Name: Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Öğrenin fare kortikal astrosit izolasyonu ve kültürü için hızlı bir yöntem. P1-P4 yavru farelerden saf astrosit kültürleri elde ederek sinirbilim araştırmalarında astrosit biyolojisini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SS, KB ve Avrupa Komisyonu FP7 Hibe PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX için Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF 01 EO 0803), ve / Alman Araştırma Vakfı Hibe scha 1442 için Fazit Vakfı Lisansüstü bursu tarafından desteklenir CS 3-1 yazarlar çakışan mali çıkarları var.

1. Karışık Kortikal Hücre İzolasyonu ve Kaplama Astrosit kültürleri için Karma kortikal hücre izolasyonu P4 fare yavruları P1 kullanılarak yapılabilir. Uygun astrosit yoğunluğu elde etmek için, her iki T75 doku kültürü şişesi başına 4 fare korteksi pup kullanmak gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki protokol miktarlar 4 fare yavru kullanarak bir hücre hazırlama için hesaplanmıştır. <ol><li> Diseksiyon işlemine başlamadan önce, kültür ortamı astrosit prewarm 30 ml (DMEM, yüksek glikoz +% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu +% 1 penisilin / streptomisin; tabloya bakınız) 37 ° C&#39;ye kadar 37, 1 saat boyunca hücre kültür dereceli su içinde 50 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ° CO2 kuluçka makinesi içinde C, poli-D-lizin (PDL) 20 ml T75 ile kaplayın bir flask. </li><li> Diseksiyon işlemi için gerekli tüm reaktifleri ve malzemeleri hazırlamak. İhtiyacınız olanlar: cerrahi makas, düz ince forseps, düz meme forseps, kağıt havlu, çöp torbası,% 70 etanol birbuz üzerinde d 2 diseksiyon yemekleri (3.5 cm çapında) 2 ml HBSS her ile doldurulur. </li><li> Hafifçe tutun ve% 70 etanol ile yavru fare baş ve boyun püskürtün. Hayvan makas kullanarak hayvanlar feda edilir. </li><li> Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca anterior posterior orta hat kesi, gerçekleştirin. </li><li> Boyun burun dikkatli kafatası kesin. İki ek kesikler beyne daha fazla erişim sağlamak için yapılır: İlk kesik olfaktor, kafatası tabanından kafatası kesmek için serebellumun alt diğeri anterior yapılır. </li><li> Düz uç forseps kullanılarak, kafatası kanatlar hafifçe yana doğru çevrilmiş ve beyin HBSS ile dolu birinci kesme çanak içine alınır ve yerleştirilir. Buz üzerinde yemeğin geri yerleştirin ve tüm 4 beyinleri hasat devam ediyor. </li><li> Disseksiyon Prosedürün geri kalan bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Birincisi, olfaktor ve beyincik ince kullanarak kaldırılırdiseksiyon forseps (Şekil 1B). </li><li> , Korteksleri almak ince forseps ile beyin arka ucunu yakalamak için, hemisfer arasında orta hattan bir kesik gerçekleştirmek oluşturulan koru ile forseps ikinci bir dizi eklemek ve soyma uzağa dan korteksin plaka benzeri bir yapıya beyin. </li><li> Dikkatlice ince forseps (Şekil 1D &#39;) ile çekerek korteks hemisferden meninksler teşrih. Bu adım, meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültürünün kirletmeyecek. HBSS ile dolu ikinci yemeğin içine hazırlanmış korteks hemisferlerin aktarın ve buz üzerine geri. Tüm 4 korteksleri buna göre devam edin. </li><li> Son olarak, keskin bıçakları (yaklaşık 4 ila 8 kez) kullanarak küçük parçalar halinde her korteks yarımkürede kesti. </li><li> Steril koşullar altında, transfer korteks bir 50 ml Falcon tüp içine parçalar ve 22.5 ml toplam hacmi ile HBSS ekleyin. </li><li> % 2.5 tripsin, karışımı 2.5 ml ekleyin ve inkübe37 su banyosunda doku ° C&#39;de 30 dakika süre ile. Her 10 dakikada sallayarak arada çevirerek karıştırın. </li><li> Pelet korteks doku parçaları için 300 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle dekantasyon ile süpernatant kaldırmak. Doku pelet kaybetmemek için size mekanik bir pipet kullanarak tutabiliriz. Doku parçaları tek hücreler (20-30 defa) içine ayrılamaz oluncaya kadar bir 10 ml plastik pipet kullanılarak 10 mL astrosit kaplama orta ve şiddetli pipetleme eklenmesi ile tek bir hücre süspansiyonu içine doku ayrışır. Astrosit kaplama orta kullanarak 20 ml ses seviyesini ayarlayın. Bir hematocytometer kullanarak sayarak tek hücre içine kanıtı korteks doku ayrışma olabilir. 4 fare yavru korteks biri hazırlanması 10-15 x10 6 disosiye tek hücre boyun eğmek zorundadır. </li><li> T75 kültür şişelerinde gelen PDL aspire plakası 37 disosiye tek bir hücre süspansiyonu ve inkübe ° CO 2 inkübatör C. </li></ol> 2. Bir Enr Edinmeiched astrosit Kültür <ol><li> Bundan sonra karışık kortikal hücreleri ve tüm 3 gün sonra kaplama orta 2 gün değiştirin. </li><li> Astrositler konfluent ve bindirilirken mikroglia vardır astrosit katmanda maruz oturmak veya zaten astrosit tabakası (Şekil 2) ayrılmış olan 7 ila 8 gün sonra, mikroglia kaldırmak için orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca 180 rpm&#39;de T75 çalkalanır. Süpernatant içeren mikroglia atın veya kültür isteyen ve mikroglia tetkik edersek, aşağı doğru döndürün ve kültür 28,29 için plaka. </li><li> 20 ml taze astrosit besiyeri ekleyin ve oligodendrosit prekürsör hücrelerinin (OPC) kaldırmak için 6 saat boyunca 240 rpm&#39;de şişeyi sallayarak devam. Bazı OPCs tamamen astrosit katmanından terketmez yana, OPC kirlenmesini önlemek amacıyla 1 dakika boyunca elle şiddetle sarsmaya devam ediyor. Süpernatantı atın veya kültür OPCs 29 isterseniz, aşağı ve plaka dönerler. </li><li> Kalan conflue DurulamaPBS ile iki kere nt astrosit tabaka, 37 CO2 kuluçka makinesi içinde 5 ml tripsin-EDTA ile inkübe eklemek ° C&#39;de, PBS aspire Astrositlerde dekolmanı her 5 dakikada kontrol edin ve elinizi (2-3 kez) ve palmiye karşı şişeyi vurarak astrositlerde dekolmanı zorlamak. </li><li> Astrositler kültürü şişesi ayrılmış, sonra, astrosit kültür ortamı, 5 dakika boyunca 180 xg&#39;de sıkma hücreler, 5 ml eklemek süpernatan aspire ve 40 ml taze ortam astrosit kaplama ekleyin. Bir T75 doku kültürü şişesi ilk hücre bölünmesinden sonra 6 1x10 çevresindeki hücreleri boyun eğmek zorundadır. 37 iki T75 kültür şişeleri ve inkübe Levha hücreleri ° CO 2 inkübatör C. Her 2 ila 3 gün orta değiştirin. </li><li> Ilk split astrositler sonra 12-14 gün deneme gerçekleştirmeden önce uygun hücre konsantrasyonu 24-48 saat içinde kaplanır. Bir T75 doku kültürü şişesi ikinci hücre bölünmesinden sonra 1.5-2 çevresindeki x10 6 hücre boyun eğmek zorundadır. </li></ol>

<ol><li>Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+for+astrocytes%3A+redefining+the+functional+architecture+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain.</a> Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).</li>
<li>Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+energy+metabolism%3A+focus+on+astrocyte-neuron+metabolic+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation.</a> Cell Metab. 14, 724-738 (2011).</li>
<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457, 675-677 (2009).</li>
<li>Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell+autonomous+influence+of+MeCP2-deficient+glia+on+neuronal+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology.</a> Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).</li>
<li>Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+astrocytes+induce+developmental+delays+in+dendrite+maturation+and+synaptic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression.</a> BMC Neurosci. 11, 132(2010).</li>
<li>Kaneko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Min, R., Nevian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+signaling+controls+spike+timing-dependent+depression+at+neocortical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses.</a> Nat. Neurosci. , (2012).</li>
<li>Eroglu, C., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synaptic+connectivity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of synaptic connectivity by glia.</a> Nature. 468, 223-231 (2010).</li>
<li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action-potential+modulation+during+axonal+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Action-potential modulation during axonal conduction.</a> Science. 331, 599-601 (2011).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.</li>
<li>Alvarez, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hedgehog+pathway+promotes+blood-brain+barrier+integrity+and+CNS+immune+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence.</a> Science. 334, 1727-1731 (2011).</li>
<li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+of+brain+endothelium+in+vitro+are+enhanced+by+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia.</a> J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).</li>
<li>Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metabolism+dictates+the+polarity+of+astrocyte+control+over+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles.</a> Nature. 456, 745-749 (2008).</li>
<li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+beyond+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).</li>
<li>Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).</li>
<li>Schachtrup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+triggers+astrocyte+scar+formation+by+promoting+the+availability+of+active+TGF-beta+after+vascular+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage.</a> J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).</li>
<li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113, 221-233 (2002).</li>
<li>Dabir, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+glutamate+transport+in+a+mouse+model+of+tau+pathology+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes.</a> J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).</li>
<li>Wisniewski, H. M., Wegiel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relationships+between+astrocytes+and+classical+plaque+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components.</a> Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).</li>
<li>Shin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mutant+huntingtin+in+glial+cells+contributes+to+neuronal+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity.</a> J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).</li>
<li>Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NACP%2Falpha-synuclein-positive+filamentous+inclusions+in+astrocytes+and+oligodendrocytes+of+Parkinson%27s+disease+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains.</a> Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).</li>
<li>Lioy, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+glia+in+the+progression+of+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for glia in the progression of Rett's syndrome.</a> Nature. 475, 497-500 (2011).</li>
<li>Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+and+its+role+in+Alexander+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">GFAP and its role in Alexander disease.</a> Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).</li>
<li>Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+damage+in+the+central+nervous+system%3A+a+multifaceted+role+for+vascular-derived+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta.</a> Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Siao, C. J., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+plasminogen+activator+mediates+microglial+activation+via+its+finger+domain+through+annexin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II.</a> J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
<li>Anthony, T. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+folate+metabolic+enzyme+ALDH1L1+is+restricted+to+the+midline+of+the+early+CNS%2C+suggesting+a+role+in+human+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects.</a> J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).</li>
<li>Skoff, R. P., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+astroblasts+and+oligodendroblasts+in+postnatal+rodent+brain%3A+evidence+for+separate+astrocyte+and+oligodendrocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages.</a> Glia. 4, 165-174 (1991).</li>
<li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+disease%3A+a+neurodevelopmental+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective.</a> Genes Dev. 26, 891-907 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71, 799-811 (2011).</li>
<li>Jungblut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+primary+astroglial+cells+using+the+new+GLAST-specific+monoclonal+antibody+ACSA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1.</a> Glia. 60, 894-907 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada belirtilen yöntem, ilk olarak 1980 de 27 McCarthy ve De Vellis tarafından tarif kemirgen neonatal beyin gelen astrosit kültür hazırlanması dayanmaktadır. Postnatal P1 P4 fare beyin kortikal astrositlerde izolasyonu ve kültür modifiye metodu Burada sunulan, verimleri saf primer astrosit hızlı ve son derece tekrarlanabilir olduğunu. Bu teknik kolaylıkla böyle sıçan veya domuz ve böyle omurilik gibi diğer beyin bölgelerinden gibi diğer türler, gelen astrositler yalıtmak için transfer edilebilir. McCarthy ...

Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) bir çok bol hücre tipi vardır. İnsanda korteksin 1 nöron başına 1,4 astrositler vardır oysa nöronlara astrositlerde oranı, fareler ve sıçanların kortekste 01:03 olduğunu. Astrosit fonksiyonu ilgi son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Astrositlerde bir anahtar işlevi nöronlar 2,3 yapısal ve metabolik destek sağlayarak onların rolüdür. Astrositlerin Yeni keşfedilen rolleri işlevleri geniş bir yelpazesini kapsar. Bu gelişim 4-6 esnasında gelişen aksonlar ve bazı nöroblast göç rehberlik, sinaptik iletim fonksiyonları, nöral devreleri 7-9 ile sinaps gücü ve bilgi işleme, kan-beyin bariyeri roller (BBB) ​​oluşumu 10 ve bütünlük 11-13 içerir serebrovasküler tonu 14 ve düzenlenmesi. Astrositlerde bir diğer önemli özelliği yaralanma onların yanıttır. Patolojik koşullar altında, astrocytes reaktif hale gelir ve daha fazla ara filaman glial fibriler asidik protein (GFAP) ve inhibitör ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri 15,16 ekspresyonunu upregüle. Reaktif astrositler kondroitin sülfat proteoglikan (CSPG) ailesinin astrosit salgılanan ECM proteinleri çoğunlukla oluşan bir glial skar oluşması, sağlıklı doku hasarı sitesi ayırmak, bu önemli faktörler MSS yaralanması 15-17 sonrasında aksonal rejenerasyon inhibe ederler. Astrositler geç embriyogenez ve erken postnatal ömrü boyunca radyal glial (RG) hücrelerden kaynaklanır. Astrosit belirtim oluştu sonra astrosit habercileri son konumlarına göç, onlar terminal farklılaşma süreci başlar nerede. İn vivo olarak, astrositler bunların tipik morfoloji 18,19 ile gösterildiği gibi üç ila dört hafta doğumdan sonra olgun görünmektedir. RG hücre subpopülasyonu subventricular dilimi astrositler (tip B hücreleri) dönüştürmek. Both, RG ve B tipi hücrelerin sırasıyla, geliştirme sırasında ve yetişkin astrosit benzeri nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) olarak işlev. Astrositler, RG ve B tipi hücreler gibi de bu belirteçler sadece özellikle yetişkin astrositler etiketlemek için kullanılamaz belirten astrosit özgü glutamat taşıyıcısı (GLAST), beyin lipid-bağlayıcı protein (BLBP) ve GFAP ifade. Sağlıklı beyin, RG ve böyle kendini yenilemek için kapasite olarak B tipi hücreler sergi kök hücre potansiyeli bölmek değil yetişkin parankimal astrositler, aksine. Astrosit düzensizliği Alzheimer hastalığı 20,21, 22, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı 23, Rett sendromu, 24 ve 25 Alexander hastalığı da dahil olmak üzere, çeşitli patolojiler kapsamına dahil edilmiştir. Ayrıca, astrositler astrosit aktivasyonu ve astrositik glial skar 16,26 yol MSS tüm hakaretlerini tepki. Aşağıdaki beyin tr oluşturan astrositik glial skarauma veya spinal kord yaralanması nöronal rejenerasyon 15 engelleyen ana engel olarak düşünülmektedir. Hücrelerin saflaştırılmış popülasyonları ayırmak ve korumak için güvenilir yöntemler geliştirilmesi sinir sisteminin anlayışımıza önemli olmuştur. McCarthy ve de Vellis tarafından öncülük çalışmaları yenidoğan sıçan doku 27&#39;den astrositlerde neredeyse saf kültürleri hazırlamak için bugüne kadar araştırmacılar sağlar. Much fare kortikal astrositler izole etmek için biraz değiştirilmiş bir formu burada sunulan bu yöntemle, astrosit biyoloji öğrendi olmuştur. Vivo çalışmalar, astrositler yanı sıra klimalı ortamda elde edilen in vitro kültür açıklanan kullanarak tamamlayan, daha astrosit işlevleri içgörüler kazanmak için değerli araçlardır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Çalışma solüsyonu Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Astrosit kültür besiyeri </td></tr><tr><td> DMEM, yüksek glukoz </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 31966-021 </td><td></td></tr><tr><td> Isı inaktive FBS, </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10082-147 </td><td> Nihai konsantrasyon:% 10 </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140-122 </td><td> Nihai konsantrasyon:% 1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Beyin dokusu kazmak için Çözümestion </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14170-088 </td><td></td></tr><tr><td> % 2.5 tripsin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15090-046 </td><td> Nihai konsantrasyon:% 0.25 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Diğer </td></tr><tr><td> % 70 (hacim / hacim) etanol </td><td> Roth </td><td> 9065.2 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-Lizin </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Su </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td><td> hücre kültürü notu </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> hücre kültürü notu </td></tr><tr><td> 0.05% deneyinpsin-EDTA </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 mikron Steril filtre </td><td> Sartorius </td><td> 16555 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 cm petri </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Falcon tüp </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon tüp </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 doku kültürü şişesi </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps, ince </td><td> Dumont </td><td> 2-1032, 2-1033 </td><td> # 3c; # 5 </td></tr><tr><td> Forseps, düz meme </td><td> KLS Martin </td><td> 12-120-11 </td><td></td></tr><tr><td> 13 cm cerrahi makas </td><td> Aesculap </td><td> BC-140-R </td><td></td></tr><tr><td> Stereomikroskopta </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ7.5 </td></tr><tr><td> Stereomikroskopta + Kamera </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ16F; DFC320 </td></tr><tr><td> Mikroskop + Kamera </td><td> Zeiss; Canon </td><td></td><td> Primo Vert; PowerShot A650 IS </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5805000.017 </td><td> Centrifuge5804R </td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKE 4450-1CE </td><td> Maxq 4450 </td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> JULABO </td><td></td><td> SW20; 37 ° C </td></tr></tbody></table>

fare kortikal astrositlerde İzolasyon ve kültür

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrositler memeli beyin içinde bol bir hücre tipi, henüz çok moleküler ve işlevsel özellikleri öğrendik gerekmektedir. Astrosit in vitro hücre kültürü sistemlerinde detaylı olarak bu glial hücrelerin biyolojik fonksiyonları incelemek için kullanılabilir. Bu video protokol fare yavrular karışık kortikal hücrelerin izolasyonu ve kültürü ile saf astrositler edinme gösterir. Yöntem, canlı nöronların ve astrositlerin yokluğunda, oligodendrosit ve mikroglia, kültür içinde merkezi sinir sistemi üç ana glial hücre popülasyonları, ayrılmasına dayanır. Kültürün ilk günlerinde Örnek görüntüleri karışık bir hücre popülasyonunun varlığına göstermek ve astrositler konfluent haline ve mikroglia ve oligodendrosit ayrılmalıdır zaman timepoint göstermektedir. Ayrıca, saflık ve iyi kurulmuş için immünohistokimyasal boyamalar kullanarak kültürlü astrositlerde astrositik morfolojisi göstermek veYeni astrosit belirteçler nitelendirdi. Bu kültür sistemi kolaylıkla astrosit biyolojinin çeşitli yönlerini araştırmak için saf fare astrosit ve astrosit-şartlı ortam elde etmek için de kullanılabilir.

Tam fare beyin (Şekil 1A), serebellum ve olfaktor (Şekil 1B) kaldırılması gerekir izolasyonu üzerine. Korteksleri fare beyin sapı (Şekil 1C) ve bireysel korteks (Şekil 1D &#39;) arasında menenjlerin soyulmuş özenle (Şekil 1E) kaldırılır. Meninksler meningeal arter sistemi ve meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültür kirlenmesine eksik kaldırma sonuçları ortada. Mikst kortikal hücre...

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Bu prosedürün genel amacı, P bir ila P dört fare yavrusundan karışık kortikal hücreleri izole ederek ve kültürleyerek saf astrosit kültürleri elde etmektir. Bu, önce fare yavrularının beyin kortekslerinin toplanması ve meninkslerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, korteksi küçük parçalara ayırmak, korteks parçalarını tripsin ve tasyon ile ayrıştırarak tek hücreler elde etmek ve tek hücreleri poli de lisin kaplı doku kültürü şişeleri üzerine plakalamaktır.Daha sonra, yedi ila sekiz gün sonra, astrositler, mikroglia ve oligodendrositler farklı katmanlar oluşturmuş olacak ve astrositlerin mikroglia ve oligodendrositlerden ayrılması, doku kültürü şişesinin bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalanmasıyla elde edilir. Son adım, kalan astrositlerin iyonizasyonu ve hasadıdır, bunlar daha sonra bir doku kültürü şişesinde yeniden kaplanır. Sonuçta, ilk hücre bölünmesinden 12 ila 14 gün sonra, astrositler deneyler için uygun konsantrasyonda kaplanır ve hücre saflığı, astrosit spesifik belirteçler kullanılarak immünosito kimyası ile incelenebilir.Burada özetlenen yöntem, orijinal olarak McCarthy tarafından tanımlanan ve 1980'de geliştirilen kemirgen yenidoğan beyinlerinden elde e

isolation-and-culture-of-mouse-cortical-astrocytes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, yeni doğmuş farelerden saf bir astrosit preparatı elde etme yöntemini açıklıyoruz.

Astrosit İzolasyonu: Fare Kortikal Astrositlerinin Saf Preparatını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Video, yetişkin bir fare beyninin korteksinden mikroglia'yı izole etmek için bir tekniği göstermektedir. İlk olarak, korteks, mikroglia'yı koruyarak nöronları ve diğer glial hücreleri uzaklaştırmak için segmentasyon ve homojenizasyona uğrar. Bunu takiben, hücre süspansiyonu, anti-miyelin manyetik mikro boncuklara ve bir manyetik alana maruz bırakılır, bu da mikroglia ve miyeloid hücreleri miyelin kalıntılarından ve miyelin içeren hücrelerden etkili bir şekilde ayırır.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

Video, murin astrositlerini diğer beyin hücrelerinden izole etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Kültürleme sırasında, astrosite özgü ortam kullanarak ve astrositik olmayan hücrelerin yapışmasını inhibe ederek, yöntem astrositleri seçici olarak kültüre eder. Bu kültürlenmiş astrositler, ince süreçlerle yıldız morfolojisi sergiler.

Murin astrositlerini izole etmek ve kültürlemek için basit bir teknik

Bu video, bir fare beyninden serebral perisitleri izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. İzole edilen hücreler, perisit proliferasyonunu teşvik etmek için perisite özgü ortamda kültürlenir.

Fare Serebral Perisitlerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. Burada, sonra in vitro iskemi erkek ve kadın yeni doğan yavrular astrosit fonksiyonu altında yatan mekanizmaları araştırmak için cinsiyetli hipokampal astrosit kültürü protokolünün pratik bir yöntem bildiriliyor.

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra<em&gt; In-Vitro</em&gt; İskemi

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Öğrenin fare kortikal astrosit izolasyonu ve kültürü için hızlı bir yöntem. P1-P4 yavru farelerden saf astrosit kültürleri elde ederek sinirbilim araştırmalarında astrosit biyolojisini inceleyin.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Daha fazla video keşfet