Name: T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin, T hücre aktivasyonu sırasında protein dinamiklerini canlı hücre görüntüleme, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi kullanarak nicel olarak incelemeyi. Bu yöntem immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar teknik yardım için Sophia Fried teşekkür ederim. Hibe no.1659/08, 971/08 1503/08 491/10, hiçbir hibe Sağlık ve Bilim Bakanlıkları için İsrail Bilim Vakfı: MBS araştırma destek için aşağıdaki kurumlar teşekkür. 3-4.114 ve 3-6.540, geç Alexander Smidoda ve Emlak aracılığıyla İsrail Kanser Derneği ve Bio-tıp mükemmellik hibe için Taubenblatt Aile Vakfı.

1. T hücre transfeksiyonu <ol><li> Nucleofector Çözüm için sette en &quot;Ek&quot; çözüm karıştırılarak aktive Amaxa Nucleofector çözüm hazırlayın. Etkinleştirilmiş çözelti üç ay boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Kültür ortamı içinde, Jurkat T hücrelerinin çoğalmasını [% 10 fetal dana serumu (FCS),% 1 penisilin-Streptomisin çözeltisi ve 2 RPMI mM L-glutamin]. Optimal olarak, hücreler 1-2 hafta sonra çözülme kullanılmalıdır. Logaritmik büyüme hücre kültürleri kullanılarak yüksek transfeksiyon verimi ve hücre canlılığı açısından önemlidir. Alternatif olarak, küçük değişiklikler yapılarak, bu protokol, birincil T-hücreleri ile birlikte kullanılabilir, daha önce tarif edildiği 8. Bu, birincil T-hücreleri aktivasyonu sürecinin süresi daha uzun Jurkat T hücreleri (~ 30 dakika), bu daha olduğunu vurgulamak gerekir, bir mikroskop aşamasında inkübasyon sistemi, CO2, boyunca nem ve sıcaklığı muhafaza etmek için kullanılması gereken monte etkinleştirme işlemi. </li><li> 5 toplayın15 ml tüp içine transfeksiyon başına × 10 6 günlük fazlı T hücreleri. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Santrifüj sırasında, 6 oyuklu plaka hazırlanması. 37 5 ml kültür ortamı ve önceden inkübe ile her bir transfeksiyon için iyi bir doldurmak ° C </li><li> Santrifüj tüpleri toplamak ve supernatant atın. 1 ml RPMI hücre pelletini. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Santrifüj sırasında transfeksiyon solüsyon hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka iyi birinde, bir floresan etiketli proteini kodlayan ilgi 5 ug plazmid DNA&#39;sı ile adım 1 &#39;de hazırlanan aktive 100 ul Amaxa Nucleofector çözeltisi karıştırın. Optimal olarak, DNA konsantrasyonu transfeksiyon solüsyonu seyreltilmesi önlemek için 1 mg / ml &#39;den daha büyük olmalıdır. </li><li> Nazik pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> Hücrelerin santrifüje edilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak d değil ikenpelet isturbing. </li><li> DNA / transfeksiyon çözüm iki kez pipetle. </li><li> Pelet DNA / transfeksiyon solüsyonu eklenir. </li><li> Amaxa küvete hücre transfer edin. </li><li> Amaxa Nucleofector cihazın içine küvet yerleştirin. </li><li> Elektroporasyon için H-10 Amaxa transfeksiyon ayarı (Jurkat için) ya da T-23 (primer T-hücreleri için). </li><li> Inkübatör 6 plaka çıkarın. </li><li> Elektroporasyon ardından dikkatli bir Pasteur pipeti kullanılarak 6-plaka hücre süspansiyonu ile süpernatantı aktarın. Hücre artıkları oluşan pelet oluşturabilmektedir. Pelet transfer kaçının. </li><li> 37, 24 saat boyunca inkübe hücreleri ° C </li><li> Yeni bir kuyuya her bir hücre süspansiyonu 2.5 ml aktarın. Her kuyuya 2.5 ml sıcak bir kültür ortamı (adım 2&#39;de açıklandığı) ekleyin. </li><li> 72 saat sonra, 400 x g 7 dakika, oda sıcaklığında bir steril tüp ve santrifüj hücreleri aktarmak. Süpernatantı atın ve wi yerineKullanılan plazmit için uygun olan memeli hücre seçimi antibiyotik (, ​​biz, sırasıyla, 1.3 mg / ml, ve / ya da 0.2 mg / ml &#39;lik konsantrasyonlarda, G418 ve / veya Higromisin kullanılan kullanılan antibiyotiklere için uygun bir konsantrasyonda uygulanır) ile desteklenmiş inci kültür ortamı. Yeni bir kuyuda Kültür hücre süspansiyonu. Alternatif olarak hücreler, geçici olarak transfekte edilmiş ve transfeksiyondan 48 saat sonra görüntülenebilir. Geçici olarak transfekte edilmiş hücreleri hazırlamak için, adım 20 ile devam normal adım 8, eş zamanlı olarak her iki plazmid ile ko-transfekte hücreler, ve daha sonra 23 doğrudan adım geçin. Bu senaryoya göre, hücreler hemen kullanılması gerektiğini not edin ve genel olarak floresans yoğunluğunu ve heterojen bir düzeyde olmayabilir. </li><li> Uygun seçimi antibiyotik ile desteklenmiş kültür ortamı ile hücreleri büyütün. Hücreleri Split ve gerektiği gibi antibiyotik-takviye kültür ortamı ile ek. </li><li> 2 hafta sonra, FACS kullanımı (grip ile başarılı transfeksiyon doğrulamakolarak orescence ile aktive olan hücre sıralama) aşağıdaki gibidir: </li><li> 10 6 transfekte edilmiş hücreler, 10 6 sahte transfekte edilmiş hücreler (negatif kontrol) ve stabil bir şekilde floresan etiketli protein ifade etmek için bilinen 10 6 hücre toplayın. Hücrelerinin birden fazla flüoresan protein (adım 27) ile transfekte edilir ise, pozitif kontroller olarak birden fazla tek başına, etiketli hücre hatları kullanın. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. 500 ul FACS tampon maddesi (PBS w / o Ca 2 + ve Mg2 +,% 5 FCS,% 0.05 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri. </li><li> Hücresel floresan doğrulamak için analitik bir FACS kullanın. Negatif ve pozitif kontroller arasında bu için transfekte edilmiş hücrelerin floresans karşılaştır. </li><li> Transfekte hücreler kullanarak ilave olarak, flüoresan etiketli protein, tekrar adımları 3-26 ile hücreleri transfekte etmek için. </li><li> Floresans yüksek seviyeli Hücreler kullanılmalıdır. Arasında Optimal olarak, en azından% 50kültür hücreleri yüksek floresan olmalıdır. Hücre floresan FACS ile hücre sıralama artırılabilir. </li></ol> Her türlü ilave etiketli proteinlerin farklı fluorophores için sigortalı olmalıdır ve farklı bir seçim antibiyotikler için kodlama plazmid üzerinde kodlanmış. Birden fazla plazmid ile transfekte edilmiş hücreler için seçim ortamı tüm uygun antibiyotikler ile takviye edilmelidir. 2. T hücre Yayılma Testi Hazırlık <ol><li> Lab-Tek II Alman coverglass sistemi 4 oda slaytlar kullanın. Yanlışlıkla hazırlanması veya kullanım sırasında bir pipet ile örneğin odaları iç yüzeyi, sıfırdan değil emin olun. </li><li> 50-ml slayt hazırlama çözeltisi hazırlayın: 12 M (37%) HCl 4.6 ml alın, 38.5 ml% 100 etanol ve 6.9 ml iki kat distile su ekleyin. </li><li> 500 ul slayt hazırlık çözüm ile slayt her odası doldurun. </li><li> 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Odası aspires, tamamen kurutulması. </li><li> ° C kadar tamamen kuru 45 1 saat için ortaya çıkarılan slaytlar inkübe edin. </li><li> Iki kez damıtılmış su içinde% 0.1 poli-L-lisin (Sigma-Aldrich) seyreltilerek% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi hazırlayın. </li><li> Her iki mecliste de 500 ul uygulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika için slayt inkübe edin. </li><li> Tamamen kurutma, odaları aspire. </li><li> ° C kadar tamamen kuru 45 az 3 saat inkübe edin. </li><li> Kaplı slaytlar, oda sıcaklığında birkaç ay boyunca kuru saklanabilir. </li><li> Bir aktive edici antikor çözüm hazırlayın. HIT3a (BD Pharmingen # 555337) veya UCHT1 (BD Pharmingen # 555330), oda başına 400 ul PBS içinde 10 ug / ml ya da: bir anti-CD3 antikoru kullanın. Bu çözüm kısa bir süre slayt hazırlama önce hazırlanmalıdır. </li><li> Aktive edici antikor çözeltisi 400 ul her bir göze doldurulabilir. </li><li> Gece boyunca 4 °, tercihen 37 ° C veya daha, önceki 2 saat için slayt inkübe ° C. </li><li> Aktive antikor sol kaldırmaution ve hemen 300 ul PBS ile iki kez odasına yıkayın. Bu noktadan sonra, odaları tampon dolu kalır emin olun. </li><li> 4 ° C de PBS-dolu bir slayt Mağaza Biz 1 hafta içinde hazırlanan slayt odaları kullanmanızı öneririz. </li></ol> 3. T hücre aktivasyonu ve Görüntüleme <ol><li> [1,25 ml HEPES (1 M) ile, 10 mL FCS, 38.75 ml RPMI fenol kırmızısı olmadan] görüntüleme tamponu hazırlayın. Görüntüleme tampon 4 ° C&#39;de süzülerek saklanabilir. </li><li> Zeiss LSM 510 Meta mikroskop etkinleştirin. 37 için mikroskop ısıtılabilir montaj çerçevesi Sıcak ° C &quot;Uzman modu&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Edinme&quot; sekmesine tıklayın ve aşağıdaki sekmeler açın: Lazerler, Mikroskopi, Yapılandırma, Tarama, Zaman Serisi. </li><li> Gerekli lazerler etkinleştirin. AÇSAP ağırlıklı ve mYFP, uyarma için daha sonra &quot;açık&quot; 5 dakika &quot;bekleme&quot; için Argon / 2 lazer, ayarlayın. </li><li> Aynı fluorophores kullanarak önce bu canlı hücre görüntüleme testi gerçekleştirdiyseniz, ortaya çıkan LSM dosyayı açmak, i &quot;yeniden&quot; tıklayıncon ve adım 9 yerden devam. Aksi takdirde adım 6 devam edin. </li><li> Kullanılan floresan proteinlerin uyarma ve emisyon için uygun filtreleri kullanarak kanalları tanımlayın. </li><li> &quot;Tarama kontrol&quot; penceresinde, Z yığını seçeneğini seçin. </li><li> 0.5 mikron; Şu dilim: 3;: dilim sayısı: Aralığı 5 aşağıdaki tarama parametreleri girin. </li><li> Mikroskop yakın 37 bir Accublock Dijital Kuru Banyo (Labnet) ° C hazırlayın. </li><li> 37 ° C&#39;ye ısıtın görüntüleme tampon </li><li> Sıcak görüntüleme tampon 600 ul ile değiştirilmesi, PBS aspire saklanan slayt hazırlayın. </li><li> 37 slayt inkübe ° C Adım 13 kadar, en az 15 dakika için inkübatör slayt tutun. </li><li> 5 toplayın x 10 5 transfekte edilmiş T hücreleri. </li><li> 400 × g 2 dakika hücreleri santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> 1 ml sıcak görüntüleme tampon tekrar süspansiyon hücreleri ve 1.5 ml Eppendorf tüp aktarabilirsiniz. </li><li> T yerleştirinAccublock Dijital Kuru Bath ile ilgili est tüp. </li><li> Inkübatör ısıtılmış slayt alın ve ısıtılmış mikroskop montaj çerçevesi üzerine monte. </li><li> &quot;VIS&quot; simgesine tıklayın. </li><li> Hücre süspansiyonu karıştırın ve 1-2 ul çıkarın. </li><li> Slayt alt üzerinde görüntüleme tampona pipet ucu yerleştirin. Slayt çizilmesini önlemek. </li><li> Amacı en diyafram üzerinde tohum hücreleri. </li><li> Onlar iner gibi hemen görsel floresan hücreleri izlemeye başlar. Iki kanal yüksek floresan görüntüleyen bir hücre seçin. </li><li> Hücre slayt yüzeyine ulaşmadan önce, LSM modunu etkinleştirin. </li><li> Sadece bir uyarma lazer geçiş. Bir DIC kanal sahip olduğunuz bir lazer seçin. </li><li> 1 Zoom ayarlayın. &quot;Hızlı XY&quot; simgesine tıklayın. &quot;Dur&quot; simgesine tıklayın. Kırpma aracını kullanarak, hücre merkezli bir yatırım getirisi seçin. </li><li> 3 Zoom ayarlayın. &quot;Hızlı XY&quot; simgesini tıklatın, sonra el en iyi şekilde hücre görmek için odağı ayarlayın. &quot;Dur&quot; ico tıklayınn. </li><li> Tüm gerekli uyarma lazerler geçiş. </li><li> &quot;StartT&quot; ikonuna tıklayarak kayıt başlayın. Resim yayılma süreci (genellikle 5 dakika) bütünlüğü için hücre. Bittiğinde, &quot;Dur&quot; simgesini tıklatın. </li><li> Dosyayı kaydedin. </li><li> Ek hücreleri elde etmek için, &quot;VIS&quot; simgesini tıklatın. Henüz slayt alt temas gelmedi hücre varsa, adım 23 devam. Zaten yayılma süreci başladı görüntüleme hücreleri kaçının. Aksi halde 32 adıma geçin. </li><li> Gözlemlenen slayt alan hücreler çoğunlukla yoksun ise, hücreler (adım 20 ile devam edin) başka bir kısım ekleyin. Aksi halde 33 adıma geçin. </li><li> Ek hücreler elde etmek için, objektif en açıklık üzerindeki alana hücrelerinden yoksun olduğunu kaydırmak. </li><li> Hücreleri (ve adım 20 ile devam eder) bir başka kısım ekleyin. </li><li> Tüm istenen görüntüleme yaptıktan sonra, kaydedilmiş bir EKK dosyasını açın. </li><li> &quot;Galeri&quot;, &quot;Zaman + Z&quot; ve &quot;alt kümesi&quot; tıklayın. </li><li> Relevan seçint zaman aralığı ve Z yığını. </li><li> Yeni dosyayı kaydedin. </li><li> Tüm görüntüleme dosyalar için adımları 35-38 gerçekleştirin. </li></ol> 4. Görüntüleme Veri Analizi <ol><li> Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanarak LSM dosyaları açın. </li><li> &quot;Aşan&quot; tıklayın. &quot;Görüntü İşleme&quot; menüsüne tıklayın ve &quot;Zaman ve Z Swap&quot; seçin. Bu, görüntünün doğru kırpma yardımcı olacaktır. </li><li> &quot;Düzenle&quot; araç çubuğu tıklayın ve açılan menüde &quot;Kes 3D&quot; seçeneğini seçin. Hücre çevresindeki sadece alanı bulunmaktadır görüntü kırpın. Biz hücre merkezli bir 300 × 300 piksel kare kırpma öneririz. Hücresinin şekli ve yeri zamanla değişebilir unutmayın. T ekseni Gözlem, hücre her zaman noktalarında kırpılmış bölge içinde olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Görüntü İşleme&quot; menüsüne tıklayın ve resmin orijinal zamansal ayrılık geri yüklemek için &quot;Zaman ve Z Swap&quot; seçin. </li><li> Ana araç çubuğunda &quot;COLOC&quot; düğmesine basın. &quot;De Zaman Yapı seçins. COLOC &quot;. Imaris otomatik olarak her zaman noktasında her kanal için yoğunluk eşik hesaplar. </li><li> &quot;Kanal İstatistik&quot; seçerek ko analiz sonuçlarını görüntülemek. &quot;İhracat&quot; tıklayarak veri verir. </li><li> Her görüntülü hücre için 6 Adım 1 tekrarlayın. Biz en az 50 hücre bu şekilde analiz edilmesi önerilir. </li><li> Ortalama Pearson ko katsayısı ve standart hata veya sapma hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+and+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li>
<li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+tumour+antigens%3A+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li>
<li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li>
<li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosines+113%2C+128%2C+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li>
<li>Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li>
<li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li>
<li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir çıkar çatışması var.

Çoklu hücresel süreçlerin düzenlenmesi ve fonksiyonu protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır. Mikroskobik görüntüleme canlı hücrelerde floresan etiketli proteinlerin gerçek zamanlı izleme sağlar. Işaretlenmiş olan proteinlerin ko proteinler arasında doğrudan veya dolaylı olarak etkileşime önerebilir ve bu immüno-çökeltme gibi biyokimyasal yöntemler ile elde edilen bulguların güçlendirmek için kullanılabilir. Biyokimyasal yöntemler farklı olarak, canlı hücre görüntüleme bu arası protein etkileşimler...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reaktif/Malzeme</td></tr><tr><td>Amaxa insan T Hücresi nükleofektör kiti</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 klonu) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tüpleri</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>Alman kapak camı sistemi 4 odacıklı slaytlar </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hipomisin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td> <td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr> içinde %0,1 (a/h) <tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>Accublock dijital kuru banyo</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>Santrifüj 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Isıtılabilir montaj çerçevesi - Isıtma Ek Parçası P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (ısıtılabilir montaj çerçevesi için gereklidir)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon cihazı</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Floresanla aktive edilmiş hücre sıralayıcı</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

t hücre gerçek zamanlı canlı görüntüleme kompleks oluşum sinyal

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Bulaşıcı hastalıklara karşı koruma bağışıklık sistemi 1,2 aracılık eder. T lenfositleri birden fazla bağışıklık hücrelerinin 3,4 aktivasyonu ve yanıtları düzenleyen, bağışıklık sisteminin ana koordinatör vardır. T-hücresi aktivasyonu antijen sunan hücreler (APC) tarafından gösterilen spesifik antijen tanınması bağlıdır. T-hücresi antijen reseptörü (TCR), her T-hücresi klonu özgüdür ve antijen özgüllüğü 5 belirler. Antijene TCR bağlayıcı TCR kompleksinin bileşenlerinin fosforilasyonu neden olur. T-hücresi aktivasyonunu teşvik etmek için, bu sinyali gibi TCR proteinlerin sinyal alımı gibi çeşitli önemli tepkiler başlatarak, zardan sitoplazma ve çekirdeğe transduse olmalıdır, APC Alanı (bağışıklık sinaps), molekül aktivasyonu, sitoskeletal düzenlenmesi, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ve gen ekspresyonu 6,7 değişiklikler. Doğruaktive sinyallerin itiation ve sonlandırılması uygun T hücre yanıtları için çok önemlidir. Sinyal proteinlerinin aktivitesi protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır, bu tür protein fosforilasyonu, protein kompleksleri, ve protein ubiquitylation çeşitli hücresel sitelerinin 8 proteinlerin işe oluşumu gibi translasyon sonrası modifikasyonlar. T-hücre aktivasyonu sürecinin iç işleyişini anlamak immünolojik araştırma ve klinik uygulamaları için çok önemlidir. Çeşitli testler protein-protein etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir, ancak bu yaygın olarak kullanılan ortak immunoprecipitation yöntemi olarak biyokimyasal testleri, böylece hücresel dinamikleri içine değerli bilgiler gözlem engelleyen, protein konumu ayırt izin yok mekanizmaları. Ayrıca, bu toplu testlerin genellikle t farklı aşamalarında olabilir birçok farklı hücrelerden protein birleştirmeko hücresel süreci incelenmiştir. Bu zamansal çözünürlüğe üzerinde zararlı etkisi olabilir. Canlı hücrelerin gerçek zamanlı görüntülemenin kullanımı dolayısıyla sürecin 9,10 dinamikleri üzerinde ışık tutan, proteinlerin mekansal izleme ve geçici olarak sinyal olayları birbirinden ayırt etmek yeteneği hem de sağlar. Biz T-hücre aktivasyonu sırasında sinyal-kompleks oluşumunun gerçek zamanlı görüntüleme bir yöntem mevcut. Primer T-hücreleri veya bu gibi Jurkat T-hücre, fizyolojik olmayan bir oligomerizasyon 11 önlenmesi, monomer cinsi floresan proteinleri ile kaynaşmış ilgi proteinleri için kodlayan plazmid ile transfekte edilir. • Canlı hücreler, spesifik antijen için aktive ihtiyacının üstesinden gelinir ise T-hücresi aktivasyonunu uyaran, CD3/TCR kompleksine bağlanan T-hücresi aktive edici antikor 8,9, bir lamel ile önceden kaplanmış üzerinde bırakılır. Aktif hücreleri sürekli konfokal mikroskopi kullanımı ile görüntülü. Görüntüleme veriler, col gibi kantitatif sonuçlar, verim için analiz edilirsinyal proteinlerinin ocalization katsayısı.

Biz canlı T-hücre görüntüleme ve analiz bir örnek sunuyoruz. Görüntüleme deney öncesinde, SLP76 eksikliği T hücreleri (J14) floresan protein (Şekil 1) ifadesinin saptanması için FACS kullanımı ile analiz edilmiştir. Etiketli sinyal proteinleri AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte T hücreleri aktive slaytlar üzerinde biriken ve T-hücre yayılan (Şekil 2) sırasında görüntülendi. Toplanan görüntüleri aktivasyon ve (Şekil 3) yayılan boyunca protein yerelleştirme ...

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, birincil insan T hücreleri ile desteklenen lipid çift katmanları (SLB) arasındaki immün sinaps oluşumunu incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. T hücresi yüzey proteinleri, bir immün sinaps oluşturmak için SLB üzerinde hareketsiz hale getirilen ilgili ligandlarla etkileşime girer, ardından litik granüllerin sinapsa doğru hareketi izler, bu da floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Bu video, T lenfositleri ile floresan antijenleri taşıyan epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri araştıran immünolojik sinaps topolojisinin canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, endotel hücrelerinde kırmızı sitoplazma yer değiştirmesini ve sarı zar halkalarını ortaya çıkarır ve bu da immünolojik sinapsların oluşumunu gösterir.

Canlı Hücre Görüntüleme ile İmmünolojik Sinaps Topolojisinin Değerlendirilmesi

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Burada, floresan mikroskobu kullanarak birincil murin ve insan T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları olarak bilinen ilk yerel Ca 2+ sinyallerini çözmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, bağışıklık hücreleri içindeki Ca2+ sinyal yolaklarını inceleyen ve işlevlerini daha da çözen araştırmacılar için değerli bir kaynak görevi görür.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Öğrenin, T hücre aktivasyonu sırasında protein dinamiklerini canlı hücre görüntüleme, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi kullanarak nicel olarak incelemeyi. Bu yöntem immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Daha fazla video keşfet