde HPG ile türetilmiş olup, kırmızı kan hücresi yüzey antijenlerinin akış sitometrik analizi ile korunmasını değerlendirmek için üst PEG fazında yer alır. İlk olarak, her numune için üç bilgi tüpüne 20 mikrolitre salin ekleyin. Daha sonra, tüplere üç kopya halinde kontrol modifiye edilmemiş ve HPG modifiye edilmiş kırmızı kan hücrelerinin her biri beş mikrolitre ekleyin.Daha sonra, her tüpe 25 mikrolitre fit C monoklonal anti reus D ekleyin ve numuneleri bir su banyosunda 37 santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra, numuneleri 1.5 mililitre tuzlu su içinde yıkayın, ikinci yıkamadan sonra her seferinde supinatı iki kez çıkarın, Reese kırmızı kan hücrelerini bir mililitre tuzlu su içinde bükün. Son olarak, yüzey antijenlerinin korunmasını analiz etmek için kırmızı kan hücresi kontrol kapısında en az 5.000 olay elde edin.Bu histogramda, sağlıklı insan donörlerinden alınan değiştirilmemiş kırmızı kan hücreleri üzerindeki yeşil tepe ile temsil edilen Resus e-Antijeninin normal ekspresyonu, kırmızı kan hücreleri HPG'ye aşılandığında gösterilir, Reese'in e-Antijen sinyalinin yoğunluğu, gri tepe ile gösterilen sola doğru ifade kaymasının kanıtladığı gibi azalır. Kırmızı kan hücrelerinin HPG ile modifikasyonu, bu histogramda da gözlenen gri tepenin sola kayması ile gösterildiği gibi, CD 47'nin ekspresyonunu da kamufle eder, bu da yüzey proteinlerinin maskelenmesinin HPG varlığında meydana geldiğini gösterir. Bu prosedürü takiben, HPG değiştirici, kan hücreleri kan transfüzyonunda ve terapötiklerin hücre aracılı verilmesinde uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, antijenisiteyi değiştirmek ve ilaç dağıtımı için temel oluşturmak için polimerlerin kırmızı kan hücrelerine nasıl konjuge edilebileceğini daha iyi anlayacaksınız.

antigens-protected-functional-red-blood-cells-membrane-grafting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde alloantigen özel anerji ikna etmek için basit bir teknik anlatılmaktadır. Tekniği olmayan alloreactive donör hücreleri oluşturmak için klinik olarak uygulanabilir. İnfüzyon bu hücrelerin bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmek ve allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu sonrası toksisite azaltabilir.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Antijen-spesifik T hücrelerinin indüksiyon ve genişleme için yeni bir DC bağımsız bir yöntem açıklanmıştır. HLA-A2-Ig tabanlı yapay Antijen sunan hücreler (aAPC), HLA-A2 verimli farklı antijen özgüllüğü CTL genişletmek için kısıtlı peptitler ile yüklenir. Bu teknoloji tabanlı CTL evlatlık immünoterapi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

Fonksiyon-Spacer-Lipid (FSL) yapıları canlılık kaybı olmadan, canlı hücreler ve virionlar yüzey özelliklerinin değiştirilmesine izin verir. Bu yöntem, sadece basit bir hücre / virion ve spontan ve kararlı bir yüzey dahil oluşur FSL inşa çözüm temas gerektirir.

FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

Kanın polimerik kan kanallarına maruz kalması, klinik komplikasyonlarda rol oynayan yabancı cisim reaksiyonunu başlatır. Burada, bu kanallardan kan perfüzyonunu taklit eden deneysel bir araç olan Chandler Döngü Aparatı açıklanmaktadır. Rekombinant CD47'nin eklenmesi, bu kanallar üzerindeki yabancı cisim reaksiyonunun kanıtlarının azalmasına neden olur.

Kullanımı Ex vivo Chandler Döngü Aparatı Modifiye Polimer Kan Kondüit biyouyumuna De¤erlendirilir

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Burada, hoşgörü Ekiminde teşvik ve içinde in vitro ve in vivo değerlendirmek için bir protokol farklı hücre alt kümeleri alıcıdan gelen süpresif kapasitesi ve donör veya eksojen antijenleri doğru alıcının bağışıklık durumu mevcut.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama

Bu iletişim kuralı kaldırma ve süre onlar pulmoner arter sağ kalp kateterizasyonu sırasında sıkışmış kalır Swan-Ganz kateter balon ipuçlarını bağlı pulmoner arter endotel hücreleri (PAECs) arıtma açıklar için yapışık sönük balon kaldırma hastanın vücut takip.

Swan-Ganz kateter sağ kalp kateterizasyonu sonra balon ipuçlarını endotel hücre hasat

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Sıçanlarda heterotopik karın kalp transplantasyonunun bir modelini açıklayarak, basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşıma yol açan mevcut stratejilerde değişiklik ima ediyoruz. Ayrıca, hayati kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyonu ile yeni bir ret modeli tarif, sıçanlarda daha fazla nakil immünolojik analizler sağlayan.

Sıçanlarda Heterotopik Kalp ve Kardiyak Kas Hücre Nakli için İmmünolojik Model

Keşfedin hiperdallanmış poligliseroil ile fonksiyonel kırmızı kan hücrelerinin yüzey antijenlerini nasıl koruyabilirsiniz. Akış sitometrisi ile değerlendirilen bu yöntem, kan transfüzyonu uyumluluğunu artırabilir.

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Daha fazla video keşfet